實驗三植物光合與呼吸速率的測定

1、實 驗 植物光合與呼吸速率的測定紅外線CO2吸收法一、實驗目的光合作用是地球上最重要的生命現象，它是唯一能把太陽能轉化為穩(wěn)定的化學能貯藏在有機物中的過程，是維持地球上物質循環(huán)的關鍵環(huán)節(jié)，也是農作物產量形成的決定性因素。在植物科學研究中，經常需要測定光合作用。在光合作用（及呼吸作用）測定方法的發(fā)展過程中，曾經有過多次革新，其中包括測定干物質積累的稱重法，測定CO2吸收（和釋放）的滴定法，測氧氣釋放的檢壓法和氧電極法等。與這些方法相比，紅外線氣體分析儀堪稱較先進的方法。它不但快速、準確，而且可將測定信號變?yōu)殡娦盘栞敵?，便于儀器的自動化和智能化。一、實驗原理紅外線CO2氣體分析儀（IRGA）工作原理

2、：當紅外光經過含有CO2的氣體時，能量就因CO2的吸收而降低，降低的多少與CO2的濃度有關，并服從朗伯比爾定律。即紅外線經過 CO 2氣體分子時，其輻射能量減少，被吸收的紅外線輻射能量的多少與該氣體的吸收系數（ K ）、氣體濃度（ C）和氣體層的厚度（ L ）有關，可以用下式表示： E = E 0 e -KCL 式中： E 0：入射紅外線的輻射能量； E：透過的紅外線的輻射能量。一般紅外線 CO 2 氣體分析儀內設置僅讓 4.26m 紅外線通過的濾光片，其輻射能量即 E 0 ，只要測得透過的紅外線輻射能量（ E ）的大小，即可知 CO 2 氣體濃度。本實驗中：IRGA 是測定 CO 2 濃度的

3、專用儀器，不能直接測定植物葉片的光合速率，必須根據 IRGA的性能和測定目的，將 IRGA與同化室組成一定的氣路系統，才能進行葉片光合速率的測定。常用的氣路系統有密閉式和開放式兩種（本實驗采用密閉式）。 1、密閉式氣路系統：被測植物或葉片密閉在同化室中，不與同化室外發(fā)生任何的氣體交換，同化室內的 CO 2濃度因光合作用而下降，或由呼吸作用而上升，可用 IRGA 測定同化室內 CO 2 濃度的下降值或上升，計算光合速率或呼吸速率。二、儀器 GXH-3051紅外線CO2氣體分析儀 氣泵開關電源開關調零旋鈕調零測量轉換旋鈕進氣口出氣口圖3-3-1、GXH-3051紅外線CO2氣體分析儀閉路光合的工作

4、原理為：由兩根氣路管在葉室和紅外線CO2分析儀之間連通形成回路進行氣體的循環(huán)，在葉片的光合作用吸收CO2放出O2的過程中達到對CO2濃度降低的測量，從而計算出植物光合作用速率等數據。原理圖如下：顯示與調節(jié)葉 室紅外線分析儀氣體輸入氣體輸出光照圖 閉路光合的工作原理圖 開路光合的工作原理為，由單根導氣管在紅外線CO2分析儀與葉室之間連通，形成開路。在開路光合測量時，通入的氣體濃度必須是已知的（如P1=500ppm），當數據采集完成后，讀出的數據（設為P2），那么由儀器讀數在光合作用前后的變化值就是植物光合作用所吸收的CO2的量（設為P光合）。即： P光合=P1-P2開路光合的光合速率測定公式為：

5、 式中各字母代表的參數與閉路光合時一樣，F代表氣體流量。工作原理圖如下穩(wěn)定氣源輸入葉 室顯示與調節(jié)紅外線 分析儀氣體輸出光照圖 開路光合測量工作原理圖 三、實驗材料甜菜和丁香等植物的葉片（活體）。四、實驗步驟1、 按儀器使用說明書要求將氣路系統的各部分連接起來，打開氣室。2、 接通電源，打開紅外儀電源預熱15min，表頭顯示的數據為殘留在樣品室中的CO2的氣體濃度值。預熱過程中氣泵開關應處在關閉的位置上。3、將儀器后面板的切換閥旋到左側的調零位置上，打開氣泵電源，約1min后，數顯表頭的顯示值趨向零點附近，調節(jié)紅外儀前面板“調零”旋鈕，顯示在“零點”位置。4、跨度校準：關上氣泵的開關，將儀器后

6、面板的切換閥旋到右側的測量位置上，將標準氣以1.2L/min的流量與儀器的“進氣口”相連，使標準氣通入儀器內，約1min左右，待顯示值穩(wěn)定以后，旋下跨度電位器上的保護蓋，調節(jié)跨度旋鈕使顯示CO2濃度與標氣濃度一致。5、 將待測葉片放入同化室（氣室），密閉后當CO2濃度穩(wěn)定下降時，開始測定，讀取開始的CO2濃度值C1，開始計時，CO2下降至C2（約下降2030ppm），終止計時，記錄C1、C2、t（或確定從測定開始到結束所需時間），測定結束后測量葉片的面積（氣室面積）。6、 計算凈光合速率： 上式中，Pn光合速率（單位mol·m2·s1）；CCO2濃度落差C1-C2（ppm：

7、uL/L）；t測定時間（S）；S葉片面積（單位m2）；V同化室（包括氣路系統）體積（單位L：0.07L）；t同化室的溫度；P大氣壓（單位Mpa）。系統容積是閉路光合中很重要的一項參數。它的值包括了葉室體積、氣路管容積和紅外線分析儀里氣室容積的總合，即V系統容積=V葉室體積+V氣路管容積+V分析儀氣室容積該儀器的系統容積為0.07L。7、呼吸速率測定：葉室用遮光布（由紅、白、黑布疊縫而成）遮光。方法同上。 表1-1 植物光合速率呼吸速率測定記錄表植物材料葉片面積(m2)同化室體積V(L)同化室溫度t ()大氣壓P (Mpa)測定時間t（S）CO2濃度落差C（ppm：uL/L）0.07L光合速率P

8、n（mol·m2·s1）呼吸速率（mol·m2·s1）五、注意事項1、密閉系統的最基本要求是嚴格密閉，不能漏氣，否則無法測定。 2、紅外儀的濾光效果并不十分理想，水蒸氣是干擾測定的主要因素，因此，取樣器干燥管內的 CaCl2要經常更換，避免吸水溶解進入紅外儀，污染分析氣室，以保證測量精度，延長儀器壽命。3、實驗期間，儀器使用后請立即充電，以確保后續(xù)實驗正常進行。實驗四 植物體過氧化物酶的測定一、實驗目的：掌握用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶活性的方法。二、實驗原理：過氧化物酶廣泛頒布于植物的各個組織器官中。在有過氧化氫存在下，過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶

9、褐色物質，可用分光光度計測量生成物的含量。三、實驗材料、試劑與儀器設備1、實驗儀器722型分光光度計、離心機、秒表、電子天平、研缽2、實驗試劑愈創(chuàng)木酚、30%過氧化氫、20 mmol/L KH2PO4、100 mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)、反應混合液100 mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0) 50mL，加入愈創(chuàng)木酚28uL，加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入30%過氧化氫19uL，混合均勻保存于冰箱中。3、實驗材料任何植物材料四、實驗步驟1、粗酶液的提取稱取植物(小麥葉片)材料0.1g，加20mmol/L KH2PO4 5mL，于研缽中研磨成勻漿，以10000r/min離心10分鐘，收集上清液保存在冷處，所得殘渣再用20mmol/L KH2PO4 5mL溶液提取一次，合并兩次上清液。2、酶活性的測定取比色皿2只，于一只中加入反應混合液3mL，KH2PO4 1mL，作為校零對照，另一只中加入反應混合液3mL，上述酶液1mL(如酶活性過高可適當稀釋)，立即開啟秒表，于分光光度計470nm波長下測量OD值，每隔30s讀數一次。以每分鐘表示酶活性大小，即以OD470/min.mg蛋白質表示，蛋白質含量測定按Folin法進行。五、結果計算以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以A470/min.g(鮮重)表