利用蕓苔屬物種的蛋白質(zhì)酶解液生產(chǎn)肉類香精

1、利用蕓苔屬物種的蛋白質(zhì)酶解液生產(chǎn)肉類香精摘要：蕓苔屬植物的蛋白質(zhì)是通過堿萃取后用酸沉降得方法制備。一種雙酶法(中性蛋白酶 和 風(fēng)味蛋白酶) 通過兩個(gè)水解階段來水解蕓苔屬物種植物。蛋白質(zhì)和水解產(chǎn)物用于生產(chǎn)肉香味調(diào)味料。揮發(fā)性產(chǎn)物是蛋白質(zhì)水解液和其他添加劑通過熱反應(yīng)產(chǎn)生的，研究加工工藝條件對(duì)揮發(fā)性產(chǎn)物的影響。結(jié)果表明：溫度和pH值不僅影響產(chǎn)品數(shù)量也影響產(chǎn)品質(zhì)量。產(chǎn)生最佳風(fēng)味和揮發(fā)性產(chǎn)物的量最高是在160，pH4.0時(shí)，然而在180，pH8.0時(shí)有燒焦氣味產(chǎn)生。利用響應(yīng)曲面分析表明，反應(yīng)pH值和溫度對(duì)產(chǎn)生揮發(fā)性產(chǎn)物的數(shù)量有十分重要的影響。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析表明大部分的反應(yīng)產(chǎn)物出現(xiàn)在已經(jīng)被確

2、定的食品風(fēng)味模型系統(tǒng)中。關(guān)鍵詞：蕓苔屬植物、蛋白質(zhì)、酶解產(chǎn)物、香精的產(chǎn)生。1. 介紹 蕓苔屬植物的種子處于世界油料生產(chǎn)的第三位，在大豆和棉籽之后，在花生和向日葵之前。蕓苔屬植物包括廣為人知的菜籽油農(nóng)作物和被稱之為油菜籽的越發(fā)傳統(tǒng)的品種的。盡管這些油被廣泛使用，但是膳食中的蛋白質(zhì)還沒有被用到人類營(yíng)養(yǎng)學(xué)中，盡管他們具有很高的生物價(jià)值。至少在傳統(tǒng)品種中，它們反映含有相當(dāng)高的不受歡迎的非蛋白質(zhì)化合物 芥子油苷，它們分解膳食中營(yíng)養(yǎng)物、塑料、肌醇六磷酸。許多工藝已經(jīng)被發(fā)明用來減少膳食中的這類化合物的含量，一種具有低含量芥酸和低含量滋養(yǎng)地不良芥子油苷的“雙零”品種已經(jīng)被發(fā)明。然而，這些蛋白質(zhì)產(chǎn)品仍然包含芥子

3、油苷和其他抗?fàn)I養(yǎng)因子水平，這些水平太高以至于被稱為人類食物適合的蛋白質(zhì)來源。蕓苔屬植物的蛋白質(zhì)含有一個(gè)極好的必需氨基酸平衡，蛋白質(zhì)中賴氨酸含量的平均值大約為6.0%。此外，蛋白質(zhì)中大約有3.0%4.0%的含硫氨基酸、蛋氨酸、半胱氨酸，這些必需氨基酸的比例接近于糧食和農(nóng)業(yè)組織描述的理想層次。所以才連續(xù)不斷的致力于研究蕓苔屬植物水解蛋白，為了提高它的功能與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，或者是改善制備生物活性肽的方法。而且，人們發(fā)現(xiàn)用不同酶制備菜籽油蛋白水解液擁有抗氧化活性。與大豆蛋白相比，蕓苔屬植物蛋白可以生產(chǎn)更多的揮發(fā)性含硫化合物在熱反應(yīng)過程中。然而，蕓苔屬植物蛋白水解液用于原料生產(chǎn)“熱反應(yīng)型”調(diào)味料的資料是有限的

4、?！盁岱磻?yīng)型”調(diào)味料是比較近代的食品調(diào)味料術(shù)語，這些食品調(diào)味料是通過加熱兩種或多種先導(dǎo)原料極小心地控制條件產(chǎn)生的。在這個(gè)過程中主要的反應(yīng)是美拉德反應(yīng)。結(jié)果表明水解蛋白作為食品調(diào)味劑是很有用且很重要的。然而，在加酸水解蛋白質(zhì)過程中，不良副產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生，包括植物性蛋白和肉蛋白水解液中的肌苷酸中的1-氯-2,3-丙二醇和1,3-二氯-2-丙醇。因此，酶法水解植物性蛋白有潛力成為一種合適的制備調(diào)味料的方法。在這個(gè)研究中，蕓苔屬植物蛋白用于生產(chǎn)香料物質(zhì)且用定量定性方法去分析他們。研究pH值、溫度和蛋白質(zhì)水解度對(duì)產(chǎn)物的風(fēng)味特征和數(shù)量的影響。此外，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀來鑒別和描述產(chǎn)物。phenolic r

5、esin 化酚醛樹脂；醫(yī)酚樹脂 phenolic foam 化酚醛泡沫體 phenolic compound 酚類化合物，酚類復(fù)合物 phenolic aldehyde 化酚醛 phenolic acid 酚酸；酚醛酸 phenolic hydroxyl 酚式羥基 phenolic antioxidant 酚類防老劑   更多收起詞組短語 n.酚醛塑料phenolic plastic2. 材料和方法2.1. 酶中型蛋白酶 As1.398, 酶活力 6.2 _ 104 pu/g, 購(gòu)買于中國(guó)無錫杰能科國(guó)際有限公司風(fēng)味蛋白酶,酶活力 500 LAPU/g, 生產(chǎn)于丹麥諾維信公司.2.2.

6、制備蕓苔屬植物蛋白甘藍(lán)型油菜種子來自于鄭州一個(gè)石油加工廠，用80目去研磨，并在30-60下用石油醚脫脂。粉狀物用堿性溶液抽提（0.01mol的氫氧化鈉，物料比是1:10，在室溫下20分鐘），然后用離心機(jī)離心分離不溶性殘?jiān)ＪＯ碌臍堅(jiān)^續(xù)用可溶性無機(jī)鹽抽提（物料比1:5），并用離心分離不溶的殘?jiān)??？扇苄缘鞍资峭ㄟ^用鹽酸來調(diào)節(jié)pH值進(jìn)行純化，通過兩個(gè)過程的沉淀來從新獲得蕓苔屬植物的蛋白，先調(diào)節(jié)PH值為6.0，然后在調(diào)節(jié)為3.6。將沉淀蛋白溶于水（質(zhì)量比為8%），調(diào)節(jié)pH值為7.0。B-290微型噴霧干燥器用來干燥懸浮液，入口溫度為160，加料速度為10ml每分鐘，出口溫度是80。制備的合成蛋白中蛋

7、白含量是71.3%（蛋白因子是6.25）。2.3.蕓苔屬植物蛋白的酶法水解可以使用多種多樣的酶處理。首先蕓苔屬植物先只用中性蛋白酶在50，pH值為7.6，酶與底物比是3700(Pu/g)，底物與溶劑比是10%。中性蛋白酶酶解時(shí)間一般是1、2或3小時(shí)。一系列進(jìn)一步深層次水解是用中性蛋白酶酶解3小時(shí)，緊接著用風(fēng)味蛋白酶在55，pH值是6.2，酶與底物比是37(LAPU/g)，底物與溶劑比是10%。風(fēng)味蛋白酶的酶解時(shí)間一般是1、2、或3小時(shí)（不包括中性蛋白酶水解的3小時(shí)）。完成酶解后，將酶解液加熱至90，目的是為了抑制酶作用。得到的懸浮液用離心機(jī)在2800轉(zhuǎn)速每分鐘離心15分鐘，取出不溶性雜質(zhì)。水解

8、度被定義為酶解液中游離的氨基酸與蛋白質(zhì)中總氨基酸的比值，而游離氨基酸可以用水合茚三酮來測(cè)定。2.4.熱反應(yīng)的準(zhǔn)備和揮發(fā)性物質(zhì)的抽提將0.1g半胱氨酸很1.0g木糖混合溶于20ml 蕓苔屬植物蛋白水解液中。用磷酸緩沖溶液（0.01M）將上述溶液定容至50ml，調(diào)節(jié)pH值為4.0、6.0、8.0。然后轉(zhuǎn)移至反應(yīng)容器內(nèi)，并在100180內(nèi)的不同溫度下反應(yīng)。等反應(yīng)進(jìn)行至2小時(shí)時(shí)，冷卻至室溫，用二氯甲烷將反應(yīng)混合物抽提兩次，第一次是100ml,第二次是50ml.在溶解過程中殘留的水通過鈉硫酸鹽去除。溶劑萃取是在氮?dú)饩従徚鲃?dòng)的情況在集中到0.5ml。在氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析之前用十二烷被加入濃縮液中作為

9、內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。2.5.氣相色譜分析氣相色譜分析使用日本島精公司制造的GC-17A氣相色譜儀（日本島精公司，京都，日本）裝有PEG-20柱（25 m * 0.32 mm id）（日本島精公司，京都，日本），離子化火焰檢測(cè)儀用來定量揮發(fā)性化合物。注射器和檢測(cè)器的溫度都設(shè)置在200。烘箱溫度控制在40且維持10分鐘，然后從40-160以直線性每分鐘2增加，加熱到160時(shí)為50分鐘，用50:1的分流比。樣品分析一式三份，揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量以毫克每100ml的反應(yīng)溶液來表示。色譜的數(shù)量峰對(duì)應(yīng)一定數(shù)量的產(chǎn)物。2.6. 響應(yīng)曲面分析響應(yīng)曲面分析方法越來越多的應(yīng)用于評(píng)估多個(gè)因素的影響和他們之間關(guān)系。響應(yīng)曲面是一個(gè)用來

10、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)技術(shù)，建立模型，考慮幾個(gè)因素的影響和為了獲得理想反應(yīng)條件而評(píng)估最佳條件。與此方法，在響應(yīng)曲面分析方法中可能影響參數(shù)之間的相互關(guān)系可以用幾組有限的計(jì)劃實(shí)驗(yàn)來評(píng)估。因此，這個(gè)實(shí)驗(yàn)的主要目的是用形影曲面分析方法研究pH值、溫度、時(shí)間之間的關(guān)系對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量和產(chǎn)物數(shù)量的影響。一個(gè)用三個(gè)獨(dú)立自變量設(shè)計(jì)的三水平的箱線圖用于合適的響應(yīng)函數(shù)，且與相對(duì)應(yīng)的感官評(píng)分在表1中給出。2.7.對(duì)產(chǎn)物的感官評(píng)價(jià)為了評(píng)估熱反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味特征，挑選并培訓(xùn)7個(gè)專業(yè)感官評(píng)分員。他們被要求描述熱反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味特征是無肉香、煮肉香、烤肉香或者焦臭味，而且用喜歡的程度如不喜歡、喜歡、非常喜歡等來評(píng)價(jià)他的風(fēng)味。2.8.

11、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析熱反應(yīng)產(chǎn)物和揮發(fā)性抽提物以上述所描述的在不同條件下制備的方法：在pH值為4（100、120、140、160、180），pH值為6（100、120、140、160、180），pH值為8（100、120、140、160、180）。所有揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了合并，且這些混合物用于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀來分析。這些是用日本島精公司的GC-17A氣相色譜儀和QP-5000質(zhì)譜儀操作的。操作條件是上述所描述的，質(zhì)普師在70伏特是解離電子獲得。3.結(jié)果與討論3.1. 水分活度對(duì)產(chǎn)物的影響酶解液是根據(jù)上述所描述的方法制備的。分別酶解1、2、3、4、5、6小時(shí)六個(gè)樣品，且相對(duì)應(yīng)的水解度分別是5.

12、15%、 11.5%、 13.0%、16.4%、21.5%和26.8%。每個(gè)樣品都用于反應(yīng)產(chǎn)生芳香物質(zhì)。結(jié)果表明，不同水解度的酶解液產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)的量也不同，且隨著水解度增加而增加。在這個(gè)基礎(chǔ)上，將進(jìn)一步研究水解度為26.8%的酶解液。3.2. PH值對(duì)產(chǎn)物的影響在相對(duì)較低的溫度下（100和120），pH值為8時(shí)獲得的揮發(fā)性物質(zhì)比pH值為6時(shí)多。另外，在160-180時(shí)，pH值為4是產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物的量比pH值為6和pH值為8時(shí)多。揮發(fā)性物質(zhì)的成分受pH值影響。在160-180時(shí)，pH值為4時(shí)的揮發(fā)性產(chǎn)物的種類比pH值為6和pH值為8時(shí)多。但是，100、120、140時(shí)，pH值為6時(shí)揮發(fā)性

13、產(chǎn)物的種類比pH值為4和pH值為8時(shí)多。結(jié)果表明，pH值對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物影響很大。美拉德反應(yīng)取決于三個(gè)階段。初期階段開始于一個(gè)氨基和一個(gè)還原糖的縮合，在被稱作Amadori重排反應(yīng)生成氨基脫氧酮糖（或者當(dāng)還原糖是酮糖時(shí)是Heyns重排產(chǎn)物）。中期階段開始于將Amadori/Heyns重排產(chǎn)物進(jìn)一步降解并釋放氨基。最后階段是包括各種各樣的脫水、降解、環(huán)化、聚合反應(yīng)，其中氨基基團(tuán)參與各個(gè)反應(yīng)。與香氣形成極其重要的是被叫做Strecker降解階段，在這個(gè)過程中氨基酸被宰美拉德反應(yīng)中產(chǎn)生二羰基化合物降解，使氨基酸脫去氨基和碳酸基。必須被提及的是在缺乏氨基基團(tuán)的糖降解產(chǎn)生類似產(chǎn)物，但是在美拉德反應(yīng)，氨基

14、基團(tuán)扮演催化劑的作用，所以美拉德反應(yīng)導(dǎo)致的是一個(gè)更快更高產(chǎn)量的反應(yīng)中間產(chǎn)物。許多可能的反應(yīng)路線絕大數(shù)取決于溫度、pH值和天然產(chǎn)物。一些研究工作已經(jīng)開始研究pH值與美拉德感應(yīng)產(chǎn)生揮發(fā)性產(chǎn)物之間的關(guān)系。在模型體系中，所有芳香物質(zhì)和天然揮發(fā)性化合物都受pH值的影響。蛋氨酸系統(tǒng)中的主要產(chǎn)物是二甲基二硫化物和3-（甲硫基苯酚）丙醛，而且當(dāng)pH值增加時(shí)，后來合成的物質(zhì)在濃度上有微小的減少，然而觀察到二硫化物有所增加。在半胱氨酸體系中，低pH值導(dǎo)致大量硫化物合成，包括2-甲基-3-巰基呋喃，一種擁有強(qiáng)烈肉味的化合物。馬德魯加和莫特拉姆研究發(fā)現(xiàn)pH值是通過煮肉方式來影響美拉德反應(yīng)過程中得到的芳香揮發(fā)性物質(zhì)。揮

15、發(fā)性物質(zhì)的總量是隨著pH值的增加而增加的。在酸性條件下，許多巰基呋喃化合物和氧化物優(yōu)秀合成。其他雜環(huán)化合物如噻唑、吡嗪喜歡在堿性條件下生成。吡嗪是含氮的雜環(huán)化合物的一種。這些化合物是很重要的風(fēng)味物質(zhì)，對(duì)食品的感官特征上有顯著的影響。Bemis-Young, Huang, 和 Bernhard 在較為廣泛的pH值范圍內(nèi)研究pH對(duì)吡嗪化合物在葡萄糖-甘氨酸模型體系內(nèi)合成的影響。當(dāng)pH增加時(shí)，吡嗪化合物的量也隨之增加。最大品種的吡嗪化合物是在pH為9.0和pH為9.64時(shí)生成。Martins 和van Boekel 研究過葡萄糖-甘氨酸美拉德反應(yīng)路線動(dòng)力學(xué)，結(jié)果證明最初的pH對(duì)速率常數(shù)有不同 影響。

16、所以揮發(fā)物的量隨pH變化可以用在美拉德反應(yīng)中產(chǎn)生的不同濃度的中間產(chǎn)物來解釋。這表明氨基酸中官能團(tuán)的質(zhì)子化是很重要的。3.3. 溫度對(duì)產(chǎn)物的影響溫度對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的量和種類的影響見表2。在pH值為4、6、8時(shí)，揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量全部隨著溫度的升高而升高。當(dāng)溫度低于140時(shí)，在pH為4時(shí)的揮發(fā)性物質(zhì)量的提高速率與pH為6和pH為8相似。但是當(dāng)溫度高于140時(shí)，在pH為4時(shí)的揮發(fā)性物質(zhì)量的提高速率比pH為6和pH為8迅速。在pH值為4、6、8時(shí)，揮發(fā)性物質(zhì)的種類也隨著溫度的提高而提高。這可能歸因于涉及的復(fù)雜的自然反應(yīng)路線和不同加工條件的影響。應(yīng)用簡(jiǎn)單動(dòng)力學(xué)的傳統(tǒng)方法不是十分有效，因?yàn)樗m合只有單一的一步

17、。此外，正如預(yù)期的，數(shù)據(jù)證明溫度對(duì)反應(yīng)速率有明顯的影響?？偠灾诟邷叵滤俾士煊诘蜏貤l件，所以在高溫下可以產(chǎn)生更多的產(chǎn)物。3.4. pH值、溫度、反應(yīng)時(shí)間之間的相互關(guān)系響應(yīng)曲面用于評(píng)估反應(yīng)中pH值（X1）、溫度（X2，）和時(shí)間（X3，h）相互之間的影響關(guān)系。根據(jù)三水平箱線圖設(shè)計(jì)三個(gè)變量，用15分為測(cè)試總分。結(jié)果取決于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的量和產(chǎn)品種類，并呈現(xiàn)在表1中。設(shè)計(jì)專業(yè)軟件V7.1是用于分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果和最后依據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)的相關(guān)因素的方程：揮發(fā)性化合物的量（mg/100 ml） 和揮發(fā)性化合物的量:揮發(fā)性數(shù)字關(guān)于響應(yīng)曲面的二次方程式模型的方差分析見表2?；貧w數(shù)據(jù)證明，該模型對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)是十分重要

18、的（P < 0.01），對(duì)產(chǎn)物種類也是十分重要的（P < 0.05）。pH值和溫度的相互關(guān)系對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的量也有很重要的影響。此外，其他因素之間的相互關(guān)系不是很重要。3.5. pH值和溫度對(duì)芳香成分的影響感官評(píng)價(jià)的結(jié)果呈現(xiàn)在下表3中。這些表明，在較低溫度下（100和120），產(chǎn)物香味可以被定義為煮肉香，高于140時(shí)有烤肉的香氣，當(dāng)溫度在180、pH值為8.0時(shí)產(chǎn)物有焦臭味。這些結(jié)論與食品模型體系相一致。感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明，最受歡迎的芳香物質(zhì)在160和pH值為4.0時(shí)產(chǎn)生，且結(jié)果產(chǎn)物具有烤肉特征香氣。3.6.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀鑒定揮發(fā)性化合物不同條件下制備的反應(yīng)物的混合物用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀來分析。132種化合物被鑒定出來，包括醛類、酮類、酸類、多硫化物、吡嗪、呋喃、噻吩、噻唑、吡唑、嘧啶在反應(yīng)產(chǎn)物的二氯甲烷溶液中，部分成分列于表4中。不是所有132中化合物全都被發(fā)現(xiàn)在任何一套反應(yīng)條件中，列在表中的包含大多數(shù)揮發(fā)性物質(zhì)和那些已知的中間揮發(fā)性物質(zhì)。在反應(yīng)產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)化合物，出現(xiàn)在已知的食品和香料中。此外，這些以前