FACSDiva操作說明資料講解

1、FACSDiva操作說明書首先熟悉一下Diva的操作界面Q BO FACSDiv-d Soli.w-di«陸 Edl Vew EaioeN P問MomInsliuoerK MTS H«b應肝氐五瞬麗邕、EJivivwrTLfTTFTFjMane上1c一IM邇hflr £耐卵+： Un Gk*ol¥*ri：2hMl 占-賽 Specmsn.OGi *t TJw.C&l廠We I LaterIlTEEhrfdiff nr（尷咗傀i留罔皆i出豊|創(chuàng)二田|口|刖釦| 述1IAI丨I I丄TMH_(JD1DevIJs1 Afquhf 1IHKCCrd1St

2、O«W AJEveHi* |&H4 aNE* 阿Evflrfs ToRbCw®30000Everir Ta Dispioy1000 詢二|2£jiq|因救通過點擊菜單欄的相應的按鈕，可以隱藏或展開相應的模塊Browser三一三J Admlnlslraior=H| Simple AiWj sis 冒令 Insir Settings l+lGtotMl WorksheetsCdtwtfe Bezels回 畫 叵i l»jFH-J Tufce_QQ-| l+ U Iutoc_002 *1 帀 Tube.003EF- jj Tufce_ao4Shared

3、 View12/11 ar.通過Browser，可以對數(shù)據(jù)庫進行管理,Browser列出了文件夾、實驗、及實驗所包含的樣本和管子。Acquisition con trol對獲取和記錄數(shù)據(jù)進行操作4口Instrument儀器設置這個框顯儀器框顯示了儀器連接狀態(tài)，當打開一個實驗，試管指向定位于一個試管時,示的是當前試管的儀器設置。5囚瀏覽框瀏覽框顯示了worksheet或者Browser中選中的部件的屬性，可進行修改。6_1worksheetIrrWiark sheet酉圍鯉|叢傀他問隆I斌險眩I曰口I巳問I、口AIL 11口血|圧|電 GiQb Sheetl Tube: Tutoe_001Pop

4、ulationEventsParent%Totai All Events30000100 0-pi28,81196.096.0 F26.39721.321.3Worksheet框，可進行畫圖、設門、設邏輯關系，進行統(tǒng)計等。7呵 Acquisition Status1T ue_001ThreohcW Rcrto:10000 cvt/sThreshoftd Couinti2063/1 ovtElectronic Abort Rste:Electronic： Abort (2匚untPror&s-sed Fvent'20570 wtFlApspri TirnR-oo：o o：n?.獲

5、取狀態(tài)顯示了獲取或記錄數(shù)據(jù)時的狀態(tài)。必須先新在基本熟悉Diva的界面后，下面就進行一個實驗。在Diva軟件上進行操作,建一個實驗（實驗必須建立在文件夾中）。下面描述的是如何使用這些命令：Creating a Folder and an Experiment這部分描述了如何創(chuàng)建一個Practice文件夾和包含有基礎分析的實驗。1在瀏覽框的菜單欄中單擊IEl- PracticetKperment_UDlInMrOtobalYVockstieets2、重命名為 Practice，如下圖 日 匚3 Administrator申 L J Practice3、選擇Practice文件夾，點擊瀏覽框菜單欄的

6、在文件夾下就創(chuàng)建了一個新的實驗，這個實驗包含了默認的儀器設置和一個空白的global worksheet o4、點及增加Specimen快捷鍵可加一個樣本和試管。三 Experl ment_OWnA n instr SettingsIS Global Workslieets -聲 Speciih&rijDOlU Tutoe_ooi5、 瀏覽框中點擊左邊的樣本指向，指向tube-OO1。樣本指向變成綠色，說明當前Exprime nt和Acquiziti on con trol中顯示該tube的屬性。6、 在Browser中選擇每一項，看看Inspector框的變化。當tube-001被選

7、擇時，在Inspector中可以看到有四個標簽，分別點擊看看變化。在這版軟件中，一些儀器設置不能在Inspector中修改。當與流式細胞儀相連接時，可以在Instrument框中改變電壓、域值和補償。7、選擇 Exprime nt Exprime nt Layout，對每個參數(shù)進行定義，如下圖。當你的實驗包含有很多試管時，你可以用Exprime nt Layout來一次標記所有試管。8、在Exprime nt Layout對話框中，點擊 Acquisiti on標簽，選擇 Tube-001，改變計數(shù)粒子為 10000,點擊 OK。當你在瀏覽框中選擇Tube001時，在Inspector中的La

8、bels和Acqui中的選項也隨著改變。9、在 Global worksheet 中創(chuàng)建一個FSC vs SSC 點圖在worksheet菜單欄中點擊1-11，再在worksheet中點擊一下，就創(chuàng)建了一個默認大小點圖。10、在FSC vs SSC點圖中邊上創(chuàng)建一個 PE直方圖在worksheet菜單欄中點擊直方圖工具 L，再點擊worksheet，一個默認大小的直方圖就建立好了。點擊X軸標簽，在下拉菜單中選擇PE-A，可改變圖的參數(shù)。注意參數(shù)的名字是你先前設定的參數(shù)名。11在FSC vs SSC點圖下面創(chuàng)建一個 FITC vs PerCP-Cy5.5的點圖按住Ctrl鍵，點擊FSC vs S

9、SC圖的邊緣，往下拖。當你拖的時候，就創(chuàng)建了一個復制 的點圖。把點圖放在合適的位置，松開鼠標，這個方法可以復制任何的點圖。點擊坐標軸， 選擇合適的參數(shù)。12創(chuàng)建一個 Population HierarchyPopulation Hierarchy是用來列出定義的亞群。右擊任何點圖，選擇 Show Population Hierarchy，把結果圖拖到 FITC vs PerCP-Cy5.5點圖的右側。Worksheet應該看起來類似于下圖：K-»low 1WFSC-A3pec.lfn«rib 口OJI-Tubt ICD 4 FITC：-A'I n r 1 1 I 1

10、 ZOO3WSioe亡l«Ti右憎 001-Tube 0011W4W*1UaCD-IS*56 PE-ATube: Tu&b_C)01H opulabanW-Farenl 'hiatal jAII EvenlaOExporting an Experiment as a Template現(xiàn)在已經(jīng)創(chuàng)建好一個實驗了，可以導出成為一個模板。實驗模板包括了樣本、試管、關鍵詞、儀器設置、標簽、worksheet上的圖以及 worksheets （包括所有設置，如分頁），但不包含有數(shù)據(jù)。一個實驗可以保存為一個模板，為了簡化瀏覽框，模板不通過瀏覽框選擇。1、在瀏覽框中選擇 Exprim

11、e nt-OO1，再選擇 File Export Exprime nt Template。確定選擇的是 Exprime nt Template 命令，而不是 Exprime nt 命令。Export Experime nt Template Wizard出現(xiàn)，對話框上的黑體字告訴你每個框的作用2在模板類型中輸入 Practice，模板名字中輸入Simple Analysis。模板類型用來對類似的模板進行分組，以便于查找。當你在創(chuàng)建一個模板時， 至少要輸入類型和名字，后面的選項是可選項。3點擊Next，可查看后面的選項，點擊Finish。Creating an Experiment from a

12、 Template現(xiàn)在可以用原來保存的模板來創(chuàng)建一個實驗。記住當你想在一個文件夾中創(chuàng)建一個實驗時，首先要選擇文件夾。1、選擇 Practice文件夾，選擇 Experiment New Experiment。當你想用原來保存的Exprement模板時，使用菜單欄而不是快捷鍵，你也可以按Ctrl-E。Experime nt Templates 對話框出現(xiàn)2、在對話框中，點擊Practice標簽，選擇 Simple Analysis template，點擊鍵。Experime ntLayout對話框出現(xiàn)，顯示試管標記、關鍵詞、模板的設置等。3點擊Experiment Layout對話框中的各種標簽

13、，查看設置，然后點擊Cancle。這些設置是你建立模板時設定的，注意：這些數(shù)據(jù)是只讀的，不能修改。4點擊0K建立一個新的實驗注意原先的實驗已經(jīng)關閉，一個新的實驗Simple Analysis在瀏覽框中。當你在做實驗時,一次只能打開一個實驗。I+： E Experimarrt.QOISimps Analysis_0O1gw Instr Settings+I-® Global WorksheetsElSpecimen_001LJ Tube_001注意global worksheet中包含有點圖和 Population Hierarchy，在點圖中沒有數(shù)據(jù)。Importing an Exp

14、eriment接下來，你將在Practice文件夾中導入一個實驗。導入實驗與導入模板的不同之處在于 它們包含有記錄的數(shù)據(jù)。1 選擇 Practice文件夾，選擇 File Import Expriments默認情況下，當導入一個實驗時，D:BDExportExperiment folder將會出現(xiàn)，除非你以前 改變路徑導向到另一個文件夾。2、選擇命名為 Manual Comp的文件夾，點擊Import。Exprime nt導入的實驗都是以文件夾形式出現(xiàn)，文件夾在導入后在瀏覽框中將會以實驗 出現(xiàn)。注意原先的實驗沒有關閉，新的實驗加在Simple Analysis Experiment后面Prac

15、tice* Q Experiinent_001-|= Siinple AnalysisS0 Irstr Settings1+ » Global Worksheetsiri- 5pecinneri_00lC Tube_001+ H Manual Comp有三種方法在瀏覽框中增加實驗：1用瀏覽框工具欄中的快捷鍵一1來新建一個空的實驗(默認條件設置)。2、Exprime nt New Exprime nt命令新建一個新的實驗，實驗來自于一個原來保存的模板， 模版包含下列部分：點圖、門、統(tǒng)計圖和儀器設置。3、File import Exprime nt命令，可新建一個實驗，通過這個方法獲得的

16、實驗包括原來保 存的實驗條件等和數(shù)據(jù)。Working with Experiments in the Browser現(xiàn)在在瀏覽框中有三個實驗，一個關閉的實驗(Experime nt_OO1), 個打開的實驗模板(Simple Analysis)和一個關閉的導入的實驗(Manual Comp)。接下來的練習來證明關閉和打開的實驗之間的不同，以及如何來比較儀器設置。1 點擊Manual Comp Experiment前面的(+)，展開實驗。盡管在browser框中顯示出實驗組分，但點圖依舊是空白的，你必須打開一個實驗來獲 得它的數(shù)據(jù)。注意：展開一個實驗和雙擊打開一個實驗是不同的 Manual Co

17、mp1Instr Settings1±豊 Global Worksheets i+聲 Comperisation Specimeri F 聲 Calibrita-|= simple Analysis IS Instr SettingsFtl-Global Work$hset$iksiaec men_ooiU TubjClCM2、雙擊 Manual Comp Experiment 來打開Simple Analysis Experiment 關閉，在worksheet 中顯示 Manual Comp Experiment 中的分析目標。3、點擊其中一個實驗樣本Manual Comp Ex

18、periment中，在每個樣本下面含有多個試管，注意每個試管都是綠色的，說明每個試管都包含有數(shù)據(jù)。4、點擊試管指示到任何一個試管。自13 Manual Comp姦導 instr SettingsOlotnal WorkchiQiQtcli-畫 Glctol Sha&tlli 務 Compen&atlor Gp&ckmsrli 爵 Calitorita 申富Pre SortE H Far Left Post Sort口 頁& 何itaht RoE Sortmi :白 .真 Left Post BoirtFT |J Far Riaht Post Sort在globa

19、l worksheet中包含有點圖、 試管中含有數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)就顯示在worksheet中，可用試管指示來定位試管，則將顯示所選擇試管的數(shù)據(jù)。5、在browser中選擇其它試管注意：數(shù)據(jù)并沒有改變，必須依靠試管指示，才能在global worksheet中顯示其他試管的數(shù)據(jù)。 嘗試把試管指示指向另一個試管，注意數(shù)據(jù)的變化。6、展開 Simple An alysis Experime nt，選擇 In str Sett ings。注意Inspector上的儀器設置是所選Instru settings的設置，盡管實驗已經(jīng)關閉。7點擊Instrumengt框中的各個參數(shù)Instrment框顯示了試管指示

20、所對應的試管的儀器設置(Manual Comp Experiment中的tube)。In spector顯示的是試管的設置或者是所選擇的 In str Sett ings的設置。在這個例子里，In spector 顯示的是Simple Analysis Experiment實驗的儀器設置，你可以用 Instrument框和Inspector來比 較瀏覽器中的任何兩個儀器設置。普jblUlE | 豈|«|jTrJb&_EC1uNem2£jAdmhiSirSlOrfe-Pradic* *Ej>trlmetirt_OQ1 |l;4E 名爲"*忖血_001h

21、itr Setting鼻一簡 GbbdWMksfiects ffi 護 £pBcmen_OCH S-|I) Manual 匚mp.DOI5 hsir SeritinsSialus念 | Thr«ncJd | Ccmpensetion | Rrto LnsorPerimeter|a|h|.廠FL廠上J| - |ssc240LI?廠廠| |fitc4 2Dprrr te-40117皇頒f*prr1 rBODLJPJfsehSfrimvrll CoEScted顯示的是ManualComp_001 中 PE 試管的儀器設置E (ETwiplBteampensaikin Spechw

22、 iftfflf別«沾畀 LkiTtHrrvd Cortroi . II n AdarIn sir顯示的是simpleFire窗*轉瑕口呻 RE Sinned ConBrol.PerCP-CvSS Slant . APC SlfirrtdB匡一皆 CaibnioPw HEVtBTMP-bi ameteiFwamrtcirlpo-VottBorShewed View0 0-0-00rFRRR_lAn alysis_001的Settings的儀器設置in struUsing Gating Features在 BD FACSDiva 軟件中：可以創(chuàng)建四種類型的門：polygon、recta

23、 ngle、quadra nt 和 in terval。 自動圈門工具Automatic和Snap-To門工具可用來設置 polygon和interval門。 在這一節(jié)中，你需要先前所建立的Simple Analysis 和Manual Comp實驗。Creati ng Gates這部分說明了在 Manual Comp Experiment中怎么用worksheet中的菜單欄來設不同的門:1、打開 Manual Comp Experiment2、把試管指向對準 Calibrite樣本下的Pre Sort試管，如下圖：4、試管指示指向下一個試管，可以看到一些粒子在門外。5、選擇 FSC vs S

24、SC圖的 Autopolygon 門，Delete按Delete鍵而不是Backspace鍵，如果Delete鍵不工作的話，右擊門，選擇 delete。這將會 激活Delete鍵，下次就可以使用。6、在 FSC vs SSC點圖上創(chuàng)建 Snap-To polygon門門Calibrlte-Far Right Post Sortfio 100200250Snap-To polygon 禾口 autopolygon 門不同，Snap-To polygon 門自動重新計算?？煽匆?Snap-To polygon門的邊框比較粗。7、把試管指示回到Pre Sort試管，注意門的變化。8、（可選）用其它設

25、門工具進行練習,在點圖上去除Snap-To0，創(chuàng)建一個 Rectangle門門）和一個Polygon門（口）Edit ing Gates這部分描述怎樣移動和改變門的大小1選中FSC vs SSC點圖上的門，在每個頂點上會出現(xiàn)一個把手。2、移動選中的門移動門的時候，選擇門的邊，而不是頂點，可看到門的標簽隨著門一起移動3、拖動其中的一個把手來改變門的大小在你移動或者改變Snap-To門時，門將不會自動調準。你可以通過右擊門的邊，選擇下 拉菜單中的重新計算。4、通過拖動門內(nèi)的標簽，可把標簽拖到門外5、在門外點擊，釋放門6、關閉 Manual Comp Experiment.Subsetting Po

26、pulationsSimple An alysis Exprime nt 包括三個點圖和一個 Populati on Hierarchy 。 Populati onHierarchy主要是用來查看各個門內(nèi)群體關系。在這里，你需要原來創(chuàng)建的Simple Analysis Experiment，在軟件安裝時，樣本文件存在于 BDExport'FCS 文件中。導入數(shù)據(jù)在你進行分群前，需要含有數(shù)據(jù)的點圖：1、通過雙擊來打開 Simple An alysis Exprime nt ,只有把實驗打開時，你才能導入數(shù)據(jù)。2、選擇 File Import FCSfiles通常，D:BDExportFC

27、S文件出現(xiàn)，除非你原來改變過路徑3、雙擊4色文件，在雙擊 Calibrite beads文件夾來打開。4、選擇文件中所有的FCS文件，點擊ImportU Import FCS filesLook in.j Calibrite beadsTube.OOi ,tcsTube_0O2.fcsTube 0O3,tcsLJ Tube_0O4.fcsFile name:Tube 001.fcsFiles of type;|AIIFile? (*,*>JCancelImport當導入FCS文件時，需要選擇文件，而不是文件夾，可以通過Shift和Ctrl鍵來選擇多個甚至全部。這樣就增加了一個新的樣本Ca

28、librite Beads，含有四個帶數(shù)據(jù)的試管。Tube-0015、在Calibrite beads樣本中，把試管指向Srople Analysis_OOl S Instr Settings + ® Global Worksheets -一店 SpecirinOOl *U Tube_001-Calibrite0 0SImD Tube_001TutoejJOjT <jbe_003Tube 0046、在瀏覽框中選擇 Tube-001，勾選Inspector中熒光參數(shù)前的 Log Checkbox 。 InspectorTube Labels Acq. | Keywords ins

29、tr. Settingsj| Parameters Compensation)Parameter-ParameterTypeLog Voltage廠廠EEEE0 1 7 0 0 90 3 5 2 8 82 3 4 4 5 5HA A A A AAITCEF pPrint7、對Calibrite Specimen實驗的其它試管做相同的操作Defining and Subsetting Populations1、Tube-001 的 FSC vs SSC點圖上，建立一個 Autopolygon 門。Calibrite Beads-Tube 001so too iso aa 2M(161229. 1

30、10540)FSC-A“觀新的P1群就在Population Hierarchy上出現(xiàn)。2、把標簽P1拖出Autopolygon gate （點中P1標簽，拖出門外）。3、建立一個只顯示P1群的PE直方圖右擊直方圖，選擇show population P1。在直方圖上只顯示 P1群體，注意到直方圖上所有 的點都是紅色的，是 P1的顏色。1-曰s-u 礦S-口r=okS-llmDoTube: Tube.OOlPopulationEvents % Parent 琨 Total All Events -pi30b0002S.811«6.Di oao96.0("I)4、PE直方圖上

31、，在 PE陰性峰上創(chuàng)建一個 Autointerval門Population Hierarchy圖上P2群顯示在P1群下面。當你在一個群下創(chuàng)建一個門，新的群體 是原來群體的一個亞群。Calibrite Beads-Tube 001FAI-i-?-g-cmuTube- Tube_001Population#E ventsParent%TotalM All Events30.000100.0Pi2e,aii96.096.0>0P225.009S6.8B3.4注意到P2旁邊的顏色框是一個十字叉，說明子群的顏色仍舊是其母群的顏色。默認情 況下，In terval和Quadra nt門定義的群體一般

32、不會被授予顏色。5、點擊FITC vs PerCP-Cy5.5點圖，顯示 P2群體在點圖上右擊，選擇 show population P2點圖是空白的，因為 P2群體沒有顏色，下面是給 P2群體設置一個顏色：1）雙擊Population Hierarchy前的顏色框2）選擇一個顏色6、在 FITC vs PerCP-Cy5.5 點圖上建一個 FITC 陽性的 Rectangle門。擴展門的邊越過X軸，可以包含有軸的粒子。因為點圖顯示的是 P2的群體，新的P3群體是P2群體的一個子集。TubeOOlcahbrite Beaas-Tube 001Tube:Population All Events

33、P2lF3#Even1s %Parent%Total30.0001100 028.81196.D96.025.009S6.g83.46.29325.221.0FITZ下面的步驟顯示另一種建群體的方法。7、設置FITC vs PerCP-Cy5-5點圖顯示全部的粒子Tip你也可以用Inspector來顯示一個點圖的群體層次結構。8、 Population Hierarchy 中選擇 P2群體，在 PerCP-Cy5.5 陽性群體上畫一個 Autopolygon 門。結 果如下，可以看出新創(chuàng)建的P4群體是P2群體的一個子集。Ca ibme Beads-Tube 001Tube: Tube OiOl

34、Population All Events-Hpi P2#Evenis% Pa rent%Total30,00010C.028,81196.0gc o25,00966.803.46,29325.221 05,78423119.3在進行分群時為了避免錯誤，保持Population Hierarchy可視。在你改變?nèi)后w的名字或者顏色時，你還是可以選擇群體。Gating Multicolor Experimentsin terval 禾口 quadra nt 門的特下面的教程說明了在用人外周血進行淋巴細胞亞群分析時, 性。在這個實驗中，細胞用 CD3 FITC, CD16+CD56 PE, CD45

35、 PerCP-Cy5.5, CD4 PE-Cy7, CD19 APC,和 CD8 APC-Cy7 進行染色進行這一步學習，您需要6-color Experiment ( BDExport'Experiment folder )。1、在 Practice folder.中，導入 6-Color gating選擇文件夾，選擇 File > Import > Experiments，在 BDExport'Experiment folder 中定位6-color gating。選擇文件，點擊導入。2、雙擊實驗，打開實驗3/16+56/45/4/19/8 試管，如下圖。3、展

36、開lymphocytes樣本，試管指向定位在B-cotor gating hstr Saltings + 亙 Gtob引 Worksheets Lymphocytes*3/16+56M5Mn 9/8在worksheet點圖中就會顯示數(shù)據(jù)4、在CD45 vs SSC點圖上，單核細胞和粒細胞上畫一個Rectangle門。Tip :把門延伸過點圖的軸，這樣就包含在軸上的點。6+5 &f 5/19/8CD45 FerCP-Cy5-5-A5、在 Population Hierarchy 中把門命名為 MNEs ( monocytes、neutrophils、eosinophils )，選 擇P1

37、，輸入 MNEs，enter。茨:矢金4<ococo101D0I60209260FSC-H0 I AM)8、在淋巴細胞上畫一個Autopolygo n gate (），在Population Hierarchy上把這個群體命名為Tube： 3/16+56/45/1 WPopulation#E ventsParent%TotalI All Events10,000100.0HMNEs4,47344.744.76、在 Population Hierarchy 圖中右擊 MNEs，選擇 Invert Gate。在Population Hierarchy圖上就增加了一個新的群體（不包含單核細胞、

38、粒細胞和嗜曙紅 細胞）。Tube： 3/16+56/45/4/1W%Prent簧 TotalPopulaNonEvents All Events10,000100.0 MNES4,47344.7447 NOT(MNEs)5,62755.35537、右擊FSC vs SSC點圖，選擇顯示 population NoT（ MNEs ），結果如下圖。I* | I I I I | I I I I | I I I I | I I I I | n50 1OD 150 2OD 250FSC-H孫測；Ilymphocyte，結果如下圖，淋巴細胞是 NOT MNEs的一個子集。Lwonocvles-3ri 6+

39、5&r<5f4ji 蜩S-Tube. 3/10*5E/Jl5W19PopuUlion#E¥&nfl.s %Parenl %Total All Events10.000100.Q mnes0.31063.163.1 NQTWNEs)3.S9D3E.936.9 Lymphocvtea3.W50 IUD l» 2HD RDIden tify ing Lymphocyte Subsets下面就把淋巴細胞分為 T、B和NK細胞。1右擊FSC vs SSC點圖上的淋巴細胞門，選擇Drill down。一個新的FSC vs SSC圖出現(xiàn)，只顯示淋巴細胞。在一張點圖上

40、定義了一個門后，通過Drill down就可以創(chuàng)建一個只顯示門內(nèi)群體的點圖。2、在新的點圖上，把 FSC換成CD3。3、在CD3+細胞上畫一個Interval gate （一般應用在直方圖上，在點圖上也適用），命名新的 群體叫做T細胞。Tube： 3/16+66/46/4/1 fl/SPopulationEvents % Pa rent 9tTotai Ail Events10.000100.0 MNEs6.31063 163.1 NOT(blNEs)3.69036.936 9 Lymphocytes3,38891 333.9cells1.82553.918.24、 用類似的方法可以得到B、N

41、K亞群5、按住 Ctrl 鍵，在 Population Hierarchy 中選擇 T、B和NK ,右擊，選擇 Join Gates,在PopulationHierarchy圖上就出現(xiàn)一個新的群體，是T、B、NK細胞的總合。Tube： 3/1 6 + 56/45M/1 9/0Populaiion#E vents%Psrent%Total All E/HriLb1 0,0001 00.0 MNEs6,31 063.163.1口 MQT(MNEs)3,63036.936.91 I 1 ymphnnytRS91 .B33.9鹵 T cells1 日 2553.91 8.2兇 B CCIIG1 885

42、.51.9 NK ubill!=：1 ,23736.51 2.4I- T Chilli OR B wllw OR Nk：3.25095.932.5Calculat ing Compe nsati on Using In strume nt SetupBD FACSDiva軟件可以自動的計算光譜的重疊值，在進行補償時，更加節(jié)約時間，更 加精確。下面介紹如何使用In strume nt Setup feature。Setti ng Up Compe nsati on Con trols1 打開 Experiment_0012、編輯參數(shù)如果計算機與儀器相連，打開Specimen-001，把試管指針指

43、向Tube-001，在Instrument框中編輯參數(shù)。如果脫機操作，選擇 Exprime nt下的in strume nt sett ing，在In spector中編輯參數(shù)。3選擇 Instrument-lnstrument setup-Create compensation controls 。下面的對話框將出現(xiàn)Q Erie-ate- C«3mpen5-aliion 匚 oimtrolsTtihE's 廠匡 ijride seftaFirte urtslahned poriird tub型莎創(chuàng)iAddOK1C«w$i4增加或者刪除對照，定義標記特異性對照，或者

44、可以改變補償控制的順序。5點擊OK6展開 Compensation Control specimen 來查看補償對照。-ExperimentJOOl|卜!令 Instr SettingsB Global WorksheetsSpecimen_001FE Stained ControlCD45 PerCP-Cy5*5 Stained ControlCD4 PE-Cy7 Stained ControlCDB APC-Cy7 Stahed ControlAPC Stained ControlCompensation Controls Instr Settings Jnstain&d Cont

45、rol FITC Stained ControlCreating an Instrument Configuration在In strume nt Setup中，下一步就是記錄數(shù)據(jù)。 為了計算補償，首先要把in strume nt con figuration 設置成符合記錄數(shù)據(jù)的格式。1 選擇 Instrument-lnstrument Configuration2在 Instrument Configuration 對話框中，選擇 Add Configuration3在 Instrument Configuration 對話框中，輸入 2 laser, 4 color，點擊 OK注意：確認

46、你輸入的名字完全與圖上的相符，如果字符的空格或者大小寫與例子不符，在計算補償時，就會有一個錯誤信息。4在instrument configurations 歹U表中，選擇 2 laser，4 color，點擊 Add Parameter鍵6次 instrument configuration 圖應該如下所示：5命名laser和detector，輸入每個參數(shù)的名字首先應該確定一個Detector,再改變參數(shù)的名字?？梢酝ㄟ^查看其他的 configuration來找到每 個參數(shù)合適的laser和 detector。通過相應column的下拉菜單來選擇所對應的設置，把參數(shù)的名字改為FSC、SSC、F

47、ITC、PE、PerCP 和 APC。6點擊okImporting Data and Calculating Compensation現(xiàn)在已經(jīng)設置好與我們試驗相符的confuguration ,接下來就是導入數(shù)據(jù)。可以用原來記錄的數(shù)據(jù)(Sample exprime nt)來計算補償1 選擇 Practice folder ，從 BDExport'experime nt folder 里導入 AutoComp Exprime nt 。選擇 File- Import- Experime nt，找至 U AutoComp Exprime nt 文件夾，點擊 Import。2雙擊 AutoCo

48、mp Experiment 打開實驗這個實驗包含有一個 Compesation Specimen和四個熒光參數(shù)的試管3雙擊 Unstained Control Tube，打開對應的 worksheet4在FSC vs SSC點圖上，移動P1門包含所有的陰性粒子P1Unstained ControlI n | I I I I | I I r i J I I i n J I n I I J r50100150200250FSC-A0*00)s-g-g-?-3-5 右擊門的邊框，選擇 Apply to All Compe nsation Con trol 。6 雙擊第一個 Stained Contr

49、ol Tube ( FITC Stained Control )，在 worksheet打開相應的點圖。7確定P2門包含了所有的陽性顆粒。P2門是一個Snap-To Interval門，已經(jīng)包含了所有的陽性顆粒。如果一些顆粒在門外，右擊門，選擇 recalculate oFITC StminEd ControlI I | | u I | | | | v | I I i i | r 100150200250FSC-ACk 1 .MO)8雙擊下一個 Stained control tube，打開相應的 worksheet。9對下面的試管，重復7和8，當所有的門設定好后，你可以進行補償計算了。10選

50、擇 Instrument-Instrument setup-Calculate Compesation 。將會出現(xiàn)一個對話框，可以進行命名。11對于新的補償進行命名，點擊ok。一個新的設定，包括了參數(shù)和標記信息,閾值和電壓，計算好的補償。新的儀器設置儲存在Setup catalog 下。Calculating Compensation Manually在進行下面實驗時，需要導入Manual Comp Experiment，進行手動補償時不需要鏈接儀器。Adjusting FITC Compensation這部分描述了怎樣計算 FITC熒光的溢出，其他熒光也是類似的。1 選中 Compensat

51、ion Controls Specimen 樣本下的 FITC Stained Control 管。Manual Camp 舲 Irstr SettingsGlobal Vfcrksheets回畫叵回畫Compensation Controls 冷 Instr SettingsI Litistairieti ConlrolE3- t FITC Stained Corltroi0 PE Stairked Control H PerCP-C55 Staireci Canlroli7 I iyi rl I "|'| T il l | V 1 f'l'l IT I 1

52、 I 50100150i200250FSC-A QgfOl+l j APC Stained Control2在FSC vs SSC點圖上創(chuàng)建一個 Snap-To gate，如下圖SH own® 器P13在worksheet上選擇 FSC vs SSC點圖，右擊點圖，選擇 Show Populations > P1。4在 FITC-A vs PE-A 點圖上，畫一個 FITC 陽性的 Interval gate。在 Population Hierarchy view 圖 上，進行重命名為 FITC Positive。5 在 Population Hierarchy view 圖上

53、右擊 FITC Positive，選擇 In vert Gate，重命名為 NOT (FITC Positive) population Negative，女口下圖7 口一J 一.D” YFITC/PositivsL LTT<djCompen牟aticm Control-FITC w2 io° ioA 10sTube: FITC Stained ControlPopulaticnEvents%Parent%Total All Events5,0001000 P14.S32926926因 FFTC Positive1.S4837.0370 NOT(FITC Positive3.152630630FITC-A6在Inspector框中顯示補