基因多態(tài)性分析

1、人 基因多態(tài)性分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解基因多態(tài)性在闡明人體對(duì)疾病、毒物的易感性與耐受性、疾病臨床表現(xiàn)的多樣性以及對(duì)藥物治療的反應(yīng)性中的重要作用。2. 了解分析基因多態(tài)性的基本原理和研究方法。二、實(shí)驗(yàn)原理基因多態(tài)性（gene polymorphism）是指在一個(gè)生物群體中，同時(shí)存在兩種及以上的變異型或基因型或等位基因，也稱為遺傳多態(tài)性（genetic polymorphism）。人類基因多態(tài)性對(duì)于闡明人體對(duì)疾病的易感性、毒物的耐受性、藥物代謝差異及遺傳性疾病的分子機(jī)制有重大意義；與致病基因連鎖的多態(tài)性位點(diǎn)可作為遺傳病的診斷標(biāo)記，并為分離克隆致病基因提供依據(jù)；病因未知的疾病與候選基因多態(tài)性的相關(guān)

2、性分析，可用于輔助篩選致病易感基因。聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(polymerase chain reactionRestriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)分析是一種常用的DNA分子標(biāo)記。原理是通過PCR擴(kuò)增獲得目的基因。若目的基因存在等位變異（多態(tài)性），且變異正好發(fā)生在某種限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上，使酶切位點(diǎn)增加或者消失，則酶切結(jié)果就會(huì)產(chǎn)生大小不同的片段，即片段長度多態(tài)性，再利用瓊脂糖凝膠電泳分離，可呈現(xiàn)出多態(tài)性電泳圖譜。若將患者與正常的多態(tài)性圖譜比較，可確定是否變異。應(yīng)用PCR-RFLP，可檢測(cè)某一致病基因已知的點(diǎn)突變，進(jìn)行直

3、接基因診斷，也可以此為遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析進(jìn)行間接基因診斷。三、器材與試劑1. 器材離心機(jī)。DNA擴(kuò)增儀。電泳儀。水平電泳槽。紫外檢測(cè)儀。移液器。2. 試劑口腔拭子DNA抽提試劑盒。瓊脂糖。1×TAE電泳緩沖液：980ml蒸餾水中加入50×TAE母液20ml。50×TAE母液：Tris 121g，0.5M EDTA（pH8.0）50ml，冰醋酸 28.55ml，定容至500ml。上樣緩沖液（6×）：30mM EDTA，40%(V/V)甘油，0.05%（W/V）二甲苯青FF，0.05%（W/V）溴酚藍(lán)。10 mg/ml溴化乙錠（EB）。DNA Marker

4、。四、實(shí)驗(yàn)方法1.基因組DNA抽提細(xì)胞采集：口腔拭子（消毒后的棉簽）擦拭兩側(cè)臉頰各10次，采集口腔粘膜脫落細(xì)胞，將拭子轉(zhuǎn)置于2mL離心管中，用剪刀將棉簽部分剪下，加入DNA抽提試劑盒中的400L緩沖液GA。注意：為了保證樣本不被食物或者飲料污染，取樣前30分鐘內(nèi)請(qǐng)勿進(jìn)食和飲水。DNA提?。?參照試劑盒說明書操作。樣品保存：DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在-20，以防DNA降解。下次實(shí)驗(yàn)再用。2. DNA濃度及純度檢測(cè)可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣品的濃度與純度。瓊脂糖凝膠電泳法定性檢測(cè)DNA 參照實(shí)驗(yàn)16 DNA瓊脂糖電泳。紫外分光光度法定量檢測(cè)DNA濃度及純度參照實(shí)驗(yàn)20 動(dòng)物肝臟DNA的

5、提取和檢測(cè)。測(cè)定濃度后，稀釋至0.25ug/uL備用。3. 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析查找基因序列選擇你感興趣的目的基因，首先查閱文獻(xiàn)，如果已有報(bào)道并提供了該基因在Genbank中的ID號(hào)，可直接在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information）中搜索。登陸http:/，先選擇核酸數(shù)據(jù)庫，點(diǎn)擊下拉框選擇Nucleotide，再把Genbank ID號(hào)輸入搜索框，點(diǎn)擊Search，如（圖25-1）：圖25-1 查找目的基因步驟1如果只是知道基因的名字，則搜索框中輸入基因名稱，點(diǎn)擊search。通

6、常會(huì)產(chǎn)生大量的搜索結(jié)果，例如搜索人乙醛脫氫酶基因，search后進(jìn)入如下界面（圖25-2），共有700余條結(jié)果：圖25-2 查找目的基因步驟2真核生物基因通常是斷裂基因，含有大量間隔區(qū)，序列龐大，若查看全基因序列，可點(diǎn)擊Genomic，如果只想獲取轉(zhuǎn)錄區(qū)，點(diǎn)擊Transcript查看轉(zhuǎn)錄本，點(diǎn)擊后進(jìn)入如下界面（圖25-3）：圖25-3查找目的基因步驟3一些基因通過轉(zhuǎn)錄后加工，通常不止一個(gè)轉(zhuǎn)錄本，例如此處的ALDH2就有2個(gè)，根據(jù)你所查閱的文獻(xiàn)和這些序列中的解釋綜合考慮選擇你所需要的序列。點(diǎn)擊后進(jìn)入（圖25-4）：圖25-4 查找目的基因步驟4此頁面中有關(guān)于該基因信息的詳盡描述，可直接到頁面底部

7、查看基因序列（圖25-5）。圖25-5 查找目的基因步驟5設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)引物的常用軟件有Primer Premier 5.0，Oligo 6.22等，以及在線設(shè)計(jì)程序如及NCBI上的Primer Blast等。這些軟件能根據(jù)引物設(shè)計(jì)基本原則以及你的需求，設(shè)計(jì)并推薦最優(yōu)引物。引物設(shè)計(jì)后交由商業(yè)公司合成。配制反應(yīng)體系在冰浴中，將以下成分依次加入無菌PCR管中        10×PCR buffer          &#

8、160;      2.5 L        dNTP mix （2mM）              2 l      引物1（10pmol）               

9、0;1 l      引物2（10pmol）                 1 l       Taq聚合酶 （2U/l）            0.2l    

10、60;    DNA模板（0.25ug/l）     2L        加ddH2O至25 l，混勻后稍加離心。PCR在核酸擴(kuò)增儀上預(yù)設(shè)以下程序，放入PCR管，啟動(dòng)反應(yīng)。預(yù)變性：94，5min變性：94，30sec退火：X，30sec（退火溫度通常比引物Tm低5）延伸：72，30sec39 cycle末次循環(huán)后延伸：72，10min限制性酶切利用軟件Primer Premier 5.0尋找酶切位點(diǎn)，選擇相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶，酶切體系及反應(yīng)條件參照酶試劑說明書。電泳檢測(cè)配制3%瓊脂糖凝膠，取擴(kuò)增產(chǎn)物5 -10 ul，進(jìn)行電泳，同時(shí)加DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNA Marker）作對(duì)照，紫外檢測(cè)儀下觀察并