基因克隆的幾種常見方法

1、基因克隆的幾種常見方法基因(gene)是遺傳物質(zhì)的最基本單位,也是全部生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。不論要揭示某個(gè)基因的功能,還是要轉(zhuǎn)變某個(gè)基因的功能,都必需首先將所要爭辯的基因克隆出來。特定基因的克隆是整個(gè)基因工程或分子生物學(xué)的起點(diǎn)。本文就基因克隆的幾種常用方法介紹如下。1依據(jù)已知序列克隆基因 對(duì)已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最為簡便的一種。獵取基因序列多從文獻(xiàn)中查取,即將別人報(bào)道的基因序列直接作為自己克隆的依據(jù)。現(xiàn)在國際上公開發(fā)行的雜志一般都不登載整個(gè)基因序列,而要求作者在投稿之前將文章中所涉及的基因序列在基因庫中注冊(cè),擬發(fā)表的文章中僅供應(yīng)當(dāng)基因在基因庫中的注冊(cè)號(hào)(accessionnumber),

2、以便別人參考和查詢。目前,世界上主要的基因庫有1)EMBL,為設(shè)在歐洲分子生物學(xué)試驗(yàn)室的基因庫,其網(wǎng)上地址為http:/www.ebi.ac.uk/ebi-home.html;(2)Genbank,為設(shè)在美國國家衛(wèi)生爭辯院(NIH)的基因庫,其網(wǎng)上地址為/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白質(zhì)序列庫,其所含序列的精確度比較高,而TREMBL只含有從EMBL庫中翻譯過來的序列。目前,以Genbank的應(yīng)用最頻繁。這些基因庫是相互聯(lián)系的,在Genbank注冊(cè)的基因序列,也可

3、能在Swissport注冊(cè)。要克隆某個(gè)基因可首先通過Internet查詢一下該基因或相關(guān)基因是否已經(jīng)在基因庫中注存。查詢?nèi)炕蛭膸於际敲赓M(fèi)的,因而極易將所感愛好的基因從庫中拿出來,依據(jù)整個(gè)基因序列設(shè)計(jì)特異的引物,通過PCR從基因組中克隆該基因，也可以通過RT-PCR克隆cDNA。值得留意的是,由于物種和分別株之間的差異,為了保證PCR擴(kuò)增的精確性,有必要接受兩步擴(kuò)增法,即nested PCR。依據(jù)蛋白質(zhì)序列也可以將編碼該蛋白質(zhì)的基因擴(kuò)增出來。在基因文庫中注冊(cè)的蛋白質(zhì)序列都可以找到相應(yīng)的DNA或cDNA序列。如蛋白質(zhì)序列是自己測定的,那么需要設(shè)計(jì)至少1對(duì)簡并引物(degenerated pri

4、mer),從cDNA文庫中克隆該基因。以這種方法克隆的基因必需做序列測定才能鑒別所擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。 另外,在基因克隆之后,如還要進(jìn)一步做表達(dá)爭辯,所使用的PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而接受其他有自我檢測(reading proof)功能的酶,如pfu。這樣可以避開由于擴(kuò)增過程中消滅的點(diǎn)突變或終止密碼子而導(dǎo)致整個(gè)爭辯結(jié)論的錯(cuò)誤。2依據(jù)已知探針克隆基因 這也是基因克隆的一種較直接的方法。首先將探針作放射性或非放射性標(biāo)記,再將其與用不同內(nèi)切酶處理的基因組DNA雜交,最終將所識(shí)別的片段從膠中切下來，克隆到特定的載體(質(zhì)粒、噬菌體或病毒)中作序列測定或功能分析。這種方法不但可以將基因克隆出來

5、,還能同時(shí)觀看該基因在基因組中的拷貝數(shù)。但在探針雜交后,要留意高強(qiáng)度(highstringent)漂洗,以避開干擾信號(hào),即保證克隆的特異性,同季節(jié)省時(shí)間。 3未知序列的基因打靶依據(jù)已知序列進(jìn)行基因克隆,多數(shù)是重復(fù)別人的工作,或者是在別人工作的基礎(chǔ)上連續(xù)自己的工作,因而不存在新基因的克隆過程。對(duì)未知序列的基因克隆才是真正的制造性爭辯。 31隨機(jī)引物法克隆未知序列基因1隨機(jī)引物PCR(arbitrarilyprimedPCR,AP-PCR)首先被用于基因組DNA或RNA的指紋圖譜(fingerprint)分析,后來也有人將這種方法用于克隆與表型相關(guān)的基因或mRNA。該方法的理論依據(jù)是:表型受基因支

6、配,在一個(gè)生物體發(fā)生了表型變化后,其基因組DNA很可能發(fā)生變化或消滅不同基因的激活或關(guān)閉等;另一方面,如在寄生蟲的發(fā)育過程中,不同發(fā)育階段的蟲體所表達(dá)的基因很可能不同,如將不同發(fā)育階段的蟲體mRNA提取出來,用單一引物(隨機(jī)引物,其長度不超過16 nt)對(duì)不同時(shí)期的蟲體mRNA進(jìn)行擴(kuò)增比較,即可找出導(dǎo)致表型變異的遺傳學(xué)依據(jù)。這種方法是一種比較PCR,它要求至少有2種來自不同表型但又很類似的基因組DNA或mRNA。AP-PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物必需99%是全都的,只有個(gè)別特異的產(chǎn)物消滅在特異的表型個(gè)體中。該方法對(duì)表型或種源關(guān)系相差甚遠(yuǎn)的生物個(gè)體之間沒有比較意義.應(yīng)用AP-PCR法進(jìn)行2種或多種表型特征

7、類似的個(gè)體間指紋圖譜分析或表型相關(guān)基因克隆箭頭所指擴(kuò)增帶為特異于個(gè)體()的擴(kuò)增產(chǎn)物AP-PCR的操作一般接受兩步法,即前10個(gè)循環(huán)多以較低的退火溫度(annealingtemperature)進(jìn)行擴(kuò)增,后20個(gè)循環(huán)則接受較高的退火溫度擴(kuò)增。AP-PCR產(chǎn)物多較短,一般需高濃度的瓊脂糖凝膠檢測,也可用聚丙烯酰胺凝膠檢測。如擴(kuò)增的模板為mRNA,通過比較擴(kuò)增產(chǎn)物的強(qiáng)度,可以得知該基因在2種生物或同一生物不同發(fā)育階段的表達(dá)強(qiáng)度。另外,在AP-PCR檢測到與某一表型相關(guān)的基因或基因產(chǎn)物(mRNA)以后,下一步工作就是克隆出整個(gè)基因或mRNA。主要操作程序?yàn)?)AP-PCR產(chǎn)物的提取、克隆及序列測定。首

8、先將AP-PCR檢測到的特定片段從凝膠中切下,提取DNA克隆到適宜的載體內(nèi)(如TA載體),再測定其核苷酸組成。依據(jù)其核苷酸組成設(shè)計(jì)2個(gè)方向相反的引物(P-1,P-2,見圖2)。引物長度多在20 nt以上；退火溫度在60以上；(2)將基因組DNA做適當(dāng)酶切,然后在其兩端連接上相同的接頭(這種接頭可從生物制品公司購買)。依據(jù)接頭的序列擴(kuò)增。3.2DifferentialdisplayPCR(DD-PCR)DD-PCR是在AP-PCR基礎(chǔ)上創(chuàng)造的一種RT- PCR方法,主要用于2種或多種類似生物個(gè)體在基因表達(dá)上的差異分析。其基本原理是:全部真核生物的成熟mRNA都含有不同長度的poly (A)尾部序

9、列,依據(jù)poly (A)內(nèi)部的2個(gè)核苷酸排列的不同,可以將全部的mRNA分子分為12類(見圖3)。依據(jù)這12種mRNA序列可合成12種相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄引物，即 MNTTTTTTTT,用其分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,即可將全部mRNA分類合成12種cDNA(于12個(gè)試管內(nèi))，然后再用隨機(jī)引物,以這12種 cDNA分別做模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(見圖1和圖4)，那么與表型相關(guān)的mRNA就很簡潔被發(fā)覺并克隆出來。但不論AP-PCR還是DD-PCR,都適用于 2種種源近似生物或不同發(fā)育階段的同一個(gè)體之間的比較。因而,其PCR的模板必需是來自2個(gè)生物或同一生物的不同發(fā)育階段的mRNA。DD-PCR的優(yōu)點(diǎn) 是快速、便利,可以檢

10、測表達(dá)量極低的mRNA，但其技術(shù)條件要求較高，所擴(kuò)增的mRNA的質(zhì)量不能有差異,即mRNA不應(yīng)降解。目前這一方法已廣泛應(yīng)用于 生物表型相關(guān)基因的克隆及比較爭辯。3.3RepresentativedifferenceanalysisPCR (RDA-PCR)35這 是一種差減雜交 (subtractivehybridizatio-n)與PCR相結(jié)合的技術(shù)，其整個(gè)操作程序完全不同于AP-PCR和DD-PCR。前2種方法是將 兩模板DNA或cDNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,最終通過擴(kuò)增產(chǎn)物的差異,分別和克隆特異擴(kuò)增帶,其缺點(diǎn)是需要將特異擴(kuò)增產(chǎn)物從膠中切下來,提取DNA,再擴(kuò) 增后才能克隆。RDA-PCR只

11、擴(kuò)增區(qū)分于某一表型的特異基因，因而更便于擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆與分析(見圖5)。其基本原理是：用一個(gè)在種源上相近的基因組將 靶基因組中全部共同的基因掩蓋起來,而只暴露出特異的基因,在整個(gè)反應(yīng)中只有特異基因能被擴(kuò)增。其操作程序?yàn)?(1)用同一限制性內(nèi)切酶(一般用Bam HI,Bgl II或Hind III)同時(shí)處理靶基因組和掩蓋基因組DNA，其中掩蓋基因組DNA的量至少要2倍于靶基因組DNA的量；(2)在經(jīng)酶切的靶基因組片段的兩端加上連接 頭,其序列與酶切產(chǎn)生的粘性末端的序列相對(duì)應(yīng)；(3)將2個(gè)基因組的DNA混合后,高溫變性,低溫退火。由于掩蓋基因組DNA的量遠(yuǎn)大于靶基因組DNA 量,那么與掩蓋基因組D

12、NA相同的靶基因就會(huì)與掩蓋基因形成雜合體，而只有特異的靶基因才能重新組合,不會(huì)受掩蓋基因的影響；(4)用Taq DNA聚合酶將粘性末端補(bǔ)齊后,加入與連接子相對(duì)應(yīng)的引物,經(jīng)過30個(gè)左右的PCR擴(kuò)增,就可以將靶基因組中與掩蓋基因不同的特異基因擴(kuò)增出來。這種方法 的起始操作程序較簡單,各反應(yīng)步驟要求精確無誤,但其檢測的精確度較高。對(duì)于基因組內(nèi)的點(diǎn)突變、重排、插入序列等變化均可檢測出來。4用特異抗體克隆基因 用抗體克隆基因的關(guān)鍵是抗體的特異性。一般以單克隆抗體最為理 想。獵取特異抗體的方法主要有:(1)制備識(shí)別功能抗原的單克隆抗體;(2)將SDS-PAGE分別的蛋白質(zhì)特異帶切下免疫動(dòng)物,其抗體只識(shí)別該

13、特異蛋白 質(zhì);(3)用Western-blot法將識(shí)別某一蛋白質(zhì)帶的抗體從膜上洗脫下來。在獵取抱負(fù)的抗體后,便可以用這些抗體篩選表達(dá)型基因組文庫或cDNA 文庫,從文庫中將編碼某一特異蛋白質(zhì)的基因克隆出來。 5特異基因的功能克隆 它是借助于基因產(chǎn)物即基因所編碼的蛋白質(zhì)的功能將該基因克隆出來的一種方法?；虻墓δ芸寺≈饕?種:一是phage display6，7,另一是 peptidedisplay。后者的原理與前者基本相同。目前以phage display的應(yīng)用最為廣泛,本文只對(duì)這一方法加以介紹。任何一種病原體，包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲,在其對(duì)宿主侵入或致病過程中,病原體本身的蛋白質(zhì)成分(li

14、gand)需要首先與宿主細(xì)胞上的受體 (receptor)相互識(shí)別連接。如口蹄疫病毒需要借助于受體細(xì)胞上的Heparansulfate受體，并與其相互作用后才能侵入細(xì)胞內(nèi)；巴貝斯蟲 裂殖子需借助于宿主的補(bǔ)體作為橋梁，才能與紅細(xì)胞結(jié)合并最終侵入紅細(xì)胞內(nèi)。對(duì)病原體與宿主受體相互作用成分的特性與功能分析,是制訂免疫預(yù)防措施及制備阻 斷藥物的前提。phagedisplay法是克隆病原體ligand的一種最為抱負(fù)的手段。Phagedisplay的基本操作過程為:(1)提取某一病原體基因組DNA,用超聲波將DNA切割成5001 500的片段;(2)將片段末端用T4DNA聚合酶處理后,與載體DNA(phag

15、emid)連接形成噬菌體質(zhì)粒。用這些質(zhì)粒與幫助噬菌體(helper phage)同時(shí)轉(zhuǎn)染大腸桿菌。phagemid在大腸桿菌內(nèi)包裝成噬菌體,大量繁殖,同時(shí)將插入的外源基因片段表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物主要集中在噬菌體顆粒的 表面；(3)將特定的受體固定于載體上(多為ELISA板),方法同一般的ELISA包被。將噬菌體懸液作適當(dāng)稀釋后,加入平板孔內(nèi),感作一段時(shí)間,用 PBS等緩沖液漂洗。最終,只有表達(dá)特異功能蛋白的噬菌體才能與包被在平板上的受體相互結(jié)合,那些表達(dá)非相關(guān)蛋白的噬菌體由于不能與受體連接而被洗脫; (4)用高強(qiáng)度NaCl液將結(jié)合在受體上的噬菌體分別下來,再感染大腸桿菌,便可將編碼特異功能蛋白質(zhì)的基因克隆。一個(gè)真核生物至少 含