原核表達(dá)調(diào)控與色氨酸操縱子

1、原核生物的轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控原核生物的轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控 轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄：在DNA指導(dǎo)的RNA聚合酶催化下，以DNA鏈的一條鏈為模板，按照堿基配對(duì)原則合成RNA鏈的過程。 不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄：在DNA雙鏈分子中，轉(zhuǎn)錄通常只在DNA的一條鏈上進(jìn)行，另一條鏈則不能轉(zhuǎn)錄，但可能對(duì)轉(zhuǎn)錄起調(diào)節(jié)作用，這種轉(zhuǎn)錄方式稱不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄。 轉(zhuǎn)錄單位轉(zhuǎn)錄單位：就是從啟動(dòng)子到終止子的一段DNA序列。第一節(jié)第一節(jié) 轉(zhuǎn)錄概述轉(zhuǎn)錄概述一、基因的編碼鏈和有意義鏈一、基因的編碼鏈和有意義鏈 模板鏈模板鏈：用于轉(zhuǎn)錄RNA的鏈稱為模板鏈，或負(fù)（）鏈，又稱無義鏈。 編碼鏈編碼鏈：與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈稱為編碼鏈，或正（）鏈，又稱有義鏈。二、轉(zhuǎn)錄的基本

2、二、轉(zhuǎn)錄的基本要點(diǎn)要點(diǎn) 底物底物：NTP； 模板模板：反義鏈； 方向方向：53 ； 酶酶：RNA pol ； 產(chǎn)物產(chǎn)物：RNA單鏈轉(zhuǎn)錄和復(fù)制：轉(zhuǎn)錄和復(fù)制：都是遺傳信息的傳遞都是遺傳信息的傳遞三、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)三、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)位點(diǎn)核苷酸為轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)位點(diǎn)核苷酸為1 1。上游序列上游序列upstreamupstream ：轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的前面的序列：轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的前面的序列，用負(fù)數(shù)碼（）表示，用負(fù)數(shù)碼（）表示，起點(diǎn)前一個(gè)核苷酸為起點(diǎn)前一個(gè)核苷酸為1 1。下游序列下游序列downstreamdownstream： 轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的后面的序列轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的后面的序列，用正數(shù)碼（）表示。用正數(shù)碼（）表示。沒有編號(hào)為的堿基

3、。沒有編號(hào)為的堿基。第二節(jié)第二節(jié) 原核生物轉(zhuǎn)錄的過程原核生物轉(zhuǎn)錄的過程 RNA的轉(zhuǎn)錄包括的轉(zhuǎn)錄包括promotion，elongation，termination 三過程；三過程； 從從promoter到到terminator稱為稱為transcriptional unit； 原核生物中的轉(zhuǎn)錄單位多為原核生物中的轉(zhuǎn)錄單位多為 polycistron ； 轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)記為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)記為+1，其上游記為，其上游記為負(fù)值負(fù)值，下游記為，下游記為正值正值。+1 -10 +10upstreamstart pointdownstream一、轉(zhuǎn)錄的起始一、轉(zhuǎn)錄的起始 關(guān)鍵：全酶能以關(guān)鍵：全酶能以很高的親和性很

4、高的親和性結(jié)合在結(jié)合在啟啟動(dòng)子動(dòng)子promoter ； 啟動(dòng)子啟動(dòng)子：RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并起始聚合酶識(shí)別、結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的一段轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列。序列。轉(zhuǎn)錄的起始轉(zhuǎn)錄的起始 核心酶在核心酶在因子幫助下特異性結(jié)合到因子幫助下特異性結(jié)合到DNA上；上； RNA pol與啟動(dòng)子與啟動(dòng)子-35 box 結(jié)合，形成結(jié)合，形成封閉型起封閉型起始復(fù)合物；始復(fù)合物； 酶滑動(dòng)到酶滑動(dòng)到-10 box，轉(zhuǎn)變成為轉(zhuǎn)變成為開放型起始復(fù)合物開放型起始復(fù)合物，啟動(dòng)子活化，雙鏈解開，模板鏈暴露，插入最初啟動(dòng)子活化，雙鏈解開，模板鏈暴露，插入最初的的2個(gè)核苷酸；個(gè)核苷酸； 酶繼續(xù)加上開頭的幾個(gè)酶繼續(xù)加上開頭的幾個(gè)NTP

5、，形成形成三元起始復(fù)合三元起始復(fù)合物物，在，在RNA鏈合成了鏈合成了89個(gè)堿基后，個(gè)堿基后，因子解離，因子解離，轉(zhuǎn)錄開始。轉(zhuǎn)錄開始。 Model of the interaction between E. coil RNA polymerase holoenzyme and a promoterDNAIncorporating the first few Nt二、原核生物轉(zhuǎn)錄的延伸二、原核生物轉(zhuǎn)錄的延伸 RNA pol沿著模板鏈移動(dòng)，沿著模板鏈移動(dòng)，RNA鏈不斷延伸，鏈不斷延伸，并保持并保持三元復(fù)合物三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)；的結(jié)構(gòu)； 轉(zhuǎn)錄泡中的轉(zhuǎn)錄泡中的DNA螺旋前開、后合，螺旋前開、后合，RNA延

6、長(zhǎng)，延長(zhǎng)，不斷脫離不斷脫離DNA； RNA鏈的延伸速度不是恒定的，在模板富含鏈的延伸速度不是恒定的，在模板富含GC的區(qū)域，轉(zhuǎn)錄就會(huì)的區(qū)域，轉(zhuǎn)錄就會(huì)減慢減慢/停頓停頓。 17bp螺旋解開長(zhǎng)度螺旋解開長(zhǎng)度12bpDNA-RNA復(fù)合體長(zhǎng)度復(fù)合體長(zhǎng)度影響影響RNA延伸速度的因素：延伸速度的因素： RNA pol； 暫停信號(hào)暫停信號(hào)：導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄速度突然出現(xiàn)變化的特：導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄速度突然出現(xiàn)變化的特殊序列。殊序列。 GC富集區(qū)富集區(qū)：產(chǎn)物：產(chǎn)物RNA不易釋放；不易釋放； IR：產(chǎn)物形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，妨礙上游的模板恢產(chǎn)物形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，妨礙上游的模板恢復(fù)雙鏈。復(fù)雙鏈。 其他配基：其他配基：ppNpp、NusA蛋白蛋白。

7、NusA protein ： 69 Kd, acid protein RNApol-attaching factor Impel RNApol. pausing in terminator for 1-15 and waiting for Rho factor to stop transcription of RNA After initiation substituting NusA + core E antitermination N protein utilization substance三、三、原核生物原核生物轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄的終止的終止 轉(zhuǎn)錄的終止依賴于RNA產(chǎn)物的特定序列產(chǎn)物的特定序列；

8、 原核和某些真核生物的終止子要求轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA 3端具有發(fā)夾的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)夾的二級(jí)結(jié)構(gòu)，莖部富莖部富有有GC序列序列； 終止子的分類： 根據(jù)終止反應(yīng)是否需要蛋白1、不依賴于、不依賴于因子的終止子（強(qiáng)終止子）因子的終止子（強(qiáng)終止子） 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：RNA具有一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)（富含具有一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)（富含GC）和隨后和隨后polyU片段。片段。 作用機(jī)制作用機(jī)制：RNA pol + 發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)夾結(jié)構(gòu) 轉(zhuǎn)錄暫停轉(zhuǎn)錄暫停 后隨雜合分子不穩(wěn)定的后隨雜合分子不穩(wěn)定的poly(U-dA) RNA容易容易從模板上脫落從模板上脫落RNA-DNA-RNA pol 解聚解聚 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄終止錄終止2、依賴于、依賴于因子的終止

9、子（弱終止子）因子的終止子（弱終止子） 因子因子：55kD，六聚體。能夠利用水解，六聚體。能夠利用水解ATP釋放的能量使釋放的能量使RNA從三元復(fù)合物中釋放出從三元復(fù)合物中釋放出來；來； 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)：仍然具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，但：仍然具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，但GC堿基對(duì)含堿基對(duì)含量較少，下游也缺乏量較少，下游也缺乏polyU結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。 第三節(jié)第三節(jié) 原核生物轉(zhuǎn)錄的調(diào)控原核生物轉(zhuǎn)錄的調(diào)控 基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平；基因表達(dá)的調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平； 轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是最為經(jīng)濟(jì)、靈活，又是最為重要、轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是最為經(jīng)濟(jì)、靈活，又是最為重要、復(fù)雜的調(diào)控；復(fù)雜的調(diào)控； 確定需要轉(zhuǎn)錄基因的起始位點(diǎn)；確定需要

10、轉(zhuǎn)錄基因的起始位點(diǎn)； 精細(xì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的水平；精細(xì)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的水平； cis factor 與與 trans factor 嚴(yán)格又靈活的互作；嚴(yán)格又靈活的互作； 保證保證RNA pol的連續(xù)轉(zhuǎn)錄，準(zhǔn)確終止。的連續(xù)轉(zhuǎn)錄，準(zhǔn)確終止。一、原核轉(zhuǎn)錄調(diào)控的相關(guān)概念一、原核轉(zhuǎn)錄調(diào)控的相關(guān)概念 （一）誘導(dǎo)和阻遏（一）誘導(dǎo)和阻遏： 誘導(dǎo)：誘導(dǎo)：酶的合成取決于特定物質(zhì)（常為酶的合成取決于特定物質(zhì)（常為substrate）的存的存在。如培養(yǎng)基中乳糖的存在在。如培養(yǎng)基中乳糖的存在促進(jìn)促進(jìn)了了E.coli的半乳糖苷酶的的半乳糖苷酶的合成合成； 阻遏：阻遏：當(dāng)培養(yǎng)基中某種物質(zhì)（常為當(dāng)培養(yǎng)基中某種物質(zhì)（常為produc

11、t）含量較高，含量較高，細(xì)胞就關(guān)閉合成這種物質(zhì)的能力。如培養(yǎng)基中細(xì)胞就關(guān)閉合成這種物質(zhì)的能力。如培養(yǎng)基中Trp的存在的存在抑制抑制了了E.coli Trp的的合成合成；（二）調(diào)控的效應(yīng)物（二）調(diào)控的效應(yīng)物v調(diào)節(jié)蛋白 + 小分子物質(zhì) 原核操縱子的誘導(dǎo)/阻遏。這些小分子是基因表達(dá)的調(diào)節(jié)物質(zhì)-效應(yīng)物。 誘導(dǎo)物（inducer）：與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，使其從DNA分子上脫落下來，RNA pol開始轉(zhuǎn)錄。 輔阻遏物（co-repressor）：與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，可以提高調(diào)節(jié)蛋白與操縱基因的親和性，進(jìn)而關(guān)閉結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。（三（三）正調(diào)控和負(fù)調(diào)控正調(diào)控和負(fù)調(diào)控 正調(diào)控：調(diào)節(jié)蛋白與操縱子結(jié)合后促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。 負(fù)調(diào)

12、控：調(diào)節(jié)蛋白與操縱子結(jié)合后抑制轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。 正、負(fù)調(diào)控都存在著誘導(dǎo)和阻遏。二、操縱子理論（二、操縱子理論（operon concept） 定義定義：原核生物基因表達(dá)和調(diào)控的單元。：原核生物基因表達(dá)和調(diào)控的單元。 包括包括： 結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因：編碼控制某一代謝途徑的相關(guān)的酶；：編碼控制某一代謝途徑的相關(guān)的酶； 調(diào)控元件調(diào)控元件：是調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的一段是調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，包序列，包括啟動(dòng)子和操縱基因；括啟動(dòng)子和操縱基因； 調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因：其產(chǎn)物（調(diào)節(jié)蛋白）能夠識(shí)別并結(jié)合操縱基：其產(chǎn)物（調(diào)節(jié)蛋白）能夠識(shí)別并結(jié)合操縱基因，決定結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄與否。因，決定結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄與否。 主要見

13、于原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如主要見于原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如乳糖操縱子、阿拉伯糖乳糖操縱子、阿拉伯糖操縱子、組氨酸操縱子、色氨酸操縱子操縱子、組氨酸操縱子、色氨酸操縱子等等色氨酸操縱子色氨酸操縱子 色氨酸操縱子色氨酸操縱子(Trp operon)是一種重要的操縱子，是聯(lián)合使用或轉(zhuǎn)錄的一組基因，也是用來編碼生成色氨酸的元件之一。色氨酸操縱子是在許多細(xì)菌存在，但首次在大腸桿菌中得到表征。當(dāng)在環(huán)境中存在足量的色氨酸，它將不被使用。 1.大腸桿菌色氨酸操縱子結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，也是研究得最清楚的操縱子，結(jié)構(gòu)基因依次排列為trpEDC2BA，其中trpGD 和trpCF基因融合。 2.枯草桿菌色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)有所不

14、同，7 個(gè)結(jié)構(gòu)基因中的6 個(gè)依次排列為trpEDCFBA，存在于含有12個(gè)結(jié)構(gòu)基因的芳香族氨基酸超操縱子（a ro operon），第7 個(gè)結(jié)構(gòu)基因，trpG存在于葉酸合成操縱子中，該酶參與Trp 和葉酸的合成。有2個(gè)啟動(dòng)子參與調(diào)控，一個(gè)位于aro operon的起始位置，另一個(gè)則位于trpE 上游約200 bp處。RPOLaEDCB A調(diào)節(jié)基因調(diào)節(jié)基因前導(dǎo)區(qū)前導(dǎo)區(qū)弱化子弱化子間隔區(qū)間隔區(qū)結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因間隔區(qū)間隔區(qū)調(diào)節(jié)作用調(diào)節(jié)作用601621560159311961350804Trp的調(diào)控作用途徑的調(diào)控作用途徑 Trp合成途徑較漫長(zhǎng)，消耗大量能量和前體物，受到嚴(yán)格調(diào)控，其中色氨酸操縱子色氨酸

15、操縱子發(fā)揮著關(guān)鍵作用。調(diào)控作用主要有三種方式：阻遏作用、弱化作用以及終產(chǎn)物Trp 對(duì)合成酶的反饋抑制作用。 阻遏作用阻遏作用1.trp操縱子轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控是通過阻遏蛋白實(shí)現(xiàn)的。產(chǎn)生阻遏蛋白的基因是trpR，該基因距trp operon基因簇很遠(yuǎn)。它結(jié)合于trp 操縱基因特異序列，阻止轉(zhuǎn)錄起始。在有高濃度高濃度Trp存在時(shí)，阻遏蛋白- 色氨酸復(fù)合物形成一個(gè)同源二聚體，并且與色氨酸操縱子緊密結(jié)合，因此可以阻止轉(zhuǎn)錄。當(dāng)Trp 水平低水平低時(shí)，阻遏蛋白以一種非活性形式存在，不能結(jié)合DNA。在這樣的條件下，trp操縱子被RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，同時(shí)Trp 生物合成途徑被激活。RPOLaEDCB A高色氨酸時(shí)高

16、色氨酸時(shí) 低色氨酸時(shí)低色氨酸時(shí) AUG前導(dǎo)肽前導(dǎo)肽鄰氨基苯鄰氨基苯甲酸合酶甲酸合酶鄰氨基苯甲鄰氨基苯甲酸磷酸核糖酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移酶吲哚甘油吲哚甘油磷酸合酶磷酸合酶色氨酸合酶色氨酸合酶和和亞基亞基mRNAmRNA 弱化作用弱化作用 trp操縱子轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控是通過弱化作用弱化作用（attenuation）實(shí)現(xiàn)的?？莶輻U菌色氨酸操縱子表達(dá)主要受到色氨酸激活色氨酸激活RNA結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白(Trp -activated RNA - binding p rotein,TRAP）的調(diào)節(jié)。該蛋白與色氨酸結(jié)合被激活后，可與trpE上游轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物結(jié)合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止。當(dāng)色氨酸濃度較低時(shí)，TRAP

17、失活，轉(zhuǎn)錄可以繼續(xù)，結(jié)構(gòu)基因得以表達(dá)。反饋抑制作用反饋抑制作用由于基因表達(dá)必然消耗一定的能源和前體物，相對(duì)于阻遏和弱化作用，反饋抑制作用更為經(jīng)濟(jì)和高效。終產(chǎn)物Trp對(duì)催化分支途徑幾步反應(yīng)的酶具有反饋抑制作用，其50%抑制濃度分別為：鄰氨基苯甲酸合酶，0. 0015 mmolL - 1 ；鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，0. 15 mmolL - 1 ;色氨酸合成酶,7. 7mmolL - 1。對(duì)于普通野生菌株，鄰氨基苯甲酸合酶對(duì)Trp合成起到關(guān)鍵調(diào)控作用，常被稱為瓶頸酶；但對(duì)高產(chǎn)Trp工程菌而言，上述任何一種酶的反饋抑制都會(huì)直接影響Trp產(chǎn)量。The Bacillus subtilis TRAP

18、Protein Can Induce Transcription Termination in the Leader Region of the Tryptophan Biosynthetic (trp) Operon Independent of the trp Attenuator RNA2014In Bacillus subtilis, transcription of the tryptophan biosynthetic operon is regulated by an attenuation mechanism. When intracellular tryptophan lev

19、els are high, the TRAP( trp RNA-binding attenuation protein ) protein binds to the 5 leader region of the nascent trp mRNA and induces transcription termination. In limiting tryptophan, TRAP does not bind and the operon is transcribed. Two competing RNA secondary structures termed the antiterminator

20、 and terminator (attenuator) can form in the leader region RNA. Research BackgroundIn prior attenuation models, the only role of TRAP binding was to alter the RNA secondary structure to allow formation of the attenuator, which has been thought function as an intrinsic transcription terminator.Howeve

21、r,recent studies have shown that the attenuator is not an effective intrinsic terminator.6.From these studies it was not clear whether TRAP functions independently or requires the presence of the attenuator RNA structure.Figure 1. Model of transcription attenuation of the B. subtilis trp operon. Res

22、earch Purposes1. To examine the role of the attenuator RNA in TRAP-mediated transcription termination, to examine whether TRAP functions independently or requires the presence of the attenuator RNA structure.Material and Methods1.Bacterial strains and transformationsE. coli K802 was used as a host f

23、or plasmid construction and propagation. B. subtilis BG2087 (argC4) and BG4233 (argC4 DmtrB) were used as hosts for transformation and integration of gene fusions. BG4233 contains a deletion in mtrB (from codons 762), which encodes TRAP . Main content1.TRAP induces efficient transcription terminatio

24、n within the trp leader region in vivo when the attenuator is mutated.2.TRAP induces efficient transcription termination in vivo within the trp leader region in which the attenuator segment is deleted.3.Mapping the location of TRAP-mediated transcription termination within the mutant trp leader regi

25、ons.4.TRAP does not cause efficient transcription termination within the mutant trp leader regions in vitro.5.NusA and the timing of TRAP binding to the nascent RNA are important in TRAP-mediated transcription termination.Results1.TRAP induces efficient transcription termination within the trp leade

26、r region in vivo when the attenuator is mutated.A. A. Diagram depicting the Diagram depicting the WT and mutantWT and mutant trp trp attenuators with attenuators with altered basesaltered bases in the stem-loop structure or U-stretch. in the stem-loop structure or U-stretch. B. B. Schematic represen

27、tation of the Schematic representation of the transcriptional reporter fusions transcriptional reporter fusions with with lacZ lacZ that were used to examine TRAP-mediated regulation of that were used to examine TRAP-mediated regulation of transcription termination transcription termination in vivoi

28、n vivo. . The results in Table 1 show that TRAP is able to induce transcription termination in the trp leader region despite significant alterations to the stem-loop or to the U-rich tract of the attenuator. But the location where termination occurs in trp leader regions containing altered attenuato

29、rs will be addressed below.2. TRAP induces efficient transcription termination in vivowithin the trp leader region in which the attenuatorsegment is deleted.Figure 3. Diagram depicting deletion mutations in the stem-loop and U-stretch of the trp attenuator. stem-loop of the trpattenuator1081423. Map

30、ping the location of TRAP-mediated transcriptiontermination within the mutant trp leader regions.A (A) Schematic diagram of RNase protection assays (RPA) using 32P-labeled antisense probes and cellular RNA from B. subtilis.(B) RNase protection assays to determine location of transcription terminatio

31、n in trp leader regions containing mutant attenuators in excess tryptophan. Together these results demonstrate that transcripts from the trpE-lacZ fusion containing the U-stretch (US) or the Disrupted stem (DS) mutant attenuator terminate at approximately the same location as transcripts that termin

32、ate at the WT attenuator.4. TRAP does not cause efficient transcription termination within the mutant trp leader regions. (A) Diagram of DNA templates used for in vitro transcription attenuation assays. (B) 6% polyacrylamide-8M urea gel electrophoresis analysis of the products of in vitro transcript

33、ion of the wild type (WT), U-stretch (US), mismatch stem (MM), and disrupted stem (DS) templates in the absence and presence of 0.25 or 0.5 mM TRAP.500 uM NTP Previous studies have shown that NusA stimulates RNAP pausing at positions 107 and 144 within the B. subtilis trp leader region. Pausing at p

34、osition 107 has been suggested to provide time for TRAP to bind the nascent RNA before RNAP progresses beyond the attenuator region. Hence, we tested whether the presence of NusA could enhance TRAP-mediated termination at these mutant attenuators. 5. NusA and the timing of TRAP binding to the nascen

35、t RNA are important in TRAP-mediated transcriptionterminationFigure 6. Effects of reduced NTP levels and of NusA on TRAP-mediated transcription termination in vitro.50 uM NTP Finally, to ensure sufficient time for TRAP to bind the nascent transcript before RNAP progresses beyond the attenuator, we blocked the transcription elongation comp