Survivin基因與NET1蛋白在膀胱癌中的表達(dá)及相互關(guān)系

1、Survivin基因與NET-1蛋白在膀胱癌中的表達(dá)及相互關(guān)系 作者：王平，董德平，陳莉，張劍平，衛(wèi)愛軍，曹斌【摘要】 目的:探討survivin基因和NET-1蛋白在膀胱癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法:采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和免疫組化方法分別檢測27例膀胱癌組織和10例正常膀胱組織survivin基因和NET-1蛋白的表達(dá)，并將結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果:27例膀胱癌組織中survivin基因陽性17例（62.96%），NET-1蛋白陽性21例（77.78%）；10例正常膀胱組織未見survivin基因表達(dá)，NET-1蛋白表達(dá)10.00%（1/10）,二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P&

2、lt;0.01）；survivin基因與NET-1蛋白表達(dá)有相關(guān)性（2=7.09，P<0.01），survivin基因和NET-1蛋白表達(dá)與膀胱癌WHO分級(jí)和TNM分期有關(guān)，與患者年齡和性別無關(guān)。結(jié)論:survivin基因和NET-1蛋白在膀胱癌中過度表達(dá)表明膀胱癌發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖有關(guān)，survivin基因?qū)Π螂装┰缙谠\斷和靶向治療有重要意義。 【關(guān)鍵詞】 膀胱癌；survivin基因；NET-1蛋白;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng);免疫組化Survivin是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡抑制因子，屬于凋亡抑制蛋白（IAP）家族的新成員，主要通過抑制 caspase-3 和caspa

3、se-7的活性而抑制細(xì)胞凋亡過程，NET-1是新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞增殖因子，參與了腫瘤細(xì)胞的增殖。我們采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和免疫組化方法分別檢測2000年1月2005年1月間我院收治膀胱癌患者27例癌組織中survivin mRNA和 NET-1蛋白表達(dá)情況，探討兩者的關(guān)系以及與膀胱癌臨床病理關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 組織來源 膀胱癌27例術(shù)前均未經(jīng)放療和化療，新鮮組織（距癌邊緣2cm）離體后分2份，1份石蠟包埋，1份由液氮轉(zhuǎn)運(yùn)置于-70冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。所有?biāo)本病史資料完整，均經(jīng)臨床、病理確診，其中男19例，女8例，年齡3187歲，平均59歲，均為初次手

4、術(shù)。按WHO病理分級(jí)級(jí)8例，級(jí)12例，級(jí)7例；按TNM分期T1 6例，T2 10例，T3 5例，T4 6例，病理診斷為膀胱移行上皮細(xì)胞癌，且均獲門診隨訪，時(shí)間為6個(gè)月5年。對照組10例膀胱正常組織由南通大學(xué)法醫(yī)教研室提供，均經(jīng)病理證實(shí)。1.1.2 試劑和儀器 Trizol為美國Invitrogen公司產(chǎn)品；RT-PCR試劑盒為荷蘭QIAGEN公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2000購自日本TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶與PCR 10×Buffer購自上海生工生物技術(shù)工程有限公司；PCR儀為美國MJ Research公司產(chǎn)品；凝膠圖像分析系統(tǒng)為上海四新生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品

5、；核酸和蛋白質(zhì)含量測定儀為德國Eppendorf公司產(chǎn)品。1.1.3 引物合成 Survivin的上游引物序列為：5-CAAGGACCACCGCATCTC-3，下游引物為：5-TTCTCCGCAGTTTCCTCAA-3，擴(kuò)增目的基因產(chǎn)物長度為348bp。采用GAPDH為內(nèi)參照。1.2 方法1.2.1 組織總RNA的提取 100mg膀胱癌組織置于玻璃勻漿器中，加入Trizol試劑1ml勻漿后置室溫5min，加入氯仿0.2ml，于4 12000g/min離心15min，取上清，加異丙醇0.5ml 15min后于4、12000g離心15min，取沉淀溶于無RNA酶的去離子水中用于RT-PCR擴(kuò)增，

6、抽提出的RNA經(jīng)凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量，OD260/280鑒定RNA的純度。1.2.2 cDNA合成 在無RNA酶的離心管中加入RNA 2l (含總RNA 2g)，依次加入10×Buffer 2.0l； 5mmol/L dNTPmix 2.0l；Oligo-dT引物1.0l；Omniscript Reverse Transcriptase 1.0l；RNase-free水10.0l； 總體積20l 置于37孵育60min。然后加入20l DEPC水終止反應(yīng)，-20保存?zhèn)溆谩?.2.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 在0.5ml PCR管中，依次加入下列試劑：cDNA 2l，survivin上下游引

7、物（10mol/L）各1l，GAPDH上下游引物（10mol/L）1l，dNTPmix（2mmol/L）1l, 10×PCR Buffer 2.5l, MgCl2(2mmol/L ) 1.5l, TaqDNA聚合酶0.25l，總體積為25l。反應(yīng)在微量離心管中進(jìn)行,將反應(yīng)管置于PCR儀中擴(kuò)增，參數(shù)設(shè)置如下：94預(yù)變性3min，94變性45s，55退火45s，72延伸45s，進(jìn)行35個(gè)周期的循環(huán)反應(yīng), 最后72延伸7min。survivin和GAPDH反應(yīng)條件相同。1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳鑒定和半定量分析 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，并采用凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描

8、，以survivin帶亮度(Ls)、GAPDH帶亮度(L)分別與背景亮度(Lb)的差值之比計(jì)算每例survivin的相對表達(dá)量,即survivin的相對表達(dá)量=(Ls-Lb)/(L- Lb)。1.2.5 NET-1蛋白檢測 NET-1蛋白采用免疫組化法（SP法），染色陽性呈棕黃色或棕褐色顆粒，主要定位于胞質(zhì)或胞膜。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 survivin相對表達(dá)量以±s表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析，計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)，P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 膀胱癌和正常組織survivin基因和NET-1蛋白表達(dá) survivin基因經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為348b

9、p，GAPDH內(nèi)參照為250bp（圖1）。27例膀胱癌組織中survivin基因陽性表達(dá)17例(62.96%)，NET-1蛋白表達(dá)定位于胞質(zhì)(圖2)， 陽性表達(dá)21例（77.78%）；10例正常膀胱組織未見survivin基因表達(dá)、而NET-1蛋白表達(dá)1例（10.00%），兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。2.2 膀胱癌中survivin基因和NET-1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 見表1。2.3 膀胱癌組織中survivin基因表達(dá)與NET-1蛋白表達(dá)的關(guān)系 NET-1蛋白在膀胱癌中表達(dá)21例（77.78%），在NET-1蛋白陽性表達(dá)組中，survivin基因表達(dá)16例（

10、76.19%），NET-1蛋白陰性組中survivin基因表達(dá)1例（16.67%），NET-1蛋白表達(dá)與survivin基因表達(dá)有顯著相關(guān)性（2=7.09，P<0.01）。3 討論1997年耶魯大學(xué)的Ambrosini等用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體1（EPR-1）cDNA在人類基因組文庫中篩選克隆出survivin基因，定位于17q25。研究表明，survivin可表達(dá)于大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，但在終末分化組織中一般不表達(dá)或低表達(dá)2。本文膀胱癌組織和正常膀胱組織中survivin mRNA基因陽性率分別為62.96%和0.00%，說明survivin基因參與了膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展，機(jī)制可能是su

11、rvivin通過抑制細(xì)胞調(diào)亡信號(hào)使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)視而無法清除，延長了腫瘤細(xì)胞生存期，從而有利于膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展。如果利用survivin基因進(jìn)行靶向治療可提高膀胱癌的臨床療效。NET-1是最新報(bào)道的腫瘤相關(guān)分子基因3，定位于1p34.1，NET-1與NET-2、NET-3、NET-4、NET-5、NET-6和NET-7總稱為NET-X，屬于四聚體超家族(TM4SF)的成員之一，NET-1基因可表達(dá)于人類多種細(xì)胞株中，如肝癌、胃腸道癌、宮頸癌腫瘤等組織中，可能傳導(dǎo)細(xì)胞分裂的信號(hào)和（或）引起細(xì)胞異向分化或去分化，與腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。有報(bào)道NET-1基因特異性地存在于人類前列腺組織中，

12、由于正常、良惡性前列腺腫瘤中均可檢測到NET-1基因，所以NET-1基因在前列腺組織中無診斷價(jià)值4， Serru等5用RT-PCR在人類不同的細(xì)胞株中篩選到NET-1基因表達(dá)，如宮頸癌、肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌細(xì)胞株中。本研究通過我們制備的NET-1基因抗體采用免疫組化的方法觀察了NET-1在膀胱癌中定位及表達(dá)，結(jié)果顯示NET-1主要定位于膀胱腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)和胞膜上，其表達(dá)率為77.78%，且隨著病理分級(jí)和臨床分期的增高表達(dá)率有升高的趨勢，說明NET-1作為一種膜蛋白和胞漿蛋白可能傳導(dǎo)細(xì)胞分裂信號(hào)和引起細(xì)胞異向分化，從而上調(diào)膀胱癌惡性進(jìn)展。由于NET-1在膀胱癌中高表達(dá)，提示有可能采用NET-1基

13、因反義序列注入腫瘤內(nèi)抵消NET-1基因的促增殖作用，達(dá)到基因治療的目的。Survivin基因和NET-1蛋白在膀胱癌細(xì)胞中高表達(dá)且兩者隨膀胱癌的惡性程度增加而增大，說明survivin 基因可能通過抑制膀胱癌細(xì)胞的凋亡過程及與NET-1蛋白的增殖協(xié)同作用，對膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，對膀胱癌的早期診斷和臨床靶向治療具有重要作用。【參考文獻(xiàn)】 1 張輝芳，樊綺詩.抗凋亡蛋白生存素與腫瘤的關(guān)系及檢測J.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2003，26（12）797.2 Sakamoto Y, Mafune K, Mon M, et al. Overexpression of MMP-9 correlates with growth of small hepatocellular carcinomaJ. Int Oncol, 2000,17(2)237.3 Xu J，Stolk JA，Zhang X，et a1Identification of differentially expressed genes in hu