小鼠腫瘤模型

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上腫瘤模型我們一般常用的就是小鼠模型和人腫瘤裸小鼠移植瘤模型。其中用得最多的是皮下模型，另外還有腹水（或者尾靜脈注射）以及原位模型，其他的模型很少用，就不提他們了。小鼠模型分三大類：第一類是以S180、EAC、H22等為代表的，他們的宿主小鼠多選用KM，可產(chǎn)生腹水，也可在皮下成瘤。多以腹水傳代，實(shí)驗(yàn)時(shí)抽取腹水，經(jīng)過一定稀釋后皮下接種構(gòu)建模型，接踵后第二天開始給藥，給藥7到10天，接種10天后結(jié)束試驗(yàn)，剝?nèi)∧[瘤稱瘤重。1. 關(guān)于構(gòu)建瘤種可以用體外細(xì)胞株培養(yǎng)后，用PBS懸浮至13×106/0.1ml/mouse，i.p接種即可，最好用6號(hào)左右的針頭，就是常用的2m

2、l一次性注射的針頭。2. 關(guān)于腹水傳代觀察到第一代的種鼠肚子較大后（一般約89天左右），可以傳代，傳代時(shí)取1ml注射器，用2ml注射器的針頭，種鼠腹部消毒后直接將針頭插入抽取腹水即可，注意不要把針頭插得很深，盡量淺一點(diǎn)，還可以把老鼠拎起來，利用重力，讓腹水集中在某處便于抽取，一般抽個(gè)0.5ml就可以了，不用離心，直接用PBS36倍稀釋后，接種到新的老鼠腹腔，腹水顏色為白色或者略有發(fā)黃都是正常的，但是血性腹水說明不好，需要注意調(diào)整，第二代以后，盡量67天的時(shí)候傳代，不要等的時(shí)間太久，否則腹水容易血性。三代后可用于試驗(yàn)。3. 關(guān)于接種進(jìn)行試驗(yàn)這個(gè)時(shí)候抽取的腹水需要量比較多，一般需要處死種鼠后，小心

3、地用消毒眼科剪刀鑷子剝開腹部皮膚，注意不要弄破肌肉，然后，用鑷子（最好是哪種前面有倒勾的鑷子，學(xué)名好像是唇型鑷）拎起腹部的肌肉，用剪刀剪開一個(gè)小口，然后用玻璃滴管或者去掉針頭的注射器吸取腹水。然后進(jìn)過一定的稀釋后，接種到小鼠的腋下。關(guān)于稀釋量，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的情況都不一樣，最好摸索一下，開始的時(shí)候可以適當(dāng)?shù)挠?jì)數(shù)，但是要用臺(tái)盼蘭染色后計(jì)活細(xì)胞數(shù)。接種部位在小鼠腋下，但是不要深入到腋窩里面，會(huì)給以后的操作帶來麻煩。接種時(shí)的進(jìn)針處離接種處遠(yuǎn)一點(diǎn)，讓針頭在皮下多走一段，不容易污染。有的人接種的時(shí)候喜歡針頭向上用力，緊貼著表皮往里走，然后注射的時(shí)候感覺阻力較大，打出來的皮丘又緊又圓，這樣的接種，會(huì)使腫瘤與皮

4、膚嚴(yán)重粘連，不利于最后腫瘤的剝?nèi)?。也不要緊靠肌肉，腫瘤會(huì)與肌肉嚴(yán)重粘連。應(yīng)該在兩者之間，進(jìn)針的感覺輕松自如，針頭很自由，雖然打出來的腫瘤不會(huì)很圓很漂亮，但是相對(duì)好剝?nèi)∫恍?. 關(guān)于觀測指標(biāo)主要是按時(shí)稱體重，試驗(yàn)結(jié)束后剝?nèi)∧[瘤稱瘤重。因?yàn)槌隽鲆呀?jīng)是接種后的第6天左右了，第10天就結(jié)束時(shí)間，瘤體積的數(shù)據(jù)意義就不大。小鼠腫瘤很難剝，這是沒有辦法的，只能耐心，沒有太好的辦法，剝多了以后，手上會(huì)掌握一些巧力，有一些幫助，但是我們還是很頭痛小鼠腫瘤試驗(yàn)結(jié)束。腫瘤組織周圍經(jīng)常會(huì)有一些血竇的形成，弄破后會(huì)有血和黃色的液體流出，正常的，但是剝瘤子的時(shí)候不要把它弄破，會(huì)嚴(yán)重影響瘤重。按照SFDA的規(guī)定，平均瘤重

5、小于1g，或者單個(gè)瘤重小于200mg，認(rèn)為腫瘤生長不良，試驗(yàn)作廢。小鼠模型第二類是以lewis肺癌、B16為代表的，他們的宿主多為C57。不產(chǎn)生腹水，只能皮下生長。多用插塊法或者勻漿法傳代和接種做試驗(yàn)。有一種做法也是接種后第二天開始給藥，還有一種做法是接種三天后給藥，接種后兩周結(jié)束試驗(yàn)，剝?nèi)∧[瘤稱重。1. 關(guān)于瘤種構(gòu)建體外細(xì)胞株，培養(yǎng)后PBS懸浮至13×106/0.1ml/site，接種至小鼠腋下，即可。2. 關(guān)于傳代與接種剝?nèi)∧[瘤，在PBS中取出腫瘤表面包膜和中心的壞死部分，剪刀剪成小塊，小塊大小以套管針的針口為標(biāo)準(zhǔn)。用鑷子將小塊從針頭處塞進(jìn)1820號(hào)的套管針，接種至小鼠腋下，用套

6、管針中間的實(shí)體針將瘤塊推出即可。還可以在上述腫瘤組織剪成小塊后，用玻璃勻漿器勻漿后，200目篩網(wǎng)過濾，收集濾液，活細(xì)胞計(jì)數(shù)，PBS稀釋后用注射器接種，稀釋量也需要各個(gè)實(shí)驗(yàn)室自己摸索。也是三代后可用于試驗(yàn)。3. 關(guān)于觀測指標(biāo)可以在出瘤后測量瘤體積，但是主要還是考察瘤重。小鼠模型第三類是以P388、L1210為代表的白血病模型。宿主為DBA2，也有人用C57與DBA2的F1代傳代，DBA2用于試驗(yàn)，但是我們兩種宿主都傳過代，沒有發(fā)現(xiàn)有什么區(qū)別。他們能形成腹水，一般不用于皮下接種試驗(yàn)，平時(shí)多用腹水傳代，實(shí)驗(yàn)時(shí)多用腹腔接種或尾靜脈接種考察生存時(shí)間。也是接種后第二天開始給藥這個(gè)就不細(xì)說了，很多可以參考第

7、一類，主要幾點(diǎn)就是，他們的腹水都是血性的。另外，腹水量也不多，有的時(shí)候可以先注射一到兩毫升的PBS后，再抽取。腫瘤模型構(gòu)建小鼠模型分三大類第一類是以S180、EAC、H22等為代表的，他們的宿主小鼠多選用KM，可產(chǎn)生腹水，也可在皮下成瘤。多以腹水傳代，實(shí)驗(yàn)時(shí)抽取腹水，經(jīng)過一定稀釋后皮下接種構(gòu)建模型，接種后第二天開始給藥（這里與指導(dǎo)原則相悖，指導(dǎo)原則要求腫瘤長至100-300立方毫米時(shí)才給藥），給藥7到10天，接種10天后結(jié)束試驗(yàn)，剝?nèi)∧[瘤稱瘤重。1. 構(gòu)建瘤種可以用體外細(xì)胞株培養(yǎng)后，用PBS懸浮至13×106/0.1ml/mouse，i.p接種即可，最好用6號(hào)左右的針頭，就是常用的2

8、ml一次性注射的針頭。細(xì)胞懸液接種時(shí)要選活力好的細(xì)胞，就是對(duì)數(shù)期。細(xì)胞生長至瓶底7080%滿的時(shí)候認(rèn)為是對(duì)數(shù)生長期。2. 腹水傳代觀察到第一代的種鼠肚子較大后（一般約89天左右），可以傳代，傳代時(shí)取1ml注射器，用2ml注射器的針頭，種鼠腹部消毒后直接將針頭插入抽取腹水即可，注意不要把針頭插得很深，盡量淺一點(diǎn)，還可以把老鼠拎起來，利用重力，讓腹水集中在某處便于抽取，一般抽個(gè)0.5ml就可以了，不用離心，直接用PBS36倍稀釋后，接種到新的老鼠腹腔，腹水顏色為白色或者略有發(fā)黃都是正常的，但是血性腹水說明不好，需要注意調(diào)整。第二代以后，盡量67天的時(shí) 候傳代，不要等的時(shí)間太久，否則腹水容易血性。三

9、代后可用于試驗(yàn)。腹水瘤接種時(shí)，接種量不要太高，1*107/ml，0.2ml即可，多按1：3用生理鹽水稀釋，否則有可能腹水血性。超過7天的腹水再傳代，動(dòng)物的周齡太大（>6周）,傳代次數(shù)太多也很容易出現(xiàn)血性腹水。一般小鼠腫瘤模型都控制在30多代以內(nèi)（也有說50多代的）。出現(xiàn)血性以后可以調(diào)整一下：血性腹水可以離心后加0.17N的NH4CL溶液破紅細(xì)胞，然后精確控制條件（接種量，傳代時(shí)間，動(dòng)物周齡等）傳幾代，很多情況下再傳一兩代后會(huì)有無腹水血性的種鼠出現(xiàn)，然后用這只種鼠的腹水繼續(xù)傳代。腹水難抽有幾種情況，要么接種天數(shù)不夠，腹水不夠多，一般要等動(dòng)物肚子很大了才去抽。要么就是壓力的問題。有的動(dòng)物腹水

10、很稠。這時(shí)可撕開小鼠肚子，拿掉針頭，直接抽干凈，最多的時(shí)候可抽到5ml。3. 接種這個(gè)時(shí)候抽取的腹水需要量比較多，有時(shí)需要處死種鼠后，小心地用消毒眼科剪刀鑷子剝開腹部皮膚，注意不要弄破肌肉，然后，用鑷子（最好是哪種前面有倒勾的 鑷子，學(xué)名好像是唇型鑷）拎起腹部的肌肉，用剪刀剪開一個(gè)小口，然后用玻璃滴管或者去掉針頭的注射器吸取腹水。然后進(jìn)過一定的稀釋后，接種到小鼠的腋下。關(guān)于稀釋量，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的情況都不一樣，最好摸索一下，開始的時(shí)候可以適當(dāng)?shù)挠?jì)數(shù)，但是要用臺(tái)盼蘭染色后計(jì)活細(xì)胞數(shù)（計(jì)數(shù)的時(shí)候要注意，有一些很細(xì)小的細(xì)胞是血細(xì)胞，不要計(jì)數(shù)）。如果接種細(xì)胞量偏大會(huì)造成腫瘤早期就潰爛，所以不要為了追求腫瘤

11、生長速度而一味的提高接種細(xì)胞量。接種部位在小鼠腋下，但是不要深入到 腋窩里面，會(huì)給以后的操作帶來麻煩?？梢酝膊炕虮巢靠恳恍?，不要往腹部靠，容易使腫瘤被墊料磨爛。接種部位可以選擇腋下或者后肢,有的文章說是背部接種,但是背部血管不發(fā)達(dá),營養(yǎng)不夠,一般不建議采用.接種時(shí)的進(jìn)針處離接種處遠(yuǎn)一點(diǎn)，讓針頭在皮下多走一段，不容易污染。有的人接種的時(shí)候喜歡針頭向上用力，緊貼著表皮往 里走，然后注射的時(shí)候感覺阻力較大，打出來的皮丘又緊又圓，這樣的接種，會(huì)使腫瘤與皮膚嚴(yán)重粘連，不利于最后腫瘤的剝?nèi)?。也不要緊靠肌肉，腫瘤會(huì)與肌肉嚴(yán)重粘連。應(yīng)該在兩者之間，接種的時(shí)候要精確控制接種在皮下，進(jìn)針深度1.5cm左右, 針

12、頭沿皮膚水平進(jìn)入,然后挑起表皮,注射。進(jìn)針的感覺輕松自如，針頭很自由，雖然打出來的腫瘤不會(huì)很圓很漂亮，但是相對(duì)好剝?nèi)∫恍?。防止接種的時(shí)候老鼠亂動(dòng)，正確手法是用拇指和食指捏住老鼠的頸部皮膚，無名指和手掌下部把老鼠的后肢捏住，捏頸部的時(shí)候手指盡量多捏一點(diǎn)皮膚，然后右手（你是左手抓動(dòng)物的話）拉住后肢，盡量往下拉，讓老鼠的身體伸展開來，在用無名指固定，中指可以放在老鼠的身體下面，適當(dāng)?shù)耐享?，使老鼠的腋下一代完全平展，皮膚不用繃得太緊，平展就可以了，另外接種的時(shí)候進(jìn)針點(diǎn)很靠下，針頭在皮下走一段再注射，速度不要太快。注射前針頭稍微動(dòng)一動(dòng)，能動(dòng)就說明在皮下，否則可能 在皮內(nèi)或者肌肉內(nèi)。一般來說都是有鼓包的

13、但是要是你接種位置太深入腋窩，你是看不到鼓包的。主要靠針頭稍微動(dòng)一動(dòng)來判斷。4. 觀測指標(biāo)主要是按時(shí)稱體重，試驗(yàn)結(jié)束后剝?nèi)∧[瘤稱瘤重。因?yàn)槌隽鲆呀?jīng)是接種后的第6天左右了，第10天就結(jié)束時(shí)間，瘤體積的數(shù)據(jù)意義就不大。小鼠腫瘤很難剝，只能耐心，沒有太好的辦法，剝多了以后，手上會(huì)掌握一些巧力，有一些幫助，但是我們還是很頭痛小鼠腫瘤試驗(yàn)結(jié)束。腫瘤組織周圍經(jīng)常會(huì)有一些血竇的形成，弄破后會(huì)有血和黃色的液體流出，正常的，但是剝瘤子的時(shí)候不要把它弄破，會(huì)嚴(yán)重影響瘤重。按照SFDA的規(guī)定，平均瘤重小于1g，或者單個(gè)瘤重 小于200mg，認(rèn)為腫瘤生長不良，試驗(yàn)作廢。第二類是以lewis肺癌、B16為代表的，他們的

14、宿主多為C57。不產(chǎn)生腹水，只能皮下生長。多用插塊法或者勻漿法傳代和接種。有一種做法也是接種后第二天開始給藥，還有一種做法是接種三天后給藥，接種后兩周結(jié)束試驗(yàn)，剝?nèi)∧[瘤稱重。1. 瘤種構(gòu)建體外細(xì)胞株，培養(yǎng)后PBS懸浮至13×106/0.1ml/site，接種至小鼠腋下，即可。2. 傳代與接種體內(nèi)瘤源用于傳代接種，有兩種手段（均為無菌操作），套管針插塊法對(duì)瘤組織損傷小，可能100成瘤。勻漿法對(duì)瘤組織損傷大，成瘤可能小于100。（1） 插塊法：種鼠處死后體表消毒，將腫瘤組織剝離下來后，置于在PBS或0.9%無菌氯化鈉注射液中洗滌干凈，然后剪開，去處中心顏色變暗壞死部分，以及外表的包膜（如

15、果比較明顯的話），選外圍發(fā)亮部分。清洗干凈，然后換到干凈的PBS中，用剪刀剪成1mm直徑左右的小塊，最后用鑷子將小塊從針頭處塞進(jìn)1820號(hào)的接種套管針（最好用的是胸膜活檢針20號(hào)，但是現(xiàn)在已經(jīng)買不到了，可以用硬脊膜外穿刺針18號(hào)磨平針頭后代替），在老鼠的皮膚上剪一小口，接種于動(dòng)物腋下或者其他部位。塞的組織塊的量以接種針頭的口徑為準(zhǔn)，不能太緊也不能太松，以孔徑為標(biāo)尺，盡量保持差不多大小的接種量。如出現(xiàn)出針掛組織的問題，關(guān)鍵在于針頭的磨制，在針后部的小突起于小缺口吻合后，實(shí)體針彎曲方向應(yīng)該與套管針磨制的斜面一致，接種時(shí)，實(shí)體針要推到底，也就是后 面的小突起與小缺口契合，然后針頭“舔住”肌肉層轉(zhuǎn)一圈

16、再退針，還有就是瘤塊一定要完全塞入針頭內(nèi)，外面不能有漏出來的。（2）勻漿法：種鼠處死后體表消毒，將腫瘤組織剝離下來后，置于PBS等體系中（以下均以PBS為例），用剪刀剪開，剔出中心的壞死部分，以及外表的包膜（如果比較明顯的話），清洗干凈，然后換到干凈的PBS中，用剪刀剪成1mm直徑左右的小塊，然后用玻璃勻漿器勻漿，注意上下次數(shù)不可超過5次，勻漿時(shí)可以適當(dāng)?shù)男D(zhuǎn)，200目篩網(wǎng)過濾，然后取濾液用臺(tái)盼蘭活細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行稀釋，最后將組織懸液用注射器接種。最終的稀釋量，需要根據(jù)你瘤株情況確定的接種量而定，這個(gè)接種量經(jīng)過一段時(shí)間的穩(wěn)定后，可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)（勻漿液的濃度、粘度、腫瘤組織大小等情況）直

17、接進(jìn)行稀釋，不需要計(jì)數(shù)，但是在早期，還是建議進(jìn)行計(jì)數(shù)后再稀釋。另外各種瘤株的情況不一樣，不光是接種量不同，同樣大小的瘤源勻漿后的活細(xì)胞數(shù)也會(huì)不同。比如NCI-H460勻漿后的活細(xì)胞數(shù)就比較多，而A431幾乎沒有活細(xì)胞。另外，如果一個(gè)瘤源不夠，可以取多個(gè)瘤源進(jìn)行接種，一般來說，插塊法，一個(gè)瘤源接種30只動(dòng)物是沒有問題的，勻漿法一般2只也可以接種30只 了，為保險(xiǎn)起見可以多預(yù)備一只瘤源。注意考慮可能需要剔出不合格瘤源的情況。最好不用帶血清的培養(yǎng)液代替PBS，因?yàn)檠迨钱惙N蛋白，雖然裸鼠T細(xì)胞缺陷，但是B細(xì)胞和NK細(xì)胞完整，含血清的物質(zhì)會(huì)引起裸鼠的免疫反應(yīng)，連帶著接種的瘤組織也會(huì)被影響，降低成瘤率和生長速度。從成瘤效果來說，無血清培養(yǎng)基>PBS>saline。 腫瘤模型體內(nèi)傳代的標(biāo)準(zhǔn)是，腫瘤體積大于500mm3以上就可以了，最好小于1000mm3。接種的動(dòng)物數(shù)應(yīng)該大于實(shí)際試