細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)

1、細(xì)胞培養(yǎng)基本知識(shí)基本概念基本概念w細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) w細(xì)胞系細(xì)胞系w細(xì)胞株細(xì)胞株w原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)w傳代傳代 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)技術(shù)技術(shù) 即是選用各種細(xì)胞的最佳生存條件對(duì)活即是選用各種細(xì)胞的最佳生存條件對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)，是廣泛應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和研究的技術(shù)，是廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要技術(shù)。用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要技術(shù)。細(xì)胞系細(xì)胞系w培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞w有限細(xì)胞系（有限細(xì)胞系（Finite Cell Line）w連續(xù)細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系（連續(xù)細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系（Infinite Cell Line）w腫瘤細(xì)胞

2、系或株腫瘤細(xì)胞系或株我國(guó)已建細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。我國(guó)已建細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。 腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈類上皮型細(xì)胞 具有不死性和異體接種致瘤性。具有不死性和異體接種致瘤性。 細(xì)胞株細(xì)胞株w用單細(xì)胞分離培養(yǎng)增殖形成的具特定用單細(xì)胞分離培養(yǎng)增殖形成的具特定生長(zhǎng)特性的細(xì)胞群生長(zhǎng)特性的細(xì)胞群w再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱之為亞株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱之為亞株。株。細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名細(xì)胞系或細(xì)胞株的命名 以供體患者的姓名命名：以供體患者的姓名命名： HeLa （來(lái)源于宮頸癌）（來(lái)源于宮頸癌）

3、以時(shí)間地點(diǎn)來(lái)命名：以時(shí)間地點(diǎn)來(lái)命名： CHO 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 （Chinese Hamster Ovary， ）宮宮-743： 宮頸癌上皮細(xì)胞，宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年年3月建立月建立NIH3T3：美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（：美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institute of Health）建立）建立 每每3天傳代，每次接種天傳代，每次接種3105細(xì)胞細(xì)胞ml以組織來(lái)源命名：以組織來(lái)源命名：如如BHK(幼地鼠腎細(xì)胞幼地鼠腎細(xì)胞) 以臨床疾病類型命名：以臨床疾病類型命名：如如BALL-1細(xì)胞系細(xì)胞系(來(lái)自來(lái)自B淋巴細(xì)胞急性白血病人白細(xì)胞淋巴細(xì)胞急性白血病人白細(xì)胞)原代培

4、養(yǎng)原代培養(yǎng)w直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞進(jìn)行的第一次培養(yǎng)物。直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞進(jìn)行的第一次培養(yǎng)物。w優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 組織細(xì)胞剛脫離機(jī)體，生物性狀尚未發(fā)生較大組織細(xì)胞剛脫離機(jī)體，生物性狀尚未發(fā)生較大變化，在一定程度上能夠反映體內(nèi)的狀態(tài)。變化，在一定程度上能夠反映體內(nèi)的狀態(tài)。 大鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞原代培養(yǎng)1.細(xì)胞種類：大鼠原代肝細(xì)胞；細(xì)胞種類：大鼠原代肝細(xì)胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：剛分離，未經(jīng)培養(yǎng)；培養(yǎng)的天數(shù)：剛分離，未經(jīng)培養(yǎng)； 細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：剛分離時(shí)球形透亮，貼壁細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：剛分離時(shí)球形透亮，貼壁 后呈不規(guī)則。后呈不規(guī)則。 傳代傳代w將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代培養(yǎng)將細(xì)

5、胞從一個(gè)培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)瓶即稱為傳代培養(yǎng)w原代培養(yǎng)的細(xì)胞在生長(zhǎng)、繁殖一定時(shí)間后，由于空間不足或細(xì)胞原代培養(yǎng)的細(xì)胞在生長(zhǎng)、繁殖一定時(shí)間后，由于空間不足或細(xì)胞密度過(guò)大導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)枯竭，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此需要進(jìn)行擴(kuò)大密度過(guò)大導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)枯竭，會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此需要進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，即傳代或稱為傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)，即傳代或稱為傳代培養(yǎng)。 HepG2細(xì)胞細(xì)胞 細(xì)胞種類：人肝腫瘤細(xì)胞；細(xì)胞種類：人肝腫瘤細(xì)胞； 培養(yǎng)的天數(shù)：傳代培養(yǎng)培養(yǎng)的天數(shù)：傳代培養(yǎng)2天；天； 細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：呈多角型、不規(guī)則細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：呈多角型、不規(guī)則 貼壁生長(zhǎng)，成團(tuán)聚集。貼壁生長(zhǎng)，成團(tuán)聚集。 傳代注意事項(xiàng)傳代注意事項(xiàng)w接種數(shù)

6、量為接種數(shù)量為51048105個(gè)個(gè)/ml 傳代密度太低，細(xì)胞容易死亡，表現(xiàn)出細(xì)胞在達(dá)到增傳代密度太低，細(xì)胞容易死亡，表現(xiàn)出細(xì)胞在達(dá)到增長(zhǎng)前有較長(zhǎng)的滯留期。長(zhǎng)前有較長(zhǎng)的滯留期。w培養(yǎng)液由于培養(yǎng)液由于pH下降而呈現(xiàn)黃色，表明細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到下降而呈現(xiàn)黃色，表明細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到最大密度需要換液或進(jìn)行傳代培養(yǎng)。最大密度需要換液或進(jìn)行傳代培養(yǎng)。w如果是單層貼壁的細(xì)胞，等長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶表面，即可進(jìn)行如果是單層貼壁的細(xì)胞，等長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶表面，即可進(jìn)行傳代。傳代。 細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件w無(wú)菌條件無(wú)菌條件w細(xì)胞生長(zhǎng)條件細(xì)胞生長(zhǎng)條件w細(xì)胞檢測(cè)條件細(xì)胞檢測(cè)條件w細(xì)胞保存條件細(xì)胞保存條件w實(shí)驗(yàn)室安全實(shí)驗(yàn)室安全細(xì)胞培

7、養(yǎng)的無(wú)菌環(huán)境細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)菌環(huán)境 w無(wú)菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操無(wú)菌室的結(jié)構(gòu)：一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。作間三部分組成。 w（使用前）紫外照射（使用前）紫外照射（1小時(shí)）小時(shí)）w每周甲醛、乳酸、過(guò)氧乙酸熏蒸（每周甲醛、乳酸、過(guò)氧乙酸熏蒸（2小時(shí)）和小時(shí)）和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒行消毒 生物安全柜生物安全柜 w使用前開啟柜內(nèi)紫外燈照射使用前開啟柜內(nèi)紫外燈照射1030分鐘，分鐘，w預(yù)工作預(yù)工作1015分鐘，以除去臭氧分鐘，以除去臭氧和使用工作臺(tái)面空間呈凈化狀態(tài)。和使用工作臺(tái)面空間呈凈化狀態(tài)。w使用完畢后，要用使用完畢

8、后，要用70%酒精將臺(tái)酒精將臺(tái)面和臺(tái)內(nèi)四周擦拭干凈。面和臺(tái)內(nèi)四周擦拭干凈。w還要定期用福爾馬林熏蒸。還要定期用福爾馬林熏蒸。 常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒常用培養(yǎng)器皿及清洗消毒 w玻璃器皿的清洗玻璃器皿的清洗 一般經(jīng)過(guò)浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個(gè)步驟一般經(jīng)過(guò)浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個(gè)步驟 w新的橡膠制品洗滌方法新的橡膠制品洗滌方法 0.5M NaOH煮沸煮沸15分鐘，流水沖洗，分鐘，流水沖洗，0.5MHCl煮沸煮沸15分鐘，流水沖洗，自來(lái)水煮沸分鐘，流水沖洗，自來(lái)水煮沸2次，蒸餾水煮沸次，蒸餾水煮沸20分鐘，分鐘，50烤干備用。烤干備用。 消毒前包裝消毒前包裝w常用的包裝材料常用的包裝材料 牛皮紙

9、、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、鋁箔牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、鋁箔火焰消毒火焰消毒w在無(wú)菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈。在無(wú)菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈。以后一切操作，如打開或封閉瓶口等，都需以后一切操作，如打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過(guò)燒灼進(jìn)行。在火焰近處并經(jīng)過(guò)燒灼進(jìn)行。w培養(yǎng)瓶培養(yǎng)瓶w滴管、試管、吸管滴管、試管、吸管細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)用品細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)用品 w細(xì)胞培養(yǎng)瓶細(xì)胞培養(yǎng)瓶 w25平方厘米，正方斜頸平方厘米，正方斜頸w25平方厘米，三角斜頸平方厘米，三角斜頸w75平方厘米，正方斜頸平方厘米，正方斜頸w75平方厘米，三角斜頸平方厘米，三角斜頸w150平方厘米，正方斜頸平方厘米

10、，正方斜頸 w細(xì)胞培養(yǎng)板細(xì)胞培養(yǎng)板w 6孔，孔，w12孔，孔，w24孔，孔，w48孔孔w96孔孔w細(xì)胞培養(yǎng)皿細(xì)胞培養(yǎng)皿w 35mmw 60mm w100mm w凍存管w1.2ml w2ml，w5mlw離心管離心管w 15mlw 50mlw細(xì)胞刮細(xì)胞刮濾濾 器器大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液大多數(shù)培養(yǎng)用液，如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶液等均采用濾過(guò)法除菌。等均采用濾過(guò)法除菌。液氮罐何處購(gòu)買細(xì)胞何處購(gòu)買細(xì)胞國(guó)內(nèi)細(xì)胞庫(kù)中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心聯(lián)系方法：聯(lián)系方法：地址：上海市岳陽(yáng)路地址：上海市岳陽(yáng)路32

11、0號(hào)，號(hào)，200031 54920405Fax:系人：陳松華，徐惠均聯(lián)系人：陳松華，徐惠均e-mail: shchensibs.ac w中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 也稱武漢大學(xué)保藏中心，是國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的專利培養(yǎng)物也稱武漢大學(xué)保藏中心，是國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的專利培養(yǎng)物/生生物材料菌種保藏機(jī)構(gòu)物材料菌種保藏機(jī)構(gòu)訂購(gòu)程序訂購(gòu)程序w向中心訂購(gòu)培養(yǎng)物，可查閱向中心訂購(gòu)培養(yǎng)物，可查閱CCTCC培養(yǎng)物目錄，并向培養(yǎng)物目錄，并向CCTCC提提出訂購(gòu)培養(yǎng)物的名稱、出訂購(gòu)培養(yǎng)物的名稱、CCTCC保藏號(hào)等內(nèi)容。保藏號(hào)等內(nèi)容。w聯(lián)系方式

12、可通過(guò)聯(lián)系方式可通過(guò) 、 ，信函，電子郵件等方式。，信函，電子郵件等方式。w 細(xì)胞系：細(xì)胞系：300500元元/每株每株 w菌種準(zhǔn)備時(shí)間菌種準(zhǔn)備時(shí)間 一般情況一般情況CCTCC收到訂購(gòu)人的匯款后的收到訂購(gòu)人的匯款后的3-4天寄出，每周寄送二天寄出，每周寄送二次（周一，周五）。次（周一，周五）。細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)w碳水化合物、氨基酸和脂類碳水化合物、氨基酸和脂類三大類三大類w也需要一定量的無(wú)機(jī)鹽、維也需要一定量的無(wú)機(jī)鹽、維生素和微量元素生素和微量元素細(xì)胞培養(yǎng)液細(xì)胞培養(yǎng)液 w水水w平衡鹽溶液平衡鹽溶液 wpH調(diào)節(jié)液調(diào)節(jié)液w消化液消化液w抗

13、生素溶液抗生素溶液w培養(yǎng)基培養(yǎng)基 水：新鮮配置的三蒸水或去離子水水：新鮮配置的三蒸水或去離子水桶裝水：怡寶桶裝水：怡寶細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制平衡鹽溶液平衡鹽溶液w主要由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖配制而成主要由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖配制而成w作用作用 維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度 w常用的緩沖液常用的緩沖液 生理鹽水生理鹽水 PBS Hanks液液 （D-Hanks常用于配制胰酶溶液）常用于配制胰酶溶液） pH調(diào)節(jié)液調(diào)節(jié)液(1) 碳酸氫鈉液碳酸氫鈉液 (2) Hepes緩沖液緩沖液 是一種可以保持細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中是一種可以保持細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中pH值較長(zhǎng)時(shí)間值較長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的氫離子

14、緩沖劑穩(wěn)定的氫離子緩沖劑通常使用濃度為通常使用濃度為1015mM 消化液消化液(1)胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液(2) 主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，從而使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落并使細(xì)胞主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，從而使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落并使細(xì)胞游離分散開來(lái)游離分散開來(lái)(3) 常用濃度為常用濃度為0.25%或或5%胰蛋白酶。胰蛋白酶。(4) (2) EDTA溶液溶液 (5) 作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。(6) 對(duì)于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，可用對(duì)于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，可用EDTA和胰酶的混合液和胰酶的混合液(7) EDTA溶液的使用濃度為溶液的使用濃度為0.02

15、%，配制時(shí)應(yīng)加堿助溶，配制時(shí)應(yīng)加堿助溶 (8)(3)膠原酶溶液膠原酶溶液(9) 膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用，膠原酶作用的對(duì)象是膠原組織，因此膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時(shí)經(jīng)常使用，膠原酶作用的對(duì)象是膠原組織，因此不容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。不容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷。 抗生素溶液抗生素溶液w通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用，俗稱通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用，俗稱“雙抗溶液雙抗溶液”。w青霉素主要是對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有效，鏈霉素主要對(duì)革蘭青霉素主要是對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有效，鏈霉素主要對(duì)革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污染。污染。 培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素

16、最終使用濃度為每毫升培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。單位。慶大霉素：每毫升慶大霉素：每毫升100單位單位 培養(yǎng)基培養(yǎng)基w分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基w天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基： 血清血清 血漿血漿 組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）組織提取液（如雞胚和牛胚浸液） 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基 w根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。方法模擬合成的。w包括四大類物質(zhì)：無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、包括四大類物質(zhì)：無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物碳水化合物w目前常用培養(yǎng)基：目前常用培養(yǎng)基：RPMI-1640、DMEM

17、、TC199、MEM、w另有無(wú)血清培養(yǎng)基、無(wú)蛋白培養(yǎng)基另有無(wú)血清培養(yǎng)基、無(wú)蛋白培養(yǎng)基RPMI1640w最初是由最初是由G，E，Moore為培養(yǎng)小鼠白血病細(xì)胞而為培養(yǎng)小鼠白血病細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。設(shè)計(jì)的。w開始的配方特別適合于懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)，主要是開始的配方特別適合于懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)，主要是針對(duì)淋巴細(xì)胞，后經(jīng)過(guò)改良，從針對(duì)淋巴細(xì)胞，后經(jīng)過(guò)改良，從RPMI1630、RPMI1634、直至、直至RPMI1640。w其組分較為簡(jiǎn)單，適合許多種細(xì)胞生長(zhǎng)，如腫其組分較為簡(jiǎn)單，適合許多種細(xì)胞生長(zhǎng)，如腫瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等。瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等。w尤其適合人白細(xì)胞，如尤其適合人白細(xì)胞，

18、如H9、T-15、HL-60、IM-9、Jurkat、 K-562 及及KATOIII等細(xì)胞系的培養(yǎng)。等細(xì)胞系的培養(yǎng)。RPMI1640種類種類wRPMI1640（A） （不含谷氨酰胺、可高壓滅菌）（不含谷氨酰胺、可高壓滅菌）wRPMI1640（A）無(wú)酚紅）無(wú)酚紅 （不含谷氨酰胺、高壓滅菌）（不含谷氨酰胺、高壓滅菌）wRPMI1640 （含谷氨酰胺、除菌過(guò)濾滅菌）（含谷氨酰胺、除菌過(guò)濾滅菌）DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)基w 是在是在MEM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上研制的w與與MEM比較增加了各種成分用量，同時(shí)又分為高糖型（低于比較增加了各種成分用量，同時(shí)又分為高糖型（低于4500g/L）和

19、低糖型）和低糖型(低于低于1000g/L)。w高糖型有利于細(xì)胞停泊于一個(gè)位置生長(zhǎng)，適于生長(zhǎng)較快、附著高糖型有利于細(xì)胞停泊于一個(gè)位置生長(zhǎng)，適于生長(zhǎng)較快、附著較困難腫瘤細(xì)胞等。較困難腫瘤細(xì)胞等。 w DMEM（A）【不含谷氨酰胺、可高壓滅菌】）【不含谷氨酰胺、可高壓滅菌】 DMEM（H）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌過(guò)濾滅菌】）【含谷氨酰胺、高糖型、除菌過(guò)濾滅菌】 DMEM（L）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌過(guò)濾滅菌】。）【含谷氨酰胺、低糖型、除菌過(guò)濾滅菌】。干粉培養(yǎng)基的配制干粉培養(yǎng)基的配制 w認(rèn)真閱讀說(shuō)明書。說(shuō)明書都注明干粉不包含的成分，常見的有認(rèn)真閱讀說(shuō)明書。說(shuō)明書都注明干粉不包含的成分，常見的有Na

20、HCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些等。這些成分有些是必須添加的，如是必須添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決、谷氨酰胺，有些根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定。定。w配制是要保證充分溶解，配制是要保證充分溶解，NaHCO3、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。養(yǎng)基完全溶解之后才能添加。w配制所用的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。配制所用的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。w 所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。 w配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過(guò)濾，無(wú)菌保存于配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過(guò)濾，無(wú)菌保存于4度。度。 血清的使用血清的使用w血清質(zhì)

21、量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵w常用血清常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，胎牛血清是品質(zhì)最高的。馬血清等，胎牛血清是品質(zhì)最高的。w優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn) 透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。毒污染。w血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）血清的滅活（消除補(bǔ)體活性） 56 ，30 分鐘。分鐘。w血清的消毒血清的消毒 過(guò)濾除菌。過(guò)濾除菌。牛血清牛血清w胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛胎牛血清應(yīng)取自剖腹產(chǎn)的胎牛w新牛血清取自出生新牛血清取自出生24小時(shí)之內(nèi)的新生牛小時(shí)之內(nèi)

22、的新生牛w小牛血清取自出生小牛血清取自出生1030天的小牛天的小牛w使用濃度：使用濃度： 一般為一般為520，最常用是，最常用是10 何謂何謂FBS、FCS、 CS、HS ?wFBS (fetal bovine serum) 和和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清，兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼，乃錯(cuò)誤的使用字眼， 請(qǐng)不要再使用。請(qǐng)不要再使用。wCS (calf serum) 則是指小牛血清則是指小牛血清wHS (horse serum) 則是指馬血清則是指馬血清血清解凍步驟血清解凍步驟w逐步解凍法逐步解凍法 20 或

23、或70 至至4 冰箱溶解一天，至冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以室溫下全溶后再分裝，一般以50 ml 無(wú)菌離無(wú)菌離心管可分裝心管可分裝4045 ml。w勿直接由勿直接由20 至至37 解凍，因溫度改變太解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。 無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽wCaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、NaHCO3 、NaH2PO4w對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、某些酶的活性對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。及溶液的酸堿度都是必須的。 氨基酸氨基酸 w纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙

24、、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型型)w細(xì)胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由細(xì)胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉(zhuǎn)化合成其他氨基酸或糖類轉(zhuǎn)化合成w谷氨酰胺具有特殊的作用，補(bǔ)加一定量的谷氨谷氨酰胺具有特殊的作用，補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺酰胺 。wL-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性一些細(xì)胞具有毒性 。 休息一會(huì)兒吧！休息一會(huì)兒吧！w伸伸退，彎彎腰！體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型 貼附型貼附型大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，大致分成以下四型：賴性細(xì)胞，大致分

25、成以下四型：成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞上皮型細(xì)胞上皮型細(xì)胞游走細(xì)胞型游走細(xì)胞型多型細(xì)胞型多型細(xì)胞型1、成纖維細(xì)胞型、成纖維細(xì)胞型名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來(lái)源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：來(lái)源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞，心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，真正的成纖維細(xì)胞，心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮血管內(nèi)皮形態(tài)：胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出形態(tài)：胞體梭形或不規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出2323個(gè)長(zhǎng)短不等個(gè)長(zhǎng)短不等 的突起，中有卵圓形核的突起，中有卵圓形核生長(zhǎng)特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀生長(zhǎng)特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀 細(xì)胞細(xì)胞細(xì)

26、胞接觸易斷開而單獨(dú)行動(dòng)，游離的單獨(dú)的成纖維細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動(dòng)，游離的單獨(dú)的成纖維 樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起樣細(xì)胞，常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起成纖維細(xì)胞成纖維細(xì)胞 HUVECs人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞1.細(xì)胞種類：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞種類：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：4d；原代培養(yǎng)；原代培養(yǎng)；3.放大倍速：倒置顯微鏡放大倍速：倒置顯微鏡 X20；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：DMEM+15胎牛胎牛 血清；血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈梭細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈梭 形，扁平形或多角形，貼壁生長(zhǎng)。形，扁平形或多角形，貼壁生長(zhǎng)。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)

27、胞1.細(xì)胞種類：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代；細(xì)胞種類：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代；2.培養(yǎng)天數(shù)：培養(yǎng)天數(shù)：7天；天；3.放大倍數(shù)：放大倍數(shù)：200倍，倒置顯微鏡；倍，倒置顯微鏡；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：DF12+10FBS；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：使用細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：使用percoll密度梯度密度梯度離心法分離人骨髓細(xì)胞。首次換液離心法分離人骨髓細(xì)胞。首次換液48h，這是，這是7天后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增情況。天后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增情況。 2、上皮型細(xì)胞、上皮型細(xì)胞名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同來(lái)源：來(lái)源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞來(lái)源：來(lái)源于外胚層、

28、內(nèi)胚層細(xì)胞, 如：如： 皮膚及其衍生物皮膚及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡, 上皮性腫瘤上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核形核 生長(zhǎng)特點(diǎn)：易相連成片，相靠生長(zhǎng)特點(diǎn)：易相連成片，相靠緊密相連緊密相連成薄層成薄層鋪石狀鋪石狀生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，很少脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)上皮型細(xì)胞上皮型細(xì)胞 SKOv3 （卵巢癌細(xì)胞）1.細(xì)胞種類：SKOv3（卵巢癌細(xì)胞）2.培養(yǎng)的天數(shù)：傳代后3d；3.放大倍速：倒置顯微鏡 X10；4.培養(yǎng)基種類：DMEM+5%胎牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)

29、與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞貼壁生 長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度較快。 CCL-1491.細(xì)胞種類：大鼠肺泡上皮細(xì)胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：1d（種在48孔板中）；3.放大倍速：倒置顯微鏡 X20；4.培養(yǎng)基種類：F12K+10%胎牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈梭形，透亮貼壁生長(zhǎng)，34天傳代一次，Giemsa染色。3 3、游走細(xì)胞型：、游走細(xì)胞型：呈散在生長(zhǎng)，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)呈散在生長(zhǎng)，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。 CNE11.細(xì)胞種類：高分化鼻咽癌細(xì)胞系；細(xì)胞

30、種類：高分化鼻咽癌細(xì)胞系；2.培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：3d；3.放大倍速：相差放大倍速：相差100；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：PMI1640+10%CS；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：貼壁細(xì)胞，細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：貼壁細(xì)胞， 梭型成團(tuán)生長(zhǎng)。梭型成團(tuán)生長(zhǎng)。 4、多型細(xì)胞型、多型細(xì)胞型w有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。 SD大鼠神經(jīng)元大鼠神經(jīng)元 原代原代1.細(xì)胞種類：腦皮質(zhì)細(xì)胞；細(xì)胞種類：腦皮質(zhì)細(xì)胞；2.培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：4-5天；天；3.放大倍速：電鏡放大倍速：電鏡20000；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基

31、種類：DMEM+10%小牛血清小牛血清+10%馬馬 血清；血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：貼壁細(xì)胞，有多量軸細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：貼壁細(xì)胞，有多量軸 突和樹突。突和樹突。懸浮型懸浮型概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)概念：培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)來(lái)源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞來(lái)源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞特點(diǎn)：在懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)特點(diǎn)：在懸浮中生長(zhǎng)良好細(xì)胞圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便優(yōu)點(diǎn)：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便( (不需消化不需消化) )，易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)：觀

32、察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)缺點(diǎn)：觀察不方便，很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)( (尤以正常細(xì)尤以正常細(xì)胞胞) ) HL-60 分化細(xì)胞分化細(xì)胞Giemsa染色染色1. 細(xì)胞種類：細(xì)胞種類：HL-60； 2. 培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：ATRA 1微摩爾作用微摩爾作用5天；天；3. 放大倍速：倒置顯微鏡放大倍速：倒置顯微鏡 X10；4. 培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：1640+8胎牛血清；胎牛血清；5. 細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：懸浮細(xì)胞，分化的細(xì)胞核漿比例減小，核仁減少或細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：懸浮細(xì)胞，分化的細(xì)胞核漿比例減小，核仁減少或 消失，胞核呈桿狀或分葉狀。消失，胞核呈桿狀或分葉狀。 KU8121.細(xì)胞種類：人

33、嗜堿細(xì)胞性白血病細(xì)胞系；細(xì)胞種類：人嗜堿細(xì)胞性白血病細(xì)胞系；2.培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：5d；3.放大倍速：倒置顯微鏡放大倍速：倒置顯微鏡 X20；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：RPMI1640+10%新生牛血清；新生牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈圓形，懸浮生長(zhǎng)。細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈圓形，懸浮生長(zhǎng)。 HeLa細(xì)胞細(xì)胞1.細(xì)胞種類：人細(xì)胞種類：人HeLa細(xì)胞傳代培養(yǎng)；細(xì)胞傳代培養(yǎng)；2.培養(yǎng)的天數(shù)：培養(yǎng)的天數(shù)：7d；3.放大倍速：倒置顯微鏡放大倍速：倒置顯微鏡 X200；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：DMEM+10%小牛血清；小牛血清；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈多角形，貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞

34、狀態(tài)與特征簡(jiǎn)述：細(xì)胞呈多角形，貼壁生長(zhǎng)。 K562細(xì)胞細(xì)胞1.細(xì)胞種類：細(xì)胞種類：K562（人慢性紅白血病細(xì)胞株）；（人慢性紅白血病細(xì)胞株）；2.培養(yǎng)的天數(shù)：傳代后培養(yǎng)的天數(shù)：傳代后2天；天；3.放大倍數(shù)：倒置顯微鏡放大倍數(shù)：倒置顯微鏡 X10；4.培養(yǎng)基種類：培養(yǎng)基種類：RPMI1640+10%胎牛血清，胎牛血清，4mM Glutamine；5.細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)介：懸浮生長(zhǎng)，少數(shù)貼壁，喜愛成團(tuán)懸浮。細(xì)胞狀態(tài)與特征簡(jiǎn)介：懸浮生長(zhǎng)，少數(shù)貼壁，喜愛成團(tuán)懸浮。 每代貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程每代貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程w游離期游離期w貼壁期貼壁期w潛伏期潛伏期w對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期w停止期（平臺(tái)期）停止期（平臺(tái)期

35、）w游離期游離期 懸浮，胞質(zhì)回縮，全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形。懸浮，胞質(zhì)回縮，全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形。w吸附期吸附期 貼附底物，一般貼附底物，一般24小時(shí)內(nèi)貼壁。小時(shí)內(nèi)貼壁。w潛伏期潛伏期 此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，基本無(wú)增殖。此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，基本無(wú)增殖。 細(xì)胞株潛伏期一般為細(xì)胞株潛伏期一般為624小時(shí)。小時(shí)。w對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn) 行實(shí)驗(yàn)研究。行實(shí)驗(yàn)研究。w停止期（平臺(tái)期）停止期（平臺(tái)期） 細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂 機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性機(jī)制：接觸抑制、密度依賴

36、性根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn)，傳代方法有3 3種：種：1 1懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 離心法傳代：離心（離心法傳代：離心（10001000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分分）去上清，沉淀物加新）去上清，沉淀物加新 培養(yǎng)液后再混勻傳代。培養(yǎng)液后再混勻傳代。 2 2半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（半懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代（HelaHela細(xì)胞）細(xì)胞） 此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用此類細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用 直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。直接吹打法使細(xì)胞從瓶壁脫落下來(lái)，進(jìn)行傳代。3 3貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代 采用酶消化法傳代。采用酶消化法傳代。 常

37、用的消化液有常用的消化液有0.250.25的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。細(xì)胞傳代方法細(xì)胞傳代方法首次傳代注意事項(xiàng)首次傳代注意事項(xiàng)w細(xì)胞生長(zhǎng)密度不高時(shí)，不能急于傳代細(xì)胞生長(zhǎng)密度不高時(shí)，不能急于傳代 w原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時(shí)間原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時(shí)間 w吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機(jī)械損傷吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機(jī)械損傷 w首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些首次傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些 w首次傳代培養(yǎng)的首次傳代培養(yǎng)的pH應(yīng)偏低些應(yīng)偏低些 w小牛血清濃度可加大至小牛血清濃度可加大至15%20%左右左右 細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)w計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示w細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同w血細(xì)胞計(jì)數(shù)

38、器：手工計(jì)數(shù)細(xì)胞wCoulter計(jì)數(shù)儀：人工計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)步驟細(xì)胞計(jì)數(shù)步驟w1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。w2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。之間。w3、靜置、靜置3分鐘。分鐘。w4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)。、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)。細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)/ml4大格細(xì)胞總數(shù)大格細(xì)胞總數(shù)/ 4104注意注意：壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。：壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。 鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算

39、，若細(xì)鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占胞團(tuán)占10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞活力測(cè)定w細(xì)胞活力：細(xì)胞活力： 總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比w由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過(guò)程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。解分離的過(guò)程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。w復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。蘇的效果。測(cè)定方法測(cè)定方法w臺(tái)盼藍(lán)法 活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色。w流式細(xì)胞儀 細(xì)胞活性指標(biāo)

40、通常包括細(xì)胞膜對(duì)核酸染料的通透性，代謝活性，膜電位等。 3四唑鹽（MTT）比色法w四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán)；wMTT比色法的原理： 活細(xì)胞中琥珀脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臢 （formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。 二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm處產(chǎn)生吸收值，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值；細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞凍存和復(fù)蘇w細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：細(xì)胞深低溫保存的基本原理是： 在在70以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長(zhǎng)期保存。即代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長(zhǎng)期保存。w細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵：細(xì)胞低溫