木犀草素對(duì)骨肉瘤的抑制效應(yīng)及其機(jī)制研究

1、木犀草素對(duì)骨肉瘤的抑制效應(yīng)及其機(jī)制研究【摘要】目的：研究木犀草素對(duì)骨肉瘤的抑制效應(yīng)及其機(jī)制；方法：以1.25g/L、2.5g/L、5g/L、10g/L的木犀草素溶液對(duì)骨肉瘤MG-63細(xì)胞行劃痕實(shí)驗(yàn)、侵襲實(shí)驗(yàn)、免疫印跡實(shí)驗(yàn)，并觀察經(jīng)不同濃度木犀草素溶液培養(yǎng)后骨肉瘤MG-63細(xì)胞形態(tài)；結(jié)果：木犀草素對(duì)于骨肉瘤MG-63細(xì)胞的生長、增值、運(yùn)動(dòng)遷移能力、穿膜細(xì)胞數(shù)量、IL-6蛋白表達(dá)水平均有一定的抑制作用，并且其抑制作用隨著木犀草素濃度的增加而逐漸增加；結(jié)論：一定濃度的木犀草素對(duì)于骨肉瘤MG-63細(xì)胞具有極強(qiáng)的抑制作用，值得應(yīng)用于臨床骨肉瘤的治療。【關(guān)鍵詞】木犀草素；骨肉瘤；抑制效應(yīng)；機(jī)制the me

2、chanism of inhibitory effect of luteolin on osteosarcomaAbstract Objective: inhibitory effect on human osteosarcoma and its mechanism of luteolin; methods: 1.25g/L、2.5g/L、5g/L、10g/L luteolin solution on osteosarcoma MG-63 cell line scratch test, invasion assay, Western blot, and observe the differen

3、t concentration of mignonette fibroin solution cultured osteosarcoma MG-63 cell morphology; results: luteolin for osteosarcoma MG-63 cell growth, proliferation, movement ability, transmembrane cell number, the expression level of IL-6 protein was inhibited, and the inhibition increased with the incr

4、ease of luteolin concentration increases gradually; conclusion: a certain concentration of luteolin has a strong inhibitory effect on human osteosarcoma MG-63 cells, treatment is applied to clinical osteosarcoma.keyword luteolin; osteosarcoma; inhibitory effect; mechanism骨肉瘤是臨床相對(duì)常見的惡性腫瘤，多發(fā)于少兒或青少年，該病

5、預(yù)后不良，相當(dāng)多的患者因患上該病而死亡1。近幾年來，隨著保肢手術(shù)的不斷發(fā)展以及全新化療藥物的研制成功，骨肉瘤的治療療效有了較大的提高。但是，轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)的骨肉瘤患者預(yù)后依然相當(dāng)差，并且繼發(fā)轉(zhuǎn)移以及耐化療藥物骨肉瘤的出現(xiàn)仍然是相當(dāng)嚴(yán)重的問題2。作為來源于植物的黃酮類物質(zhì)，木犀草素能夠干擾骨肉瘤細(xì)胞新陳代謝的正常進(jìn)行，抑制其生長，誘導(dǎo)其凋亡，對(duì)于骨肉瘤的治療具有較高的應(yīng)用價(jià)值3、4。為研究木犀草素對(duì)骨肉瘤的抑制效應(yīng)及其機(jī)制，為臨床治療骨肉瘤提供依據(jù)，我院于2013年6月2014年5月展開相關(guān)研究，其效果顯著，現(xiàn)作如下總結(jié)報(bào)道。1 材料與方法1.1 材料細(xì)胞系：選擇浙江大學(xué)藥學(xué)院培養(yǎng)的人體骨肉瘤MG

6、-63細(xì)胞系。藥物：木犀草素（Sigma公司產(chǎn)品）試劑：小牛血清（GIBCO公司產(chǎn)品），RPM1640培養(yǎng)基粉劑（GIBCO公司產(chǎn)品），胰蛋白酶（Amersco公司產(chǎn)品），-actin抗體（Sigma公司產(chǎn)品），IL-6（Sigma公司產(chǎn)品），辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（Jackson公司產(chǎn)品）。儀器： 通用臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Sigma公司產(chǎn)品）、倒置相差顯微鏡（OLYMPUS公司產(chǎn)品）、SG403A-HE生物安全柜（Baker公司產(chǎn)品）、CO2培養(yǎng)箱（Forma公司產(chǎn)品）、全自動(dòng)高壓滅菌鍋（ALP產(chǎn)品）、電子分析天平（Sigma公司產(chǎn)品）、紫外-可見光光度計(jì)（Hach公司產(chǎn)品）。1.2 實(shí)驗(yàn)方法細(xì)

7、胞系培養(yǎng)：將骨肉瘤MG-63細(xì)胞系置于37、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，以小牛血清（10%）、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素配置而成的RPM1640培養(yǎng)液貼壁培養(yǎng)。倒置熒光顯微鏡觀察骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長，胰蛋白酶（0.25%）消化傳代，選擇處于生長期的骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.2.2 觀察骨肉瘤MG-63細(xì)胞形態(tài)取6孔培養(yǎng)板，每孔分別滴加骨肉瘤MG-63細(xì)胞懸濁液1mL，然后分別滴加100L濃度為1.25g/L、2.5g/L、5g/L、10g/L的木犀草素溶液以及等量磷酸鹽緩沖液進(jìn)行對(duì)照，于常規(guī)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。24h后使用倒置相差顯微鏡觀察已培養(yǎng)好的腫瘤細(xì)胞樣本，記錄其形態(tài)特點(diǎn)，各濃度培

8、養(yǎng)的樣本均重復(fù)觀察3次，選擇典型結(jié)果進(jìn)行比較分析。1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)取6孔培養(yǎng)板鋪滿骨肉瘤MG-63細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長，于細(xì)胞貼壁長滿時(shí)劃痕，然后分別滴加100L濃度為5g/L、10g/L的木犀草素溶液以及等量磷酸鹽緩沖液進(jìn)行對(duì)照，于常規(guī)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，于0h與24h對(duì)劃痕距離進(jìn)行認(rèn)真觀察并拍照記錄。1.2.4 侵襲實(shí)驗(yàn)5取已培養(yǎng)好的骨肉瘤MG-63細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并將骨肉瘤MG-63細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)目調(diào)整為5×104個(gè)/100L后鋪板。取24孔培養(yǎng)板，于每孔滴加RPM1640培養(yǎng)基，并在侵襲實(shí)驗(yàn)小室上室滴加調(diào)整好的骨肉瘤MG-63細(xì)胞懸液100L，以使每個(gè)上室內(nèi)均含5&#

9、215;104個(gè)骨肉瘤MG-63細(xì)胞，然后于上室滴加1%牛血清白蛋白10L，以確保上室滲透壓。分別滴加濃度為5g/L、10g/L的木犀草素100L，并于37、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)行15h常規(guī)培養(yǎng)。然后將小室取出以乙醇（90%）固定，結(jié)晶紫溶液（0.1%）染色，于×400低倍鏡下觀察觀察拍照，選取4個(gè)視野做細(xì)胞計(jì)數(shù)，算出平均值。侵襲實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。1.2.5 免疫印跡實(shí)驗(yàn)6分別取木犀草素處理前及處理后的骨肉瘤MG-63細(xì)胞1mL，滴加細(xì)胞裂解液300L，行30min冰上裂解，然后哦移入1.5mL離心管中，4下通用臺(tái)式冷凍離心機(jī)12000r/min速度離心5min，然后取出上清液并于-2

10、0下妥善保存。二喹啉甲酸法測定其蛋白濃度，每一個(gè)泳道40g上樣蛋白量，將上樣于80V下行30min聚丙烯酰胺凝膠電泳，于120V下行90min聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳完成后把蛋白移到PVDF膜上，以新配置成含脫脂奶粉（5%）的磷酸鹽吐溫緩沖液搖床行2h封閉，加入1:500的-Acrin抗體及1:500的IL-6抗體，于4反應(yīng)18h后取出PVDF膜，使用磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次，15min/次，取1:3000的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗室溫下封閉1h，以磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌3次，10min/次，然后以化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測，并以X光片對(duì)結(jié)果進(jìn)行記錄。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法以SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

11、分析，計(jì)量資料以±s表示，用t檢驗(yàn)作組間比較，p0.05表示組間差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 骨肉瘤細(xì)胞在形態(tài)上的變化在正常條件下培養(yǎng)的骨肉瘤MG-63細(xì)胞貼壁良好，形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞透亮，輪廓清晰；經(jīng)1.25g/L與2.5g/L木犀草素處理后的骨肉瘤MG-63細(xì)胞與正常條件下培養(yǎng)點(diǎn)細(xì)胞無顯著差異，而經(jīng)5g/L與10g/L木犀草素處理后的骨肉瘤MG-63細(xì)胞貼壁較弱或消失，且細(xì)胞皺縮，生長緩慢，部分破碎，多數(shù)懸浮分散生長。（如圖1所示） 正常培養(yǎng) 5g/L木犀草素培養(yǎng) 10g/L木犀草素培養(yǎng) 圖1 不同培養(yǎng)條件下骨肉瘤細(xì)胞形態(tài)圖2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果培養(yǎng)0h時(shí)，三組骨肉瘤MG-63細(xì)

12、胞未見大量運(yùn)動(dòng)遷移，劃痕區(qū)域覆蓋率均為0%；經(jīng)24h培養(yǎng)后，未使用木犀草素處理的骨肉瘤MG-63細(xì)胞可大量運(yùn)動(dòng)遷移，其劃痕區(qū)域覆蓋率為98.73%；使用 5g/L木犀草素培養(yǎng)的骨肉瘤MG-63細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力有所降低，其劃痕區(qū)域覆蓋率為74.89%；使用10g/L木犀草素培養(yǎng)的骨肉瘤MG-63細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力顯著降低，其劃痕區(qū)域覆蓋率為52.86%。且未使用木犀草素處理、使用 5g/L、10g/L木犀草素培養(yǎng)覆蓋率比較，存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p0.05）。2.3 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果和正常條件下生長的骨肉瘤MG-63細(xì)胞相比較，經(jīng)過5g/L、10g/L木犀草素處理的骨肉瘤MG-63細(xì)胞，其穿膜細(xì)胞數(shù)量分

13、別降低至正常條件下生長細(xì)胞的60.03%、22.47%，正常條件下、使用 5g/L、10g/L木犀草素處理的穿膜細(xì)胞數(shù)量比較，存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p0.05）。2.4 免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果和正常條件下生長的IL-6蛋白表達(dá)水平相比較，經(jīng)過5g/L、10g/L木犀草素處理的骨肉瘤MG-63細(xì)胞，隨著木犀草素濃度的增加IL-6蛋白表達(dá)水平逐漸降低，IL-6蛋白總量也逐漸減少。其具體結(jié)果如圖2。 正常培養(yǎng) 5g/L木犀草素培養(yǎng) 10g/L木犀草素培養(yǎng) 圖2 不同培養(yǎng)條件下IL-6蛋白表達(dá)水平圖像和正常條件下生長的抗-Acrin抗體蛋白表達(dá)水平相比較，經(jīng)過5g/L、10g/L木犀草素處理的骨肉瘤MG-63

14、細(xì)胞，隨著木犀草素濃度的增加抗-Acrin抗體蛋白表達(dá)水平變化不顯著，抗-Acrin抗體總量變化不顯著。其具體結(jié)果如圖3。 正常培養(yǎng) 5g/L木犀草素培養(yǎng) 10g/L木犀草素培養(yǎng) 圖3 不同培養(yǎng)條件下-Acrin抗體水平圖像3 討論3.1 臨床研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤主要來源于間葉細(xì)胞，是由具有極強(qiáng)惡性增殖能力的肉瘤細(xì)胞產(chǎn)生的不成熟骨組織或者骨腫瘤性組織7。骨腫瘤可發(fā)生于任何年齡的人群，但多見于1525歲的青年人，男性多于女性，其發(fā)病率約為2:1。骨肉瘤主要侵犯干干骺區(qū)，甚至能夠穿過骨骺對(duì)關(guān)節(jié)造成影響8。骨肉瘤惡性程度非常高，預(yù)后相當(dāng)差，術(shù)后3年存活率只有不到20%，5年存活率只有不到5%。近幾年來，

15、隨著醫(yī)療水平的不斷提高，骨肉瘤5年生存率逐漸提高，即便如此，仍然有40%左右的患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，并最終導(dǎo)致患者死亡9。相當(dāng)多的研究表明，在骨肉瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)程中，多數(shù)細(xì)胞因子的表達(dá)出現(xiàn)異常，如IL-6。作為一種效能較多的細(xì)胞因子，IL-6不但對(duì)腫瘤的生長與增值起著十分重要的作用，同時(shí)還可以促進(jìn)生成腫瘤血管、腫瘤遷移、促使產(chǎn)生炎性反應(yīng)。臨床研究表明，異常高表達(dá)的IL-6及IL-6受體和腫瘤的發(fā)生有著密切的關(guān)系10。3.2 在本研究中，經(jīng)5g/L與10g/L木犀草素處理后的骨肉瘤MG-63細(xì)胞生長惡劣，明顯不如未經(jīng)木犀草素處理及低濃度木犀草素處理的骨肉瘤細(xì)胞生長狀況，提示較高濃度的木犀草素對(duì)于骨肉瘤細(xì)胞的生

16、長、增值具有一定的抑制效應(yīng)。使用木犀草素處理的骨肉瘤MG-63細(xì)胞其運(yùn)動(dòng)遷移能力顯著降低，劃痕區(qū)域間隔明顯，并且木樨草素濃度越高其劃痕區(qū)域間隔就越明顯，提示木犀草素能夠顯著抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移，并且其抑制能力與木犀草素的濃度呈明顯的正相關(guān)關(guān)系。經(jīng)過木犀草素處理的骨肉瘤MG-63細(xì)胞，其穿膜細(xì)胞數(shù)量顯著降低，并且木犀草素濃度越高其穿膜細(xì)胞降低數(shù)量就越多，提示木犀草素能夠顯著抑制穿膜細(xì)胞的數(shù)量，并且其抑制能力與木犀草素的濃度呈明顯的正相關(guān)關(guān)系。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，骨肉瘤MG-63細(xì)胞IL-6蛋白表達(dá)水平隨木犀草素濃度的增加而逐漸降低，提示木犀草素能夠抑制IL-6蛋白的表達(dá)，并且其抑制能

17、力也與木犀草素的濃度呈明顯的正相關(guān)關(guān)系。3.3 總之，本研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素對(duì)于骨肉瘤MG-63細(xì)胞的生長、增值、運(yùn)動(dòng)遷移能力、穿膜細(xì)胞數(shù)量、IL-6蛋白表達(dá)水平均有一定的抑制作用，并且其抑制作用隨著木犀草素濃度的增加而逐漸增加，說明一定濃度的木犀草素對(duì)于骨肉瘤MG-63細(xì)胞具有極強(qiáng)的抑制作用，值得應(yīng)用于臨床骨肉瘤的治療。參考文獻(xiàn):1、徐統(tǒng)震, 孫雪飛,任冬梅,等.木犀草素抑制肺癌細(xì)胞A549的增殖及其聯(lián)合化療作用J山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2012，50（07）：50-54. 2、戴歡子.印跡基因TSSC3對(duì)骨肉瘤生物學(xué)特性的影響及其機(jī)制研究D.重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2012年病理學(xué)與病理生理學(xué)博士學(xué)位論文.3、李燁.木犀草素、葒草苷和異葒草苷的UGT代謝機(jī)理及BCRP外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控其代謝的機(jī)制研究D.廣東廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2013年藥劑學(xué)碩士學(xué)位論文.4、韓亞麗,繆競誠,盛偉華，等.Ad-IL-24對(duì)MG-63人骨肉瘤細(xì)胞抑癌效應(yīng)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)J生物工程學(xué)報(bào)，2009，10：1538-1545.5、姜英; 謝鯤鵬; 霍洪楠，等.木犀草素下調(diào)AEG-1和MMP-2的表達(dá)對(duì)血管生成和乳腺癌細(xì)胞侵襲性的抑制作用J生理學(xué)報(bào)，2013，65（05）：513-518.6、劉郁東.抑制mTOR通路在常氧及缺氧條件下對(duì)骨肉瘤細(xì)胞表型和生長相關(guān)分子的影響D湖北武漢：華中科技大學(xué), 2013年