抗體工程對于腫瘤的治療_第1頁
抗體工程對于腫瘤的治療_第2頁
抗體工程對于腫瘤的治療_第3頁
抗體工程對于腫瘤的治療_第4頁
抗體工程對于腫瘤的治療_第5頁
已閱讀5頁,還剩8頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、抗體工程對于腫瘤的治療摘要:過去的20年單克隆抗體(mAbs)發(fā)展成為一種治療包括癌癥在內(nèi)的各種適應癥的主要療法。mAbs演化到癌癥治療的前沿,需要在隔離和優(yōu)化方面有著顯著的優(yōu)點。本章討論了促進這種演化的步驟,以及驅動治療癌癥的下一代單抗的標準。10.1引言在20世紀早期,Paul Ehrlich幻想能制造一種專門針對癌細胞且對健康的細胞無傷害的靶向治療劑。在過去的幾十年里,抗體工程的發(fā)展使得抗體治療領域從最初的使用嚙齒動物衍生抗體到今天用日益復雜的方法來生產(chǎn)和臨床測試包括癌癥在內(nèi)的超過66種的完全人類抗體?,F(xiàn)代分子生物學的發(fā)展為Ehrlich所想象的靶向單克隆抗體的生產(chǎn)開辟了路徑?,F(xiàn)在單抗是

2、發(fā)展最快的醫(yī)藥行業(yè)。美國食品和藥物管理局已經(jīng)批準了超過20種治療多種疾病的 mAbs,其中包括10種治療癌癥的藥物。這些相當于2009年200億美元的年收入。10.2 抗體結構癌癥治療的單抗是在體內(nèi)發(fā)揮作用的大的多區(qū)域蛋白(150kDa),他們的藥物代謝動力學PK和藥效學PD,在開發(fā)過程中由大量的變量引導的。在最基礎的層面上必須優(yōu)化目標腫瘤與人體免疫系統(tǒng)的聯(lián)系。目前所有對抗體治療藥物的批準是依賴自然發(fā)生的IgG的結構。IgG是由B細胞產(chǎn)生的最主要的同種型抗體。其雙邊對稱結構如圖10.1所示。兩個異二聚體,各包括一條重鏈和一條輕鏈,二聚成規(guī)范的Y字結構。酶法分析產(chǎn)物IgG得到三部分:兩個相同的抗

3、原結合片段(Fab)和恒定片段FC。這兩部分對定義體內(nèi)的mAb起到重要作用,在設計mAb 的時候一定要把每一部分考慮在內(nèi)。Fab被分成不變區(qū)和可變區(qū)??勺儏^(qū)包括重鏈可變區(qū)Vh和輕鏈可變區(qū),包括抗原結合部位。與特異性氨基酸組成的六個互補確定區(qū)域(CDRs)所定義。6個CDRs(3個來著重鏈,3個來自輕鏈)中的每一個CDRs在綁定過程中其到重要作用。重鏈的CDR3區(qū)常發(fā)揮重要作用。CH2、CH3組成的Fc區(qū)與IgG的半衰期和免疫學效應有關,如有針對的殺死細胞以及免疫清除。生物半衰期由位于內(nèi)皮細胞表面的新生兒的Fc受體控制。該受體可使IgG通過胎盤屏障。在成人中作為循環(huán)系統(tǒng)中IgG的救助recepe

4、tor。Fc介導ADCC作用、觸發(fā)補體級聯(lián)反應。IgG同型性抗原因為與FC區(qū)的不同結合而命名,且生物學效應不同。對影響體內(nèi)抗體的作用因子的認識越來越多,加上抗體工程技術的進步,使得抗體治療越加成熟。10.3降低抗體的免疫原性人類免疫系統(tǒng)可以識別并清除外源性蛋白。這同樣可以阻止生物療法,如單抗,在癌癥治療需要將更多的藥物存留在血清中。因此要開發(fā)能避開患者免疫系統(tǒng)的途徑。10.3.1最初的小鼠抗體早期用動物體內(nèi)的多克隆血清來治療患者的腫瘤碎片。1895年,Hericourt和Richet(1895)報告用抗血清來改進晚期癌癥患者的治療條件。然而小部分治療后出現(xiàn)副作用。1975年,科勒和米爾斯汀(1

5、975)用骨髓瘤細胞和B細胞融合產(chǎn)生了第一批單抗。對腫瘤相關抗原的定義及其在臨床使用如表10.1所示。由于這些小鼠抗體是外在蛋白,在臨床應用時出現(xiàn)HAMA反應。人抗鼠抗體HAMA分為抗同種異型性抗體和抗獨特型抗體??雇N異型性抗體是最常見的反應,專門針對鼠源抗體的Fc片段??躬毺匦涂贵w針對鼠源抗體的可變區(qū),可能會也可能不會結合到靶部位。HAMA反應的發(fā)展以及治療劑量和進度因癌癥類型差別很大,由于在病人血清預先存在抗球蛋白抗體。最近發(fā)現(xiàn)升級的HAMA在B細胞惡性腫瘤患者中存活時間較長。而大部分HAMA反應可以降低臨床反應。HAMA反應可以中和患者免疫系統(tǒng)的小鼠治療抗體。引發(fā)超敏反應??贵w工程用復

6、雜的方法生產(chǎn)人類生殖系列組成的抗體來降低HAMA反應增加免疫療法的療效。IgG的從鼠源抗體到完全人源抗體的分類如圖10.2所示。下面介紹這些抗體的產(chǎn)生及功能。10.3.2嵌合抗體人類抗體的恒定區(qū)與小鼠抗體的可變區(qū)結合。人類部分大概占70%。建立嵌合抗體標志著在臨床治療性抗體(表10.1;沙爾丹哈,2009)一個重大突破,該抗體可以抑制反同型HAMA反應,兩者都有抗癌活性并能增加其誘導抗腫瘤能力,免疫反應通過高親和力與Fc受體相互作用上,F(xiàn)c位于免疫效應細胞的表面(見下文)。盡管人類反嵌合抗體HACA也有記載,但其比HAMA更為罕見。反糖蛋白IIb / IIIa 7 e3小鼠Fab及其嵌合抗體阿

7、昔單抗(Reopro),在冠狀動脈程序作為一種血小板聚集抑制劑,該過程可以說明上述情況。將7E3轉化成阿昔單抗可以降低免疫反應,使其從1%降低到17%。盡管HACA概率低,可能不會抑制治療,但是曾經(jīng)有接觸過HACA抗體的,就妨礙了其進一步治療。CDRs區(qū)占總蛋白量的5-10%,通過生產(chǎn)的“人源化”的抗體其為優(yōu)化人類生殖細胞系治療性IgG提供可能。10.3.3人源化抗體治療癌癥藥物中4種人源化抗體被批準。CDR移植抗體策略:鼠源抗體mAb的CDRs區(qū)移植到人源抗體IgG框架上,在基因水平上生產(chǎn)約90-95%是人類基因的人源化抗體。需考慮一下三個方面:1)確定要移植的鼠源特定的CDR區(qū)。2)選擇合

8、適的人類基因框架3)識別CDR區(qū)以外的人類基因框架,這些區(qū)域有可能發(fā)生回復突變成鼠源對應的部分來恢復或改善抗體的親和力。10.3.3.1CDR區(qū)的選擇抗原抗體的晶體結構能夠使其容易識別結合的氨基酸。缺少晶體結構數(shù)據(jù)的情況下,共同研究了抗體的初級序列及CDR環(huán)有限集17或少于60。最近Dunbrack和她的同事通過分析300多種晶體結構數(shù)據(jù),精煉了CDR的結構和其預測結構。同種異型抗原是指來自同種生物而基因型不同的個體的抗原物質。如:人類紅細胞血型抗原及其組織相容性抗原等。 人類的同種異型抗原主要有:HLA抗原、ABO抗原、Ig的同種異型抗原、Rh抗原。103.3.3重塑抗體CDR環(huán)CDR移植抗

9、體作為鼠的CDR和人的框架之間的不兼容結果常表現(xiàn)出減弱的親和力。為了微調(diào)(?重塑?) 抗體CDR環(huán)的構象,在可變區(qū)框架內(nèi)(CDR環(huán)外)的額外的人類殘基可以“背突變?嵌合小鼠。雖然列入額外的小鼠殘基會增加免疫原性反應發(fā)生的風險,但是這些“背突變?可以大大恢復或提高抗體的親和力、特異性和表達。除了提供結構支撐,這些框架殘留也可能參與抗原結合??贵w的結構模型能夠指導選擇哪種框架殘基來進行背突變而曲妥單抗的設計就是很好的例子。把mu4D5的CDR接合到人IgG1的框架來創(chuàng)建hu4D5-1會產(chǎn)生一個與mu4D5相比近似80倍損失的親和力和80倍損失的抗增殖作用。背突變一系列的七個框架殘基到小鼠身上可以使

10、小鼠恢復生物活性并且增加超過hu4D5-1 250倍的親和力和超過其父輩mu4D5三倍的親和力。 設計、生產(chǎn)和測試每個預設計的突變體以增加親和力的過程可能是乏味的。然而,噬菌體展示提供了一個有效的替代。一個包含在所需位置的小鼠和人的殘基的抗體可變結構域的組合文庫可以創(chuàng)建和快速篩選較原來的人源化抗體增加了親和力的突變體。103.3.4重鋪可變結構域Padlan提出只有那些暴露在嵌合抗體表面的鼠殘基,而不是那些埋在折疊蛋白質疏水區(qū)的鼠殘基能夠引起HACA響應。為了防止B細胞活化和隨后的針對鼠可變結構域的體液免疫反應,Padlan采用了一種替換CDR移植的方法,被稱作“重鋪?或?鑲面”。在這種方法中

11、,只有暴露在溶劑中的小鼠可變結構域的嵌合抗體的表面殘基是人源化的。一個重鋪抗體應該對CDR環(huán)提供必要的結構性支持以增加獲得減弱的免疫原性的活性抗體的機會。一個關于抗體重鋪的綜合的草案在別處也被提到過。在體外比較CDR 移植和抗體重鋪,結果很類似。盡管目前沒有臨床上關于重鋪抗體的實驗數(shù)據(jù)來證實這一理論,但是帶有減少與患者血清反應和HAMA響應的重鋪抗體也被制作出來。所以重鋪治療性抗體也被預期有減少患者免疫原性的作用。即使有一個重鋪抗體,也有一個可能性,即在重鋪抗體核心的小鼠序列可能包含引起免疫應答的T細胞表位,而此細胞表位將會在抗體在細胞內(nèi)catabolised后呈遞。103.4去除T細胞表位即

12、使人類生殖系含量最大化,免疫反應可能仍然會出現(xiàn),這是由于短的線性肽的存在或位于抗原呈遞細胞表面存在于組織相容性復合物II類分子的背景下人源性抗體的構基序的存在。用抗原呈遞細胞描述這些肽能激活細胞(T-細胞)對單克隆抗體反應,多個基于硅的方法已被開發(fā),以確定T細胞表位,在努力地“deimmunize?單克隆抗體。其中一個這樣的方法就是拉卡爾等人所描述的。稱為人類字符串內(nèi)容(HSC)優(yōu)化。在這種方法中,人們測量那些在一個給定的單克隆抗體中的較保守的9個氨基酸的肽的字符串與那些在IMGT數(shù)據(jù)庫中人類生殖細胞的抗體中發(fā)現(xiàn)的那些較保守的9個氨基酸的肽的字符串進行比例測量。據(jù)推測,優(yōu)化此類生殖細胞抗體將減

13、少免疫原性,因為數(shù)據(jù)庫是由對人體免疫系統(tǒng)具有最低限度的免疫原性的抗體所組成的。以確保所確定的突變不影響抗體的結構完整性,HSC方法采用以序列和結構為基礎評分的方法,被稱為類似接觸環(huán)境法(ACE)。HSC和ACE被應用于四個與臨床上相關的鼠單克隆抗體上,工程化的衍生物有:抗-CD30單克隆抗體AC10(SGN-30),抗EGFR單克隆抗體225(西妥昔單抗),抗Her2/neu單克隆抗體4D5(曲妥珠單抗),和抗EpCAM的單克隆抗體17-1A(C17-1A). 新創(chuàng)建的抗體與嵌合抗體或人源化抗體相比改善了HSC,有的甚至在不需要親和力成熟的情況下比親本抗體對抗原有更高的親和力。 此前,消除存在

14、于抗體內(nèi)的潛在的免疫原性的T細胞表位需要新一代的進行了系統(tǒng)探討約束力的大型肽庫。然而在建模上的進展,如上面所述的方法一樣,允許高效的T細胞表位的鑒定,以及隨后的被氨基酸替換物所取代?;趯π∈笮蛄械难芯?,這種合理的工程方法已被用于開發(fā)三個完全人類抗體靶向CD25,血管內(nèi)皮生長因子和腫瘤壞死因子。這些人類抗體相當于那些孤立于轉基因小鼠和噬菌體展示的抗體,均表現(xiàn)有序列和綁定屬性在人源化抗體的設計時,常用的“最適合的”CDR-移植抗體的框架選擇方法,如上面所討論的是基于人受體構架和小鼠或嵌合供體框架的序列的全局相似度。目前正在開發(fā)建模的方法,通過確定其序列在人類保留劇目中的典型度來衡量一個潛在抗體的

15、“人性化”程度。迄今為止,這些方法的成功已被無法定義“人性化”和在臨床觀察到的免疫反應之間的相關性而限制。然而,由于我們對免疫系統(tǒng)的理解的不斷發(fā)展,努力設計新的建模方法是合理的。103.5人類抗體 在以人性化小鼠抗體的初始方法出臺后不久,以促進直接來自人類生殖序列的抗體隔離的技術也被開發(fā)出來。這些技術大致可分為兩種不同的方法:在體外組裝重組的人類抗體庫用于噬菌體展示型方法,并在體內(nèi)產(chǎn)生人類抗體并用轉基因小鼠的設計來編碼人的immunoglob球蛋白的重、輕鏈基因。FDA批準的完全人IgG分子已經(jīng)被這兩種方法開發(fā)出來,驗證其臨床效用。第三個方法,人類雜交瘤技術,是一個額外的隔離完全人的治療性抗體

16、的很有前途的方法。103.51噬菌體展示 除了有助于重塑人源化抗體的CDR環(huán)(如上面討論的),噬菌體顯示已成為一個功能強大的工具,創(chuàng)建完全的人類抗體,且在免疫系統(tǒng)中具有最高的親和力。這種方法的基礎在喬治·史密斯表示在絲狀噬菌體表面的多肽融合DNA編碼在編碼病毒衣殼蛋白的噬菌體基因的框架內(nèi)的多肽時被證明。通過耦合表型(在噬菌體表面表達的一種新的蛋白質)與基因型(分離DNA編碼的新型蛋白質的能力),該系統(tǒng)確保有大規(guī)模篩選抗體隔離方法。在4年的時間里, 第一個從噬菌體展示文庫中分離出的功能抗體來自于一只免疫小鼠。人V基因用捐贈者外周血的雜交瘤的細胞或B細胞采用聚合酶鏈反應(PCR)進行擴增

17、,導致了含有隨機結合的VH和VL片段大型函數(shù)庫的創(chuàng)建。這些庫被分為天然的(從非免疫捐助者)或免疫的(免疫捐助者,使抗體庫走向有一定特異度的抗體庫)。隨后,當單鏈Fv(SC-抗體)緊接著結合抗原的抗體平移時,攜帶V基因的噬菌體在其表面表達抗體V的結構域。挑選克隆可以被放大并表示為可溶性的scFv的噬菌體感染大腸桿菌。單鏈Fv作為初始選擇的首要候選人往往是低到中等的親和力且要求體外親和力成熟,以獲得所需的結合親和力。這是通過各種各樣的突變發(fā)生和選擇戰(zhàn)略,包括CDR突變,連鎖洗牌,酵母展示完成的。構建人抗體基因庫和抗體選擇的一個協(xié)議是由Schirrmann和華中科技大學提出的。 阿達木單抗,原始D2

18、E7是第一個獲得FDA批準的由噬菌體展示技術創(chuàng)建的全人工單克隆抗體。阿達木單抗是一種用于治療類風濕關節(jié)炎的IgG1抗體。它結合(KD= 6×10-10米),并抑制腫瘤壞死因子(TNF)的活性。 噬菌體展示技術也已經(jīng)延伸到FAB片段進行抗體生產(chǎn)。此外,新的顯示平臺紛紛涌現(xiàn),如酵母,淋巴細胞和核糖體。全合成人組合抗體庫的HuCAL(MORPHOSYS,Martinsried,德國),也已經(jīng)創(chuàng)造模仿人類VH和VL亞科的經(jīng)??吹降拿庖叻磻?。原來,這些合成庫只包含隨機CDR3編碼區(qū),但現(xiàn)在已經(jīng)被擴展到含有所有六個CDR的編碼區(qū)。幾個的HuCAL抗體現(xiàn)在在臨床試驗中,包括多發(fā)性骨髓瘤BHQ880

19、(諾華),轉移性前列腺癌(Centocor公司)的CNTO888,BAY79-4620的晚期實體瘤(拜耳)。10.3.5.2   轉基因小鼠Alt和他的同事首次提出了能夠編碼未重排的人免疫球蛋白基因座的轉基因小鼠有望成為生產(chǎn)人類抗體的有效方法(Alt et al., 1985)。Bruggemann et al. (1989)首先構建了一個攜帶人免疫球蛋白重鏈小基因位點的轉基因小鼠,該位點包含了融合到commonC區(qū)的未重排的V、D、J片段。抗原挑戰(zhàn)和雜交瘤細胞的形成表明,這種轉基因小鼠能夠產(chǎn)生轉基因編碼的免疫反應。在此之后,兩個實驗團隊構建了另一種轉基因小鼠,這

20、種小鼠帶有自身免疫蛋白重鏈和鏈的靶向斷裂基因,小鼠基因中還插入了人免疫球蛋白的大部分基因(Lonberg et al., 1994, Green et al., 1994)。這些轉基因株系支持VDJ片段的融合,體細胞突變和類別轉換。由此產(chǎn)生了UltiMAb株(Medarex公司,普林斯頓,新澤西州)和XenoMouse株(Amgen公司,加利福尼亞州Thousand Oaks),它們已被用來分離臨床驗證完全的人類單克隆抗體。據(jù)推測(Lonberg, 2008),轉基因小鼠系統(tǒng)中的具有免疫蛋白的天然親和力的成熟過程,這使得該方法比體外方法更具優(yōu)勢。在體外方法中需要消除主要抗體的后續(xù)親和力的成熟過

21、程,而這些抗體往往是需要用技術分離的抗體,例如用噬菌體顯示的方法進行分離。利用XenoMouse技術形成了第一個獲FDA批準的單克隆抗體衍生的抗EGFR單克隆抗體帕尼單抗(赫克特等人。,2007,韋納等人。,2008),(Giusti等人。,2007)創(chuàng)建了T轉基因小鼠平臺。雖然在臨床試驗的免疫反應中直接比較的是復雜變量,如實驗設計,免疫原性似乎比西妥昔單抗低。231例患者的I期實驗(Cutsem等人。,2007)抗人抗體()的帕尼單抗檢測反應與HACA西妥昔單抗反應(Tan等人。,2006。比較縮減到大約4%。也許一個更顯著的標是注射帕尼單抗的反應率(5%,無3級或4的不良事件)與西妥昔單抗

22、(7.5%,1.7%,3級或4事件)相比減少。從與轉基因鼠源抗體實驗相關的大量臨床經(jīng)驗中可知,和或嵌合或人源化的單克隆抗體相比,全人類單克隆抗體的整體提高更加清晰這是目前臨床開發(fā)的不同階段(朗伯格,2008)。10.3.5.3人雜交瘤細胞人的雜交瘤細胞產(chǎn)生人源抗體,特別是直接從病人的細胞形成的雜交瘤細胞,能理想的消除有害的免疫反應,提高以抗單克隆抗體為基礎的治療效果。明顯的,明確的倫理與現(xiàn)實的考慮限制了與鼠源性雜交瘤類似方法的發(fā)展,然而,正在尋找替代的方法。從外周血采集抗原特異性B細胞,這容易進行以及可重復的抽取試樣,已被用來制作單克隆抗體株(Houghton等。,1983,奧爾森等人,198

23、4,borrebaeck等人。,1988。)清除人免疫需要的其他方法也已經(jīng)形成。包括人體外脾細胞的免疫(伯爾納等人。,1991)和體外免疫冷凍保存健康人捐贈的B細胞和隨后k6h6B5細胞穩(wěn)定的融合(Li等人。,2006b)。一些來源于病人的永生細胞系已通過雜交瘤技術制備了人源性抗體(卡帕斯等人。,2001,奧爾森等人。,1984,西科拉等人。,1983)。但是,制備人雜交瘤細胞的主要困難是難以獲得或制備出永生人細胞系。人雜交瘤的早期工作通常是外周血中的細胞與可致癌的皰疹家族的病毒(Steinitz等人,1977,科爾等人。,1984),雜交,這些早期的實驗具有轉化效率低,增長不穩(wěn)定,和人染色體

24、丟失等缺點(Glassy and Ferrone,1982)??梢酝ㄟ^使用親和素-生物素交聯(lián)融合方式(kozbor和羅德,1981)來提高雜交融合效率及產(chǎn)量?;蛲ㄟ^EB病毒對B淋巴細胞和異源雜交瘤(人鼠)細胞株融合(Teng et al.,1983,Kudo等人,1988)??梢酝ㄟ^使用morphogenics(尼古拉德斯等人。,1995)方法提高次優(yōu)雜交瘤的活性,濃度,生長率,這種方法是orphotek的一個特有的過程(??怂诡D,PA),可以快速的進行錯配修復機制以及增加細胞的表型多樣性。10.4單克隆抗體有良好的抗癌性能在臨床上使用的大多數(shù)抗體治療的機制依賴于抗體自身的抗性,如單克隆抗體的

25、定向能力可以通過免疫系統(tǒng)直接的作用在病人的腫瘤細胞(圖10.3A)或者通過抑制信號傳導來達到目的(圖10.3b)??贵w和細胞工程技術可以改變單克隆抗體的藥代動力學和單克隆抗體的藥性,以此來增加療效和明確抗體的生物活性。10.4.1調(diào)節(jié)血清半衰期和腫瘤定位10.4.1.1受體和血清持久性新形成的Fc受體(FcRn)不僅是調(diào)節(jié)血清中免疫球蛋白的半衰期的的IgG抗體的半衰期的關鍵性物質,而且可延長IgG1分子藥物的半衰期(約天)。(卡特,2006)。Fc受體是一個二聚體,包含一個50 kDaRn同源的主要組織相容性復合體鏈和一個15 kDa的非生物多樣性 的微球蛋白。第一個受體是在小鼠中發(fā)現(xiàn)的(榮漢

26、斯表和安德森,1996),F(xiàn)c受體可以精確的把IgG從母體通過胎盤運輸?shù)教褐?。在成人中,F(xiàn)cRn在血管內(nèi)皮細胞中表達,控制(反復觀察(ghetie和Ward,2000)和白蛋白(喬杜里等人。,2003)的穩(wěn)定,使其定位于受體的特定部位(喬杜里等人。,2006)。血清中的IgG抗體通過胞飲作用與在核內(nèi)體弱酸性條件下(pH值66.5)生成的受體結合,通過一系列復雜的循環(huán)回到細胞表面,在生理(pH 77.4)下IgG釋放到血清中,使其避免了溶解酶的降解(奧伯等人,2004年a,B。)。IgG破壞的或空間結構錯誤的IgG不能被受體識別,因此會被溶解酶降解。除此之外,當受體被用完時,過量的IgG會被降

27、解,因此可調(diào)節(jié)游離的IgG數(shù)量。Weinstein和他的同事假設脈管系統(tǒng)周邊的高水平的抗原將會作為抗體擴散的結合位點障礙物。Wittrup和他的同事擴展這種結合位點障礙物模型來解釋抗體的內(nèi)化和分解代謝,一旦他們將抗原吸引到細胞表面。如以上詳細說明,免疫球蛋白G單克隆抗體的藥代動力學行為使他們成為對基于抗體療法的有利結構。然而,治療免疫球蛋白G的大面積和高功能性的親和力被預測會惡化壓力梯度和結合位點屏障,從而限制這些抗原滲透腫瘤的能力。當耦合異構抗原的表達,這些影響可能解釋不均勻分布系統(tǒng)性管理抗體,這些抗體可以在腫瘤塊的活檢樣本中觀察到。雖然,工程抗體的大小和親和性是獨立的特征,當設計一個優(yōu)化的

28、治療時他們必須結合起來評估。分子大小和親和性之間的相互影響以及他們?nèi)绾斡绊戵w內(nèi)的行為是由Schmid等建模??贵w的大小和擴散至腫瘤速率之間的負相關已經(jīng)導致預言抗體片段小于完整的免疫球蛋白對于擴散遠離腫瘤脈管系統(tǒng)更有效。相反,這促使多種抗體類結構的腫瘤目標屬性的創(chuàng)建和測試,其中一些可見于圖10.5,如triabodies and tetrabodies已經(jīng)構建。這些結構最簡單的是25 kDa單鏈可變片段,由肽段連接的V Hand VL區(qū)組成。單一鏈作為構建塊創(chuàng)建(scFv)2和雙體也作為雙功能單一鏈抗體和BiTEs。額外的的結構沒有在圖10.5中展現(xiàn),如已經(jīng)構建的triabodies and t

29、etrabodies。分子大小對腫瘤滲透的影響是通過一系列綁定到在LS174T人類結腸癌異種移植腫瘤相關糖蛋白72的工程抗體。這份研究數(shù)據(jù)與假設一致,腫瘤滲透性與抗體分子的大小無關。 小于5065 kDa的抗體進行快速、初步的腎臟的清除。盡管scFv和(scFv)2預計會增加腫瘤滲透性與大的相對物相比,這些蛋白質快速的從循環(huán)中清除,限制腫瘤能被實現(xiàn)總的吸收水平。一系列的策略來規(guī)避首次通過的清除以及增加治療單鏈抗體可變區(qū)基因片段的半衰期。PEG融合單鏈抗體可變區(qū)基因片段已經(jīng)改善了抗體的穩(wěn)定性和腫瘤的靶向性而沒有增加毒性。例如,結合PEG3400到anti-TAG-72雙特異抗體或者anti-CE

30、A的雙特異抗體帶來一個明顯的分子大小的蛋白質復合物,等效于一個小型抗體,改善腫瘤肝比率。它被假定聚乙二醇化雙體如這些,或者聚乙二醇化單鏈抗體可變區(qū)基因片段如4D5-PEG20可用于成像或細胞毒性的有效載荷的傳遞。與免疫球蛋白G相似,血清中白蛋白的半壽期通過與FcRn的聯(lián)系來調(diào)控的。許多研究策略被用來開發(fā)白蛋白作為一種延長scFv半衰期的機制。白蛋白基因融合的構建是一種方法。例如,一個抗癌胚抗原 單鏈抗體可變區(qū)基因片段-白蛋白 融合蛋白質表明比裸scFv在腫瘤滯留時間提高了2.5倍。另外一個蛋白質,MM-111,臨床試驗的雙特異性anti-Her2/HER3 scFv-albumin融合蛋白也是

31、使用這種方法。另一種策略使用綁定白蛋白的融合運用到治療抗體上。這些包括多肽類,單區(qū)抗體,鏈狀球菌G蛋白質區(qū)以及小分子。與白蛋白的非共價親和性在這種方法可以量身定做,以調(diào)整PK和促進白蛋白抗體的離解來增強腫瘤滲透性。 當設計最佳治療劑時,除了抗體大小還應考慮抗體對目標抗原的親和性。對目標抗原的親和性既要能夠支持腫瘤的靶向性也能給予期望的生物學效應。相似于抗體的人源化,許多有效的技術用來發(fā)展親和成熟抗體分子。許多基于顯示技術,如噬菌體和酵母顯示,涉及創(chuàng)建一個“二次”圖書館通過多樣化的V基因,和然后選擇和篩選高親和力變體??贵w親和性的進一步完善可通過CDR-directed 模式方法,在這章抗體人源

32、化的部分討論過。 亞當斯等人已經(jīng)顯示,使用一組抗-HER2/neu scFv 其親和力范圍是從1.6×106M到1.5×1011M,最高的親和力的抗體可能事實上是次優(yōu)的靶向抗腫瘤。免疫球蛋白G的半衰期的調(diào)控可通過對免疫球蛋白G CH2-CH3 鏈交界面進行工程定點突變來完成, Fc片段區(qū)域功能是連接FcRn。這種突變可以增加或減少FcRn對免疫球蛋白G片段的親和力。一些保守的跨物種殘基確定對連接FcRn和Fc很中要,其中包括組氨酸310 組氨酸435 和天冬酰胺434。連同F(xiàn)cRn的組氨酸250和組氨酸251.這些Fc域殘基賦予了FcRn-IgG相互作用的 pH依賴性。一些

33、抗體已變成在pH為6.0時具有弱FcRn結合性,在中性pH中結合特性未改變,這種結果導致免疫球蛋白G的半衰期延長。此外,血清半衰期延長, FcRn-Fc相互作用半衰期延長已經(jīng)與臨床模式中增強治療效果有關。Zalevsky等人以創(chuàng)建了抗血管內(nèi)皮因子的一個變種抗體單伐貝抗,這種抗體稱為Xtend-VEGF,它表現(xiàn)出FcRn在pH為6.0時親和性增加11倍。而且在表達人類FcRn的轉基因小鼠上其半衰期延長了5倍,在較長給藥間隔的獼猴半衰期延長了3倍.此外,Xtend-VEGF和抗表皮生長因子受體抗體變種西妥昔單抗也稱為Xtend-VEGF,都表明對裸鼠有治療益處。 相反的,半衰期減少的工程抗體可能在

34、免疫結合物的構建或抗體類設想運用是有可行性的。此外,Abdegs是類抗體分子,設計成對FcRn有高度親和性。它能與體內(nèi)的抗體競爭。Abdegs能限制FcRn并促使內(nèi)生抗體的降解,它對一些有關自身免疫抗體的疾病如多發(fā)性硬化癥和狼瘡存在潛在的治療效果。這些抗體也許對競爭和加速清除免疫毒素和免疫偶聯(lián)物起作用。10.4.1.2 糖基化蛋白質的糖基化是一種天然共價翻譯后修飾,這種修飾能幫助蛋白質適當?shù)恼郫B,保護蛋白質免于降解并且增強穩(wěn)定性。此外,在循環(huán)中治療性抗體的存在時間依賴于連接在第297位天冬酰胺位點的氮連接寡糖的結構和特性。從正常血清中分離的人類抗體包含多糖基,這些糖基在可能糖基化氮連接和氧氮連

35、位點的數(shù)量和寡糖結構的異質性方面是不同的。氮連接的糖基化在來自正常人類血清抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)都可以觀察到,由于高頻突變可以導致氮連接糖基化模式的產(chǎn)生。因為糖基化是與治療單抗的半衰期和效應功能是相關的,因此它的生物學特性要求考慮到發(fā)展和生產(chǎn)中。類似于單克隆抗體主要氨基酸序列促使人源化抗體的開發(fā)問題,非人源糖基化模式和與過敏相關的注射有關。因此,最佳的單克隆抗體糖基化為進一步提高效用性和安全性提供可能。重組治療性單克隆抗體糖基化取決于一些因素包括表達系統(tǒng)的類型,特定酶的存在和活性其中包括將寡糖構建到三聚甘露糖亞胺上的糖基轉移酶,糖苷酶降解他們,以及培養(yǎng)基適當?shù)暮塑账崽峁┑目捎眯?。用來表達

36、治療性抗體的哺乳細胞系是非人類起源的,因此糖基在形式上不同于在人體中所見到的。中國倉鼠卵巢細胞產(chǎn)生糖基化模式不同于人類依據(jù)唾液酸連接類型和缺乏對稱氮-乙酰葡糖胺。細胞工程策略已經(jīng)用來開發(fā)表達連有對稱氮-乙酰葡糖胺(1,4)-N-乙酰葡糖胺轉移酶。這種以模擬自身人類糖基化形式為目的表達系統(tǒng)的糖基化工程也許能夠實現(xiàn)調(diào)控機制所要求的多數(shù)糖基化的標準化。選擇性表達系統(tǒng)如昆蟲細胞和酵母細胞產(chǎn)生糖基化的模式不同于哺乳類表達系統(tǒng)。酵母的高露糖糖基化通過將寡糖結合到巨噬細胞甘露糖受體來減少半衰期,從而導致抗體的降解。此外,產(chǎn)生于植物的糖蛋白的海藻糖和二甲苯是有毒的。相比之下,抗體糖鏈異質體唾液酸含量高可以延長

37、循環(huán)周期。與表達(1,4)-N-乙酰葡糖胺轉移酶的中國倉鼠卵巢細胞工程相似,畢赤酵母的內(nèi)源酵母糖基化途徑已經(jīng)被替換為體內(nèi)合成的糖基化途徑包括真核生物的甘露糖酶I和II以及N-乙酰葡糖胺轉移酶I和II。這種修飾允許帶有相同復雜N-糖基化人類糖蛋白的產(chǎn)生。近期,大腸桿菌已成功的進行糖工程化。具有增強性血清半衰期的治療性抗體的生產(chǎn)發(fā)展很有前景。 10.4.1.3 抗體大小和親和力 基于抗體治療的方法其指導殺死腫瘤細胞是憑借將抗原結合到抗體表面。因此,為了根除腫瘤中所有的細胞,抗體必須穿透腫瘤,遠離血管系統(tǒng)的滲出物位點。腫瘤的特性是具有有孔的血管系統(tǒng)和水分無法滲出的淋巴管。這二者使得腫瘤產(chǎn)生高強度間隙

38、壓力。在從血管外滲的大分子中,這種壓力被作為以與分子量的立方根成反比的方式阻止他們擴散至腫瘤中。此外,目標抗原在腫瘤細胞中是高效表達的。Weinstein和他的同事假設脈管系統(tǒng)周邊的高水平抗原將會作為抗體擴散的結合位點障礙物。Wittrup和他的同事擴展這種結合位點障礙物模型來解釋抗體的內(nèi)化和分解代謝,一旦他們將抗原吸引到細胞表面。如以上詳細說明,免疫球蛋白G單克隆抗體的藥代動力學行為使他們成為對基于抗體療法的有利結構。然而,治療免疫球蛋白G的大面積和高功能性的親和力被預測會惡化壓力梯度和結合位點屏障,從而限制這些抗原滲透腫瘤的能力。當耦合異構抗原的表達,這些影響可能解釋不均勻分布系統(tǒng)性管理抗

39、體,這些抗體可以在腫瘤塊的活檢樣本中觀察到。雖然,工程抗體的大小和親和性是獨立的特征,當設計一個優(yōu)化的治療時他們必須結合起來評估。分子大小和親和性之間的相互影響以及他們?nèi)绾斡绊戵w內(nèi)的行為是由Schmid等建模??贵w的大小和擴散至腫瘤速率之間的負相關已經(jīng)導致預言抗體片段小于完整的免疫球蛋白對于擴散遠離腫瘤脈管系統(tǒng)更有效。相反,這促使多種抗體類結構的腫瘤目標屬性的創(chuàng)建和測試,其中一些可見于圖10.5,如triabodies and tetrabodies已經(jīng)構建。這些結構最簡單的是25 kDa單鏈可變片段,由肽段連接的V Hand VL區(qū)組成。單一鏈作為構建塊創(chuàng)建(scFv)2和雙體也作為雙功能單

40、一鏈抗體和BiTEs。額外的的結構沒有在圖10.5中展現(xiàn),如已經(jīng)構建的triabodies and tetrabodies。分子大小對腫瘤滲透的影響是通過一系列綁定到在LS174T人類結腸癌異種移植腫瘤相關糖蛋白72的工程抗體。這份研究數(shù)據(jù)與假設一致,腫瘤滲透性與抗體分子的大小無關。小于5065 kDa的抗體進行快速、初步的腎臟的清除。盡管scFv和(scFv)2預計會增加腫瘤滲透性與大的相對物相比,這些蛋白質快速的從循環(huán)中清除,限制腫瘤能被實現(xiàn)總的吸收水平。一系列的策略來規(guī)避首次通過的清除以及增加治療單鏈抗體可變區(qū)基因片段的半衰期。PEG融合單鏈抗體可變區(qū)基因片段已經(jīng)改善了抗體的穩(wěn)定性和腫瘤

41、的靶向性而沒有增加毒性。例如,結合PEG3400到anti-TAG-72雙特異抗體或者anti-CEA的雙特異抗體帶來一個明顯的分子大小的蛋白質復合物,等效于一個小型抗體,改善腫瘤肝比率。它被假定聚乙二醇化雙體如這些,或者聚乙二醇化單鏈抗體可變區(qū)基因片段如4D5-PEG20可用于成像或細胞毒性的有效載荷的傳遞。 與免疫球蛋白G相似,血清中白蛋白的半壽期通過與FcRn的聯(lián)系來調(diào)控的。許多研究策略被用來開發(fā)白蛋白作為一種延長scFv半衰期的機制。白蛋白基因融合的構建是一種方法。例如,一個抗癌胚抗原單鏈抗體可變區(qū)基因片段-白蛋白 融合蛋白質表明比裸scFv在腫瘤滯留時間提高了2.5倍。另外一個蛋白質

42、,MM-111,臨床試驗的雙特異性anti-Her2/HER3 scFv-albumin融合蛋白也是使用這種方法。另一種策略使用綁定白蛋白的融合運用到治療抗體上。這些包括多肽類,單區(qū)抗體,鏈狀球菌G蛋白質區(qū)以及小分子。與白蛋白的非共價親和性在這種方法可以量身定做,以調(diào)整PK和促進白蛋白抗體的離解來增強腫瘤滲透性。 當設計最佳治療劑時,除了抗體大小還應考慮抗體對目標抗原的親和性。對目標抗原的親和性既要能夠支持腫瘤的靶向性也能給予期望的生物學效應。相似于抗體的人源化,許多有效的技術用來發(fā)展親和成熟抗體分子。許多基于顯示技術,如噬菌體和酵母顯示,涉及創(chuàng)建一個“二次”圖書館通過多樣化的V基因,和然后選

43、擇和篩選高親和力變體??贵w親和性的進一步完善可通過CDR-directed 模式方法,在這章抗體人源化的部分討論過。亞當斯等人已經(jīng)顯示,使用一組抗-HER2/neu scFv 其親和力范圍是從1.6×106M到1.5×1011M,最高的親和力的抗體可能事實上是次優(yōu)的靶向抗腫瘤。與定位障礙物的假設一致,作者發(fā)現(xiàn)低親和scFv分布式擴散地穿過在24小時內(nèi)注射后的腫瘤血管區(qū)域。具有10,000高親和力的scFv只能在血管中細胞直徑減小時檢測到。低親和抗-EGFR單克隆抗體尼妥珠單抗和西妥昔單抗或者帕尼單抗之間的比較突出了親和力在臨床上的重要性。10.4.2 提高抗體的效應功能 相

44、似于病原體的調(diào)理素作用,將治療抗體結合到腫瘤細胞的表面有可能通過Fc依賴性與 Fc受體相互作用來指導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性對腫瘤的抵抗,其Fc受體發(fā)現(xiàn)于免疫細胞的表面。同樣,結合腫瘤的免疫球蛋白可以通過互補依賴細胞毒性殺死腫瘤細胞。這些過程可在圖10.3a中可見。一些治療性單克隆抗體在臨床上的成功歸功于誘導ADCC和CDC的能力或者兩者兼有。免疫球蛋白G片段的選擇、Fc工程和新穎的免疫抗體類似結構為增加抗腫瘤免疫應答的效應性體供了方法。10.4.2.1 免疫球蛋白G同型物無論是設計治療嵌合抗體還是人類抗體Fc區(qū)域免疫球蛋白G同型物很重要,因為它以最直接的方式調(diào)控ADCC和CDC。免疫球蛋

45、白G同型物與Fc區(qū)域有95%的同源性,但不同于氨基酸組成和鉸鏈區(qū)結構。免疫球蛋白G1是一種最常見的被用來作為治療性抗體的片段,因為它發(fā)揮了ADCC和CDC的最大作用。免疫球蛋白G3也能增強CDC的功能甚至超過免疫球蛋白G1,但他們很少使用因為他們的鉸鏈區(qū)更容易發(fā)生蛋白質水解作用。The 免疫球蛋白G2對Fc受體和互補串聯(lián)C1q 的親和力低,因此不能有效地誘導ADCC或CDC。當使用抗體將細胞毒性藥物攜帶至腫瘤,或者當抗體對溶解性抗原的中和具有治療作用或是不必要的,免疫球蛋白G2 同型物在刺激病人非必要免疫系統(tǒng)的情況下是有用的。免疫球蛋白G4同樣被如此使用,然而它的半衰期比免疫球蛋白G1小兩倍。

46、10.4.2.2 通過突變改變與Fc受體相互作用FcR家族由3個類型組成并能進一步劃分子類。FcRI 對免疫球蛋白G的親和力高于FcRII或者FcRIII。信號傳輸是通過類型 I, IIa, and IIIa 受體效應細胞和ADCC的激活,這歸因于免疫受體酪氨酸相關的激活基序。類型IIb 受體的信號傳輸通過免疫受體酪氨酸相關的激活基序抑制細胞的激活。很大的努力都集中在修飾免疫球蛋白G的Fc域以優(yōu)化對誘導 ADCC FcR子類的參與。FcR與免疫球蛋白發(fā)生作用的主要位點在Fc CH2 和鉸鏈區(qū)。希爾茲等人發(fā)現(xiàn)幾個能增加對FcR IIIa親和力普通的Fc免疫球蛋白g結構的突變體,但不影響或降低對

47、IIb的親和力。最近,結合計算藥物蛋白設計方法加上高通量篩選的方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)突變體,這些突變體提高耦合兩個臨床相關抗體的能力, 抗CD52 抗體阿侖單抗和抗HER2抗體曲妥珠單抗。針對CD-30 and CD-19的抗體已經(jīng)產(chǎn)生,這已經(jīng)用于治療霍奇金淋巴瘤或者漸變性大細胞型淋巴瘤的臨床試驗。特異性結合碳水化合物部分的Fc殘基的修飾也能夠調(diào)節(jié)FcR的識別。將 C1q結合到抗體的Fc區(qū)域是激活CDC的第一步,級聯(lián)反應依賴于第一步的強度。因此研究者同過促進C1q的結合觀察漸增的CDC。這可由改變Fc CH2的殘基或者抗體的鉸鏈區(qū)來實現(xiàn)。使用一種專有的方法,這種方法基于將IgG3同型物的內(nèi)在補體結合活性

48、傳遞給一個IgG1骨架,Natsume等人證明工程抗CD20表現(xiàn)出比親本 IgG1 抗體更強的CDC活性,而不改變其ADCC屬性。10.4.2.4 雙功能抗體與T細胞雙特異性單鏈抗體BiTE 要增強感受器的功能可以通過對mAbs的Fc區(qū)域進行修飾,另一個方法是通過創(chuàng)建雙功能抗體來識別腫瘤相關抗原和“觸發(fā)抗原”或者在免疫感受細胞表面的受體。(Figs. 10.3 and 10.5)。兩個抗原同時參與可以改變效應細胞對腫瘤產(chǎn)生的細胞毒性的潛能。(Weineretal.,1993,Keleretal., 1997).在使免疫系統(tǒng)恢復健康方面,雙功能抗體比單克隆抗體有優(yōu)勢。首先,雙功能抗體的選擇和親和

49、力的成熟可以通過細菌和酵母表面顯示的方法,(就像在人類抗體的選擇那里討論的一樣),可以根據(jù)配對的受體細胞的特點對雙功能抗體進行定向剪切。第二點,雙功能抗體可以選擇性的和FcR的表位連接,有別于FcR與Fc結合時涉及的表位。這樣就可以如期望一樣在體內(nèi)補充IgG過量的條件下感受器的功能,(Weineretal., 1993)。第三,bsAb對腫瘤的目標的特異性可以用來指導免疫效應細胞腫瘤細胞毒性的潛能,包括T細胞,這些都是IgG分子平常無法達到的。 雙特異性單鏈抗體BiTE作為一個特異的招募T細胞用于癌癥治療的多功能平臺,BiTE激活的T細胞可以通過釋放穿孔素使細胞膜穿孔,從而使顆粒酶B釋放,引起

50、細胞凋亡從而殺死細胞。有一些進入臨床前和臨床研究的BiTE展示出美好的前景。研究表明因KRAS和BRAF致癌基因突變引起的結腸直腸癌對西妥昔單抗具有抗性,而以EGFR為靶標的BiTE在體內(nèi)和體外都表現(xiàn)出抵抗這種結腸直腸癌細胞的活性。同時,一種叫MEDI-565的BiTE可以在結腸直腸癌病人進行化療治療前使用,因為它以癌胚抗原和CD3為靶標,可以使病人體內(nèi)的T細胞對癌細胞進行攻擊。Blinatumomab,一種針對CD19/CD3的BiTE,現(xiàn)在在進行用于針對病人的復發(fā)性的非霍奇金氏淋巴癌的臨床試驗。MT110,一種以EpCAM/CD3為靶標的對抗晚期肺癌和胃腸道腫瘤的BiTE亦進入了臨床試驗。

51、雙功能抗體和BiTE抗體會在本卷第12章有更加詳細的論述。10.4.3 多克隆抗體療法 如上所述,多克隆抗體的制備可以從經(jīng)免疫的動物的血清中分離所得,然而,低效和安全問題很大程度上限制了它的使用。人們猜測在體外,抗原特異性的多克隆抗體合劑在對抗同一種抗原會比標準的單克隆抗體為基礎的治療更為有效。因為免疫系統(tǒng)在受到抗原入侵時一般形成多抗體反應,以多克隆抗體為基礎的治療可以通過招募效應細胞殺死癌細胞。此外,多克隆抗體比單克隆抗體更加有效地清除腫瘤細胞微環(huán)境中活化的配體,或者使細胞表面受體去活化。重組抗體技術的出現(xiàn)證明了這一猜測是正確的。 原則上,體外多克隆抗體治療可以通過從標準技術中單獨表達和純化

52、出來的單克隆抗體混合或聯(lián)合使用達到。臨床試驗會根據(jù)目前使用的標準的聯(lián)合治療方案。這一方案一直被用于抗HER2(原癌基因人類表皮生長因子受體2)單克隆抗體曲妥珠單抗和使用pertuzumab(帕妥珠單抗),而且獲得了比較理想的結果?;加修D移性乳腺癌的病人進行了曲妥珠單抗治療后的客觀有效率為24.2%,二期的臨床受益率為50%。Nielsen等人提出了一個使用多克隆抗體治療的可行的方法,如Fig. 10.6a, d, e. 這個方法是建立在Sympress技術的基礎上的,據(jù)報道說,它允許由多達六個不同的IgG抗體制造出具有成本效益的單批量的pAb。這種方法在細胞工程方面存在很多很變化,這可能是因為

53、在產(chǎn)品的生產(chǎn)增長或表達存在著特性變化。這些問題得到了解決,部分原因在于通過制定一個涉及多克隆抗體庫和多克隆工作細胞庫的多階段生產(chǎn)計劃,先分別冷凍然后穩(wěn)定混合可以穩(wěn)定地產(chǎn)生抗體的細胞系。這種方法經(jīng)臨床批準目前已經(jīng)投入使用。10.5 治療性抗體的包裝 大多數(shù)FDA批準的mAbs的功能都是通過固定的作用機制。通過與目標抗原結合,他們要么改變了受體介導的信號轉導通路,推動腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,或者導致腫瘤細胞被免疫系統(tǒng)殺死,然而,缺乏固有的抗癌活性的mAbs仍然可以被用作運載細胞毒素的運載體,如化療,放療,毒素,細胞因子。這類以mAbs為基礎的藥物設計過程中就需要考慮使用更多的mAbs。10.5.1 免疫

54、藥物化合物 Gemtuzumab ozogamicin是一種人源的IgG4抗CD33抗體,它與細胞毒性的抗生素共軛結合。它用于復發(fā)性的CD33陽性的急性髓性白血病,也是目前為止唯一一種FDA認可的免疫化合藥物。雖然數(shù)據(jù)的安全性最近遭到了質疑,但是Gemtuzumab ozogamicin為免疫化合藥物的迅速發(fā)展奠定了基礎。支持這一領域發(fā)展的猜想是mAb的腫瘤的靶標性可以制備出放療治療時把細胞毒性作用集中與腫瘤的抗癌制劑,而對全身的使用時不至于太具毒性??ɡ锲婷顾兀–alicheamicin)和maytansinoid衍生物是目前為止臨床認可的兩類放療藥物。Trastuzumab-DM1代表了這類擴展性的癌癥治療。它在進行HER2陽性乳腺癌系列二期試驗中表現(xiàn)出了強大的單藥活性,推動了以HER2為靶標的癌癥治療。 化學上過去一直設計連接物將細胞毒素與m

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論