酶工程-動植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶

1、酶工程-動植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶l概述動物細(xì)胞l無細(xì)胞壁，容易貼壁l對營養(yǎng)要求嚴(yán)格（血清培養(yǎng)基）l對環(huán)境敏感（pH、溶氧、溫度、剪切應(yīng)力）植物細(xì)胞l有細(xì)胞壁，但比微生物的細(xì)胞壁脆弱l營養(yǎng)要求較動物細(xì)胞簡單l生長緩慢，培養(yǎng)周期長，要達(dá)到高密度較困難l概述植物細(xì)胞、動物細(xì)胞、微生物細(xì)胞培養(yǎng)的比較l概述植物細(xì)胞與動物細(xì)胞、微生物細(xì)胞培養(yǎng)的比較l動物細(xì)胞、植物細(xì)胞和微生物細(xì)胞可以用相同方式培養(yǎng)l動物細(xì)胞、植物細(xì)胞的生產(chǎn)周期比微生物長l植物細(xì)胞和動物細(xì)胞對剪切力敏感l(wèi)植物、微生物和動物細(xì)胞的主要目的產(chǎn)物各不相同 動物細(xì)胞 蛋白疫苗、抗體、激素、酶（蛋白質(zhì)或多肽） 植物細(xì)胞 色素、香精、天然藥物（小分子）、酶l

2、本章主要內(nèi)容動植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶l植物細(xì)胞及其培養(yǎng)特點l植物細(xì)胞培養(yǎng)及產(chǎn)酶的工藝控制動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶l動物細(xì)胞及其培養(yǎng)特點l動物細(xì)胞培養(yǎng)及產(chǎn)酶的工藝控制l動植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)從基因到蛋白質(zhì)有關(guān)微生物細(xì)胞中酶合成的調(diào)節(jié)理論也基本適用于動植物細(xì)胞動植物細(xì)胞具有比微生物更多的調(diào)節(jié)方式l轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)l翻譯水平調(diào)節(jié)DNA RNA Protein Active Enzyme轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄逆逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄復(fù)復(fù)制制翻翻譯譯？折折疊疊l動植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)細(xì)胞分化改變酶的生物合成 端粒（telomere）l端粒是真核生物染色體的末端結(jié)構(gòu)l由富含 G、T 的 DNA 簡單重復(fù)序列不斷

3、重復(fù)而成 人端粒序列：TTAGGGl保護(hù)真核生物染色體免遭破壞 犧牲自我，填補(bǔ) DNA 復(fù)制后在 5-端留下的空隙 端粒隨細(xì)胞年齡的增長而逐漸縮短l端粒酶（telomerase） 催化端粒合成和延長 核糖核蛋白，其中的 RNA 部分含核苷酸模板序列，可構(gòu)建端粒重復(fù)序列 端粒酶一般存在于分化程度較低的細(xì)胞中l(wèi)動植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)基因擴(kuò)增加速酶的合成l通過增加基因的數(shù)量調(diào)節(jié)基因表達(dá)，可以發(fā)生在個體發(fā)育某一階段或細(xì)胞分化某一過程l細(xì)胞的一種應(yīng)急方式l基因擴(kuò)增可以由 引起 耐藥性細(xì)胞的抗藥性產(chǎn)生 例：CHO 細(xì)胞為對抗氨甲基喋呤對二氫葉酸還原酶的抑制，編碼這種酶的基因急劇擴(kuò)增l動植物細(xì)胞中酶生

4、物合成的調(diào)節(jié)增強(qiáng)子促進(jìn)酶的生物合成l增強(qiáng)子（modulator） 能高效增強(qiáng)或促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA 序列l(wèi)增強(qiáng)子能促進(jìn)同源或異源啟動基因的轉(zhuǎn)錄活性，可高效增強(qiáng)某些酶基因的表達(dá)l具有細(xì)胞或組織特異性，在不同細(xì)胞或組織中增強(qiáng)效果不同l動植物細(xì)胞中酶生物合成的調(diào)節(jié)抗原誘導(dǎo)抗體酶的生物合成l抗體酶（abzyme）：催化性抗體，是具有生物催化功能的抗體分子，是人工改造的對抗體可變區(qū)賦予催化特性的特殊抗體l修飾法 在抗體與抗原結(jié)合部位引進(jìn)催化基團(tuán)l誘導(dǎo)法（主要方法） 半抗原誘導(dǎo) 酶蛋白誘導(dǎo)l植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶1902 年，Haberlandt 首次提出分離植物單細(xì)胞并培養(yǎng)成植株的設(shè)想植物細(xì)胞的全能性l植

5、物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶種類l植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)l植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶植物細(xì)胞的主要特點l體積較大：比動物細(xì)胞和微生物細(xì)胞都大l細(xì)胞生長速率和代謝速率低于微生物細(xì)胞，l營養(yǎng)要求較動物細(xì)胞簡單l細(xì)胞生長及合成次級代謝產(chǎn)物需要條件l主要用于產(chǎn)天然產(chǎn)物、色素、香精等有機(jī)物（次級代謝物）l植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶植物細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)勢l提高目標(biāo)物的產(chǎn)率l縮短生產(chǎn)周期 木瓜蛋白酶：木瓜生長期 8 個月，木瓜細(xì)胞培養(yǎng)約 1 個月l易于管理，不受自然因素控制l可以提高產(chǎn)物質(zhì)量 通過嚴(yán)格的培養(yǎng)條件控制，減少植株病蟲害和污染缺點l培養(yǎng)條件要求高 光照、剪切力影響顯著l植物細(xì)胞生長緩慢 相對于微生物l植物細(xì)胞培養(yǎng)

6、產(chǎn)酶植物體外培養(yǎng)l胚培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)l植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶植物細(xì)胞培養(yǎng) 外植體選擇和處理l外植體（explant） 從植株取出，經(jīng)預(yù)處理后用于組織和細(xì)胞培養(yǎng)的植物組織片段或小塊 根、莖、葉、芽、花、果實、種子等l選擇：無病蟲害、生長旺盛、生長有規(guī)則l切片：1 cml消毒 70% 乙醇 5% 次氯酸鈉 / 10% 漂白粉 0.1% HgCl2l植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶植物細(xì)胞培養(yǎng) 獲取植物細(xì)胞：直接分離法l直接分離法即直接從外植體中分離l機(jī)械法 將外植體搗碎，過濾或離心分離細(xì)胞 質(zhì)壁未分離；，完整細(xì)胞數(shù)量少l酶解法 利用果膠酶、纖維素酶等處理外植體，分離具有代謝活性的細(xì)胞 能降解細(xì)胞壁

7、，必須對細(xì)胞給予l植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶植物細(xì)胞培養(yǎng) 獲取植物細(xì)胞：愈傷組織誘導(dǎo)法 由外植體組織增生的細(xì)胞產(chǎn)生的團(tuán)狀不定型的的群體 本意是指植物體的局部受到創(chuàng)傷刺激后，在傷口表面新生的可幫助傷口愈合的組織l誘導(dǎo)過程 配制半固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基 滅菌、植入外植體 13周后繼代培養(yǎng)l植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶植物細(xì)胞培養(yǎng) 獲取植物細(xì)胞：原生質(zhì)體再生法l一般采用酶解法分離原生質(zhì)體，使用和混合物l保持溶液的 狀態(tài) 防止原生質(zhì)體脹裂 滲透壓穩(wěn)定劑：糖、鹽、甘露醇、山梨醇等l原生質(zhì)體培養(yǎng)，再生細(xì)胞壁l植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶植物細(xì)胞培養(yǎng) 懸浮培養(yǎng)l將游離的單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)按照一定的細(xì)胞密度懸浮在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的方法l懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞

8、一般來源于愈傷組織，選擇較松散的為宜植物細(xì)胞培養(yǎng) 產(chǎn)物分離純化l收集培養(yǎng)液，從中獲得所需的產(chǎn)物l植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶植物細(xì)胞培養(yǎng)基l水：一般用去離子水或蒸餾水l無機(jī)成分 大量元素：N、P、K、Ca、Mg、S 微量元素：Fe、B、Mn、Zn、Cu、Mo、Col有機(jī)成分 碳源：糖，以 最常用 氮源：氨基酸（Gly、Ala、Ser、Cys）及蛋白水解物、無機(jī)氮 維生素：主要是 B 族維生素和維生素 C 其他：肌醇、瓊脂等l植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶常用的植物細(xì)胞培養(yǎng)基lMS 培養(yǎng)基 硝酸鹽濃度較高，營養(yǎng)成分適宜，使用范圍廣lB5 培養(yǎng)基 NH4+ 濃度較低，適用于雙子葉木本植物lWhite 培養(yǎng)基 無機(jī)鹽濃度低，

9、高M(jìn)g(II)、B(III)，適用于生根培養(yǎng)lKM-8P 培養(yǎng)基 有機(jī)成分種類齊全，用于原生質(zhì)體培養(yǎng)培養(yǎng)基配制l配制母液，使用時按需要稀釋l植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶工藝條件及其控制（掌握要點，與微生物對比）l溫度 室溫范圍（25 oC左右） 最適產(chǎn)酶溫度和最適生長溫度不同lpH 微酸性（pH 56） 細(xì)胞培養(yǎng)時，pH一般變化不大l溶解氧 植物細(xì)胞，供氧不宜過量 對剪切力敏感，通風(fēng)攪拌不宜太劇烈l植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶工藝條件及其控制 光照對植物細(xì)胞的生長和產(chǎn)物合成具有重要影響（植物特色） 光照有時也抑制產(chǎn)物合成l添加前體 前體：處于目的代謝物代謝途徑上游的物質(zhì) 添加前體相對于添加了反應(yīng)的底物l刺激劑（ele

10、ctor） 引導(dǎo)物質(zhì)朝特定的代謝方向進(jìn)行，強(qiáng)化次級代謝產(chǎn)物的生物合成 常用微生物細(xì)胞壁碎片和胞外酶l植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶產(chǎn)酶實例 大蒜細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn) SODl超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD，） 生物體內(nèi)清除超氧化物陰離子自由基（O2-）的重要金屬酶類 SOD 和過氧化氫酶 (catalase)、過氧化物酶 (peroxidase，POD) 一起構(gòu)成了生物體內(nèi)重要的酶促反應(yīng)防御體系，從而維護(hù)生物體內(nèi)細(xì)胞正常的生理代謝和生化反應(yīng)l植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶產(chǎn)酶實例 大蒜細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn) SODl大蒜愈傷組織的誘導(dǎo) 選取結(jié)實、飽滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，去除外皮 先用 70% 乙醇消毒 20

11、 s，再用 0.1% 升汞消毒 10 min，然后無菌水漂洗 3 次 在無菌條件下，切成 0.5 cm3 的小塊，植入含有 3 mg/L 2,4-D 和 1.2 mg/L 6-BA 的半固體 MS 培養(yǎng)基中 25 oC，600 lux，12 h/d 光照條件下培養(yǎng) 18 天，誘導(dǎo)得到愈傷組織，每 18 天繼代一次l植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶產(chǎn)酶實例 大蒜細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn) SODl大蒜細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 將上述在半固體 MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng) 18 天的愈傷組織，在無菌條件下轉(zhuǎn)入含有 3 mg/L 2,4-D 和 1.2 mg/L 6-BA 的液體 MS 培養(yǎng)基中，加入滅菌的玻璃珠，25 oC，600 lux，12 h/

12、d 光照條件下振蕩培養(yǎng) 1012 天，使愈傷組織分散成為小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞 無菌條件下，經(jīng)過篩網(wǎng)將小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有 3 mg/L 2,4-D 和 1.2 mg/L 6-BA 的液體 MS 培養(yǎng)基中，25 oC，600 lux，12 h/d 光照條件下，振蕩培養(yǎng) 18 天lSOD 分離純化 收集細(xì)胞，破碎，用 pH 7.8 磷酸鹽緩沖液提取l動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶1907年，Harrison 開創(chuàng)了動物組織培養(yǎng)的先河l從蝌蚪的脊索中分離出神經(jīng)組織，放在青蛙的凝固的淋巴液中培養(yǎng)，蝌蚪的神經(jīng)組織存活了數(shù)周，并且從神經(jīng)細(xì)胞中長出了神經(jīng)纖維1950s，Earle 用動物細(xì)胞培養(yǎng)制取病毒疫苗1967年，動

13、物細(xì)胞貼壁培養(yǎng)微載體開發(fā)1975年，雜交瘤技術(shù)動物細(xì)胞可產(chǎn)生較高價值的物質(zhì)l激素、疫苗、單克隆抗體、酶l動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細(xì)胞結(jié)構(gòu)l動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細(xì)胞特性，細(xì)胞脆弱（區(qū)別于植物和微生物），比微生物細(xì)胞大幾千倍，但稍小于植物細(xì)胞l在肌體內(nèi)相互，以群體形式存在l在培養(yǎng)時具有群體效應(yīng)、接觸抑制性、功能全能性l營養(yǎng)要求復(fù)雜（培養(yǎng)基）血清l動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細(xì)胞培養(yǎng)的特點l主要用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)l生長緩慢l容易受污染（細(xì)菌、支原體），培養(yǎng)過程中需添加抗生素（胞外缺少保護(hù)結(jié)構(gòu)）l大部分具有貼壁依賴性 l培養(yǎng)基成分復(fù)雜，價格高昂l細(xì)胞生命有限，一般最多繼代培養(yǎng) 50 代即退化死亡l動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物

14、細(xì)胞培養(yǎng)方式 懸浮培養(yǎng)l適用于非貼壁依賴型細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、體液（血液、淋巴液）細(xì)胞l類似于微生物細(xì)胞的深層發(fā)酵，但工藝條件有較大差別 對通氣、攪拌耐受性差 對氧氣的要求較微生物低，培養(yǎng)時需通入一定比例 l優(yōu)點（相對于貼壁培養(yǎng)） 細(xì)胞在培養(yǎng)液中均勻分散，生長情況良好 傳代培養(yǎng)容易，無需消化分散細(xì)胞 培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分利用率高l動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細(xì)胞培養(yǎng)方式 貼壁培養(yǎng)l適用于貼壁依賴型細(xì)胞 上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞 細(xì)胞在培養(yǎng)容器表面迅速鋪展并分裂l滾瓶培養(yǎng)系統(tǒng) 結(jié)構(gòu)簡單，但l微載體培養(yǎng)系統(tǒng) 由葡聚糖凝膠等聚合物制得的微球 兼具單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢 細(xì)胞生長環(huán)境均一l動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細(xì)胞培養(yǎng)方

15、式 固定化培養(yǎng)l貼壁或非貼壁依賴型細(xì)胞均適用l吸附法 載體為多孔性顆粒，如陶瓷顆粒、玻璃珠及硅膠顆粒即屬此類l包埋法 將細(xì)胞包埋于瓊脂、瓊脂糖、膠原及血纖維等海綿狀基質(zhì)中 細(xì)胞不易脫落l固定化培養(yǎng)優(yōu)點 細(xì)胞損傷程度低，可重復(fù)使用 產(chǎn)物分離容易l動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細(xì)胞培養(yǎng)過程l種質(zhì)細(xì)胞 體細(xì)胞（動物體內(nèi)組織取出） 雜交瘤細(xì)胞l基本工藝過程l動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細(xì)胞培養(yǎng)基l氨基酸：必需氨基酸，如 等，作為碳源和能源利用l維生素：B 族和維 C，可由 提供l無機(jī)鹽：調(diào)節(jié)l微量元素：Fe、Cu、Zn 等，可由血清提供l葡萄糖：作為碳源和能源（易產(chǎn)生乳酸）l激素：胰島素、生長激素、甾體激素等，可由血清

16、提供l生長因子：如表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、成纖維細(xì)胞生長因子等，一般來源于血清培養(yǎng)基配制l配制母液，使用前過濾除菌、稀釋；Gln 單獨配制，冷凍保存l動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制l溫度 影響細(xì)胞生長，哺乳動物細(xì)胞：36.50.25 oC 影響 溶解度，從而影響培養(yǎng)液 值 保持細(xì)胞內(nèi)外等滲狀態(tài)，一般 700850 kPal溶解氧 供氧不足：細(xì)胞生長受抑制 過量供氧：容易產(chǎn)生較多氧自由基，殺傷細(xì)胞 用代替空氣（空氣、O2、N2、）l動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制lpH 值與 CO2 濃度 動物細(xì)胞培養(yǎng)液 pH 在 7.6 之間，以 為最佳 最常用的緩沖體系為

17、動物細(xì)胞培養(yǎng)時缺少 CO2，培養(yǎng)液中的 HCO3- 會被耗盡； 通常 CO2 濃度維持在 210% 之間 指示劑：酚紅CO2 + H2O H+ + HCO3-l動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細(xì)胞培養(yǎng)的工藝條件及其控制lpH 值 HEPES 緩沖體系 HEPES：4-羥乙基哌嗪乙磺酸4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine-1-ethanesulfonic acid HEPES is a zwitter-ionic organic chemical buffering agent. HEPES is widely used in cell culture, largely becau

18、se it is better at maintaining physiological pH despite changes in carbon dioxide concentration (produced by cellular respiration) when compared to bicarbonate buffers, which are also commonly used in cell culture. HEPES is like water in that its dissociation decreases as the temperature decreases.

19、This makes HEPES a more effective buffering a g e n t f o r m a i n t a i n i n g e n z y m estructure and function at low temperatures.l動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶相關(guān)問題 為什么培養(yǎng)的細(xì)胞要及時傳代l傳代培養(yǎng)：將原代培養(yǎng)的細(xì)胞分離、稀釋并接種到新培養(yǎng)基上繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)的階段l體外培養(yǎng)的細(xì)胞大多具有的特性，也就是說當(dāng)一個細(xì)胞被其他細(xì)胞包圍的時候，它就會停止生長l當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)器皿表面時，正常細(xì)胞停止生長，但是轉(zhuǎn)化（即發(fā)生遺傳物質(zhì)突變）的、對接觸抑制不敏感的細(xì)胞會繼續(xù)生長l如果不及時傳代，這些，導(dǎo)致正常細(xì)胞的退化轉(zhuǎn)化的細(xì)胞就會逐步取代正常的細(xì)胞?l動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶產(chǎn)酶實例 人黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn) tPAlTissue plasminogen activator (abbr. tPA) is a protein involved in the breakdown of blood clots. It is a serine protease (EC 3.4.21.68) found on