《宏基因組高通量測序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原檢測中國專家共識》（2021）要點匯總

1、宏基因組高通量測序技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病病原檢測中國專家共識（2021）要點   感染性疾病一直備受臨床關(guān)注。新型冠狀病毒肺炎全球大流行，給世界經(jīng)濟和人類健康帶來嚴峻挑戰(zhàn)，更讓病原的精準快速檢測成為關(guān)注的熱點。近年來，因物價、政策等方面的靈活性，獨立實驗室已廣泛開展基于高通量測序（也稱新一代測序技術(shù)， NGS）的病原學檢測實驗。NGS技術(shù)應(yīng)用的成功案例，對部分感染性疾病的病原學診斷起到?jīng)Q定性作用。然而目前，臨床對NGS應(yīng)用的適應(yīng)證認識不足，送檢存在較大的盲目性和隨意性；操作過程復雜，缺乏規(guī)范；提供檢驗的主體多元而檢測質(zhì)量良莠不齊；結(jié)果解釋缺乏可信的標準，誤導臨床的案例屢見不鮮

2、，限制了該技術(shù)的臨床應(yīng)用和普及。一、共識制定過程二、分類和術(shù)語（一）分類宏基因組高通量測序技術(shù)（mNGS）通過對臨床樣本的DNA或RNA進行鳥槍法測序，可以無偏倚地檢測多種病原微生物（包括病毒、細菌、真菌和寄生蟲）。二代和三代測序平臺均可用于該項技術(shù)。按從臨床樣本中提取的核酸類型可以分為宏基因組測序和宏轉(zhuǎn)錄組測序。按照測序模式可以分為單端測序和雙端測序。（二）術(shù)語和定義NGS：也稱高通量測序，是一種可以同時對數(shù)十萬到數(shù)百萬條DNA分子序列進行讀取的測序技術(shù)。mNGS：m指宏基因組，也稱元基因組，是標本中全部生物（人、微生物）基因組的總稱。診斷宏基因組學：指用于臨床診斷目的的宏基因組學。臨床宏基

3、因組學：含義與診斷宏基因組學類似，但應(yīng)用場景更為廣泛。微生物組：指某一個系統(tǒng)、生態(tài)環(huán)境或特定區(qū)域中全部微生物的總和。試劑盒基因組：游離脫氧核糖核酸（cfDNA）：讀長：文庫：比對：深度：覆蓋率：相對豐度：Q值：標定對照：無模板對照：檢出限（LOD）：正常無菌部位：三、mNGS技術(shù)應(yīng)用于感染性疾病的適應(yīng)證（一）臨床適應(yīng)證共識1   對常規(guī)微生物學檢查容易明確病原體的感染，如尿路感染通過尿培養(yǎng)手段，不建議mNGS。共識2   患者表現(xiàn)為發(fā)熱或發(fā)熱癥候群，病因未明確（符合不明原因發(fā)熱定義），考慮感染或不除外感染，但規(guī)范性經(jīng)驗抗感染治療無效，考慮應(yīng)用常規(guī)技術(shù)檢測

4、的同時，或在其基礎(chǔ)上，開展mNGS。共識3   各種原因?qū)е禄颊呒蔽Ｖ匕Y表現(xiàn)，不除外感染所致，或考慮繼發(fā)或并發(fā)危及生命的嚴重感染，建議常規(guī)檢測的同時，或在常規(guī)檢測基礎(chǔ)上，開展mNGS。共識4   免疫受損患者疑似繼發(fā)感染，常規(guī)病原學檢查未能明確致病原或/和規(guī)范性經(jīng)驗抗感染治療無效，建議進一步完善常規(guī)病原學檢測的同時，或在其基礎(chǔ)上，開展mNGS。共識5   疑似局部感染，病原學診斷未明確、不及時處理則后果嚴重（危及生命或會導致局部功能不可逆性喪失）時，考慮常規(guī)檢測的同時，或在其基礎(chǔ)上，開展 mNGS。如眼部（角膜炎/潰瘍、眼內(nèi)炎、急性視

5、網(wǎng)膜壞死等）、鼻部、耳部、喉部感染、糖尿病足、外傷累及深部組織等情況。共識6   高度疑似感染性疾病，但病原學診斷未明確且常規(guī)抗感染治療無效，建議進一步完善常規(guī)病原學檢測、處理原發(fā)感染灶（如拔去導管、外科引流或拔去引流管、玻璃體切除）、調(diào)整經(jīng)驗抗微生物治療方案的同時開展mNGS。共識7   慢性感染，或慢性疾病不除外感染，尤其是二者臨床表現(xiàn)相似、難以鑒別時，病情嚴重或抗感染治療療效不佳需要明確病因，建議在完善常規(guī)檢測、調(diào)整經(jīng)驗治療的同時開展mNGS。共識8   除以上共識27之外的患者人群，不建議無條件普遍進行mNGS檢測；進行mNG

6、S 檢測前請感染病學和/或臨床微生物學專家會診。共識9   不建議應(yīng)用mNGS技術(shù)評估抗感染治療效果。（二）微生物學適應(yīng)證共識10   針對微生物，考慮出現(xiàn)疑似新發(fā)病原體，或某特殊病原體，缺乏傳統(tǒng)技術(shù)或傳統(tǒng)技術(shù)手段不能確定種屬時，建議常規(guī)檢測的同時，或在其基礎(chǔ)上，開展mNGS。共識11   臨床表現(xiàn)高度懷疑感染性疾病而多種傳統(tǒng)技術(shù)反復檢測不能明確致病微生物，但仍高度懷疑微生物所致，建議繼續(xù)完善更多檢測技術(shù)的同時或在其基礎(chǔ)上，開展mNGS。共識12   傳統(tǒng)病原學檢測的結(jié)果不能解釋臨床表現(xiàn)的全貌或/和抗感染治療的反應(yīng)

7、，懷疑同時存在其他病原感染時，建議進一步完善更多檢測技術(shù)的同時或在其基礎(chǔ)上，開展mNGS。共識13   感染性疾病的病原體已明確或高度懷疑某病原體，臨床表現(xiàn)提示該病原體可能具有特殊的毒力表型，需要了解其毒力因子的相關(guān)信息時，可以考慮對感染相應(yīng)臨床標本進行mNGS物種鑒定的同時，采用mNGS檢測毒力基因。（三）耐藥學適應(yīng)證共識14   感染發(fā)生在正常有微生物定植的部位，或檢測標本采集有污染時（如支氣管肺泡灌洗液），不建議采用mNGS進行耐藥性檢測。共識15   感染發(fā)生在正常無微生物定植的部位且標本采集過程污染概率低時，可以考慮采用mN

8、GS進行物種鑒定的同時檢測耐藥基因，并通耐藥表型試驗對耐藥基因進行驗證。對有菌種特異性的耐藥性基因，在測序深度足夠時，可以考慮應(yīng)用 mNGS 檢測獲得性的耐藥基因，預測耐藥表型。（四）流行病學和感染控制學適應(yīng)證共識16   出現(xiàn)某種疾病的聚集性發(fā)病或暴發(fā)，懷疑是微生物導致的感染性疾病但病原不明，且常規(guī)快速檢測無結(jié)果時，建議完善常規(guī)檢測的同時或在其基礎(chǔ)上開展mNGS明確致病微生物。共識17   感染性疾病患者有特殊區(qū)域（如北美地區(qū)有某些致病性真菌）旅居史，或有特殊職業(yè)工作史（如畜牧業(yè)、屠宰業(yè)、水產(chǎn)業(yè)等），感染病原未明，建議常規(guī)手段檢測的同時開展mNGS。四

9、、mNGS的基本流程和管理要求（一）標本采集共識18   從正常無菌部位采集mNGS檢測標本，應(yīng)嚴格無菌操作，避免污染；從有菌定植或污染部位采集的標本，應(yīng)采取必要措施，盡量減少污染；用于宏基因組RNA測序的標本，應(yīng)添加核酸穩(wěn)定劑。mNGS標本的運送須防污染、防震蕩、冷鏈快速運送；標本如不能及時檢測，應(yīng)保存于低于-70 冰箱或液氮（血液標本應(yīng)分離血漿后保存）。建議的常用臨床標本采集要求和相關(guān)說明見表1。（二）DNA/RNA提取共識19   建議實驗室的核酸提取流程、病原體核酸提取試劑盒應(yīng)經(jīng)過驗證；高宿主背景標本提取時應(yīng)采用經(jīng)過驗證的方法去除宿主細胞或核酸；

10、整個提取過程必須有防污染措施，包括陰性對照和陽性對照等。（三）建庫和測序共識20   建議采用經(jīng)過驗證的流程進行建庫和測序；建庫慎用各種擴增方法，因為擴增會使正常菌群或污染病原體的序列擴大，難以判斷真正病原體；測序原始數(shù)據(jù)應(yīng)進行質(zhì)控，并且過濾掉低復雜度、低質(zhì)量的序列，確保測序原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量。（四）生物信息學分析共識21   建議生物信息學分析流程應(yīng)進行性能確認和驗證，包括數(shù)據(jù)庫的優(yōu)化、比對方法和比對參數(shù)的優(yōu)化等，確保準確報告致病病原體。五、mNGS應(yīng)用于感染性疾病病原診斷的質(zhì)量管理保證（一）特殊病原體的DNA/RNA提取技術(shù)要求共識22  &#

11、160;建議病毒核酸提取應(yīng)保證病毒核酸的完整性；對于細胞壁較厚的病原體應(yīng)采取常規(guī)方法以外的破壁方法。（二）標本采集、DNA/RNA提取、建庫引入的實驗室污染問題共識23   污染既包括標本采集、核酸提取、建庫測序引入的污染，也包括生物信息學分析引入的污染；建議實驗室自建有效的防污染策略，包括使用背景微生物庫的方法。（三）測序深度對結(jié)果的影響共識24   建議實驗室驗證不同標本、不同感染類型病原體檢測所需的測序深度。（四）生物信息學分析結(jié)果中疑似背景微生物對病原診斷結(jié)果的影響共識25   建議實驗室建立自己的背景微生物數(shù)據(jù)庫以控制假陽性

12、結(jié)果。（五）病原診斷閾值的設(shè)定共識26   考慮建立mNGS的診斷閾值以排除背景微生物的干擾、改善檢測結(jié)果的準確性。（六）數(shù)據(jù)庫對病原學診斷結(jié)果的影響共識27   建議實驗室驗證自建的數(shù)據(jù)庫中物種的準確性，過濾數(shù)據(jù)庫錯誤和不正確的序列，并定期更新數(shù)據(jù)庫。實驗室應(yīng)盡最大可能完善病毒、真菌和寄生蟲數(shù)據(jù)庫，提高鑒定的敏感性和準確性。六、mNGS應(yīng)用于感染性疾病病原診斷的性能驗證和標準化共識28   對mNGS整個檢測和分析流程進行性能驗證是其應(yīng)用于臨床的瓶頸，建議對感染性疾病常見的“代表性”物種進行檢出限、包容性、抗干擾、精密度、攜帶和交叉

13、污染、穩(wěn)定性等的驗證。七、mNGS應(yīng)用于感染性疾病的報告解讀共識29   解讀報告考慮如下參數(shù)：測序質(zhì)量（是否去除低復雜度、低質(zhì)量序列，Q20、Q30等）、讀長、特異性讀長、覆蓋率、深度、豐度、微生物序列的數(shù)據(jù)量、閾值等。共識30   mNGS檢測報告中，建議結(jié)合不同標本類型與檢出病原微生物的種類進行解讀，區(qū)分無菌部位（血、無菌體液、組織、骨髓等）與正常有菌部位（如呼吸道、尿液、開放性傷口）。確認致病微生物時，應(yīng)考慮檢出微生物是否為感染部位的潛在病原。如腦脊液檢出新型隱球菌，呼吸道標本檢出結(jié)核分枝桿菌、腺病毒、流感病毒，關(guān)節(jié)液或血液標本檢出布魯菌屬，均可

14、認為是致病微生物。注意排除常見定植菌、污染菌與工程菌的影響。共識31   血漿樣本對cfDNA進行mNGS檢測時，建議從臨床的角度鑒別檢出序列屬于致病微生物、樣本污染、死亡微生物裂解，還是定植菌群所致的一過性菌血癥。共識32   mNGS 報告中常規(guī)容易培養(yǎng)的病原菌，建議臨床醫(yī)師結(jié)合傳統(tǒng)方法，綜合判斷其臨床價值。共識33   建議對于在核酸提取過程中破壁困難的微生物，如分枝桿菌屬、諾卡菌屬、真菌（主要包括曲霉菌、毛霉菌、隱球菌屬與雙相真菌）等，即使在檢測報告中讀長數(shù)較低，也要考慮其為致病微生物的可能，并采用其他方法驗證，如特異引物的P

15、CR或一代測序等分子生物學檢測，G試驗，GM試驗，曲霉菌IgG抗體或隱球菌莢膜多糖抗原等血清學試驗。共識34   采用 mNGS進行病原微生物鑒定的同時，可以考慮檢測耐藥基因，但需要將耐藥基因準確定位到具體的病原體上以明確其臨床價值。即通過對mNGS測得序列進行具體病原體基因組組裝之后，確定耐藥基因位于哪個病原體上，位于質(zhì)粒上還是位于染色體上。共識35   mNGS對于新發(fā)或少見病原微生物的檢出具有重要價值。建議解讀報告單前應(yīng)了解比對數(shù)據(jù)庫的內(nèi)容，明確其是否涵蓋少見病原或新發(fā)病原。檢出高致病性病原微生物，應(yīng)及時與臨床聯(lián)系。共識36   

16、;mNGS結(jié)果為陰性，對于排除感染常具有較好的陰性預測值。但對于某些病原微生物，如結(jié)核分枝桿菌等，原始樣本中含量較少，或核酸提取困難的病原微生物，應(yīng)考慮mNGS檢測靈敏度較低，陰性預測性差，并不一定優(yōu)于PCR等常規(guī)檢測方案。共識37   建立mNGS病原診斷的閾值影響因素較多，包括測序平臺、測序流程、標本類型、病原種類、患者狀況，目前尚無統(tǒng)一公認的閾值，建議各實驗室建立自已的閾值，并在臨床工作中加以驗證。共識38   不同病原微生物讀長對結(jié)果判斷的影響：同等條件下（相同微生物，相同標本），如某一微生物檢出的讀長數(shù)量多，為致病微生物的可能性大。但是，不同病原微生物基因組大小不同（寄生蟲>真菌>細菌>病毒），核酸提取效率存在差異難易程度：病毒<革蘭陰性菌<革蘭陽性菌（不包括分枝桿菌、需氧放線菌等）<真菌，致病力也相去甚遠，因此不能僅僅依靠讀長多少來判斷是否感染，建議同時考慮病原