抗血清制備及抗體效價(jià)檢測(cè)

1、短期免疫抗血清制備及抗體效價(jià)檢測(cè)黃健，應(yīng)技摘要 通過(guò)一定程序注射顆粒性抗原或可溶性抗原免疫小鼠和家兔，是實(shí)驗(yàn)室制備多克隆抗血清的常用方法。雖然依據(jù)常規(guī)免疫方案可以制備出效價(jià)高、親和力強(qiáng)的抗血清，但整個(gè)常規(guī)方案耗時(shí)近個(gè)多月，也容易受到免疫動(dòng)物健康狀況的影響和飼養(yǎng)成本的限制。本試驗(yàn)以牛血清白蛋白為抗原縮短免疫注射周期，對(duì)小鼠和家兔進(jìn)行短程快速免疫。并進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)，以探討短程快速免疫方案的實(shí)效性。關(guān)鍵詞 免疫，抗血清，抗原，ELISA主線實(shí)驗(yàn)分為三個(gè)小實(shí)驗(yàn)分別為：實(shí)驗(yàn)一：免疫小鼠（每組一只），家兔（每班一只）。實(shí)驗(yàn)二：對(duì)免疫后的小鼠和家兔進(jìn)行抽血、放血，其中老鼠采用斷尾取血家兔采用頸動(dòng)脈放血，分離抗

2、血清 。實(shí)驗(yàn)三：ELISA測(cè)定抗體效價(jià)。另有一個(gè)穿插實(shí)驗(yàn)：血型鑒定。1 實(shí)驗(yàn)一：免疫用具有抗原性的物質(zhì)注入到健康動(dòng)物的機(jī)體后，將引起免疫應(yīng)答，并會(huì)形成漿細(xì)胞，分泌抗體?？贵w主要存在于血清中，經(jīng)多次免疫，使血清中的抗體量達(dá)到要求濃度，然后采集動(dòng)物血液，再?gòu)难褐蟹蛛x析出血清，從而獲得抗血清。為了制備高效價(jià)的抗血清，我們需要考慮下列五個(gè)因素。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫反應(yīng)性，抗原的免疫原性，抗原的劑量，免疫途徑，免疫時(shí)間間隔。1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇常用的免疫動(dòng)物有家兔、羊、馬、大鼠、小鼠、豚鼠等。免疫用動(dòng)物應(yīng)選適齡、健壯，最好為雄性。家兔一般選擇選擇年齡在6個(gè)月以上當(dāng)年繁殖的性，體重23公斤，健康家兔三只，免疫

3、前用金屬編號(hào)牌固定兔耳，或用染料涂沫在動(dòng)物的背部，作出明確的標(biāo)記。同時(shí)應(yīng)考慮抗原與動(dòng)物的種屬關(guān)系、抗原性質(zhì)與動(dòng)物種類、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及動(dòng)物個(gè)體等因素。我們此次選用小白鼠（每組一只），家兔（每班一只）。1.2實(shí)驗(yàn)步驟1).編號(hào)標(biāo)記35苦味酸溶液或8090苦味酸酒精飽和液分別標(biāo)記左前腿上部為1，左腰部為2，左后腿為3，頭部為4，背部為5，尾基部為6，右側(cè)從前至后依次為7、8、9。2).免疫合成免疫原為2mg(半抗原約為20200 g)。家兔為300600 g/次（400），每次不超過(guò)2mL；小鼠為10100 g /次（10-20，2040 g / ml），每次不超過(guò)0.5mL。

4、首免需要與等體積的福氏完全佐劑混合，二免與等體積的不完全福氏佐劑混合，三免、四免不用佐劑。家兔可采用皮下（腳掌），皮內(nèi)，耳靜脈，肌肉，淋巴結(jié)等不同部位進(jìn)行免疫。小鼠則采用腹腔注射，方法為以左手抓住動(dòng)物，使腹部向上，右手將注射針頭于左（或右）下腹部刺入皮下，使針頭向前推 0.51.0cm，再以45度角穿過(guò)腹肌，固定針頭，緩緩注入藥液。（為避免傷及內(nèi)臟，可使動(dòng)物處于頭低位，使內(nèi)臟移向上腹。）2 實(shí)驗(yàn)二：抽血、放血，分離抗血清2.1取血1).老鼠采用斷尾取血將小鼠放入一個(gè)蓋子上打孔的恰好能放進(jìn)老鼠的離心管中，尾吧從蓋子孔中穿出用以固定小鼠。先用酒精棉球?qū)π∈笪膊磕┒讼?，然后用消毒后的手術(shù)

5、剪剪斷小鼠尾部末端。用1ml離心管接血，為了讓血液盡可能快的流出，可用手從上而下按摩小鼠尾部。2).家兔采用頸動(dòng)脈放血家兔固定（仰臥，身體及頭部固定）-剪毛（頸部）-找頸動(dòng)脈管（消毒-剖開(kāi)頸部；開(kāi)皮、膜、肌肉，找到氣管兩邊的頸動(dòng)脈管（桃紅色，有脈動(dòng)）-小心分開(kāi)動(dòng)脈上的肌肉、神經(jīng)（2條，白色）等-開(kāi)口（見(jiàn)圖）-放血，接入100ml無(wú)菌空三角瓶。（注意：看到氣管，停用所有銳器，可用止血鉗、鈍玻棒。注意不要剪破毛細(xì)動(dòng)脈管?。?.2抗血清的分離，保存斜置裝血液的三角瓶0.5-1h；用無(wú)菌玻棒剝落、松動(dòng)瓶壁上的血塊（利于血清析出）；原樣包扎好三角瓶，與裝有小鼠血液的離心管一同做好記號(hào)，放進(jìn)冰箱（4）過(guò)夜

6、；次日（時(shí)間待定）：估計(jì)各班分離的血清量并觀察描述血清顏色；去血塊，離心取上清（3000rpm,20min），加疊氮鈉（終濃度為0.1%，注意防護(hù)?。?，混勻，分裝小管，作好標(biāo)記，-20或-80保存待測(cè)。3 實(shí)驗(yàn)三：ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay， 簡(jiǎn)稱ELISA)是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)。 ELISA過(guò)程包括抗原(抗體)包被在固相載體上，加待測(cè)抗體(抗原), 再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體(抗原)，生成抗原(抗體)-待測(cè)抗體(抗原)-酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計(jì)

7、的光吸收計(jì)算抗體(抗原)的量。3.1實(shí)驗(yàn)材料牛血清白蛋白（BSA) 抗原，10 g/ml溶液，包被液配制鼠抗BSA 待測(cè)抗體樣品，用PBST從1：1000開(kāi)始倍比稀釋，連續(xù)稀釋8個(gè)稀釋度HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG 二抗（按說(shuō)明書(shū)稀釋使用，用PBST稀釋。每班8個(gè)板，480孔，總量48000 l，實(shí)際5.5 l到55ml）包被緩沖液：0.05 M pH 9.6碳酸鹽緩沖液（Na2CO3 1.59克，NaHCO3 2.93克，加水900ml，調(diào)pH，再定容至1L）0.01M PBS溶液（NaCl 8.5 g, Na2HPO4.12H2O 2.85g或Na2HPO4.2H2O 1.13g，KCl 0.

8、2g， KH2PO4 0.27g，蒸餾水定容至1000ml，pH7.4）PBST洗滌液：含0.05 % Tween 20的0. 0001 M 的PBS（ pH 7.4 ）底物溶液：TMB（ 3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺） 2M H2SO4 （市售濃硫酸為18.4 M，根據(jù)要配制的2M硫酸體積，吸管吸好相應(yīng)體積濃硫酸沿著器壁緩慢加到水中）酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀，保鮮膜，排槍3.2實(shí)驗(yàn)步驟1).加抗原：取酶標(biāo)板，加入100l/孔的抗原溶液（用包被緩沖液稀釋，用排槍加）2).包被抗原：保鮮膜包好， 37 1h或4 過(guò)夜抗原分子通過(guò)疏水作用力結(jié)合到96微孔板上3).封閉：甩干后以PBST（200l/孔）洗滌3

9、次，3min/次每孔加入100 l 5%（W/V)脫脂奶粉溶液（用PBS溶液配制）保鮮膜包好， 37， 2h4).加待測(cè)血清取出包被、封閉好抗原的酶標(biāo)板,甩干孔內(nèi)液體以PBST（200l/孔）洗滌3次，3min/次標(biāo)記各孔，加入相應(yīng)稀釋度的抗體100l/孔（用PBST稀釋，按示意圖用單槍加）37，保鮮膜包好，60min5).加二抗：甩干孔內(nèi)液體以PBST（200l/孔）洗滌4次，3min/次各孔加入酶標(biāo)二抗100l/孔（用PBST稀釋10000X,全班每8板需48ml，實(shí)配55ml）37，保鮮膜包好，45min6).顯色：甩干孔內(nèi)液體以PBST（200l/孔）洗滌4次，3min/次加入TMB底物溶液50L/孔避光顯色10min(抽屜中），然后每孔加入50 l 的2M 硫酸終止反應(yīng)3.3結(jié)果分析B2到D3的值都在0.1以下，與后面的值差別不大，說(shuō)明免疫效果很不好。原因可能是多方面的。但是不可否認(rèn)的是短期免疫可靠性不大，即使是做出了抗血清，也基本只能達(dá)到22到23的稀釋度。4 玻片法血型鑒定（興趣實(shí)驗(yàn)）4.1實(shí)驗(yàn)方法和步驟1).受檢抗原（血樣）制備： 用酒精棉球消毒手指-待干后用無(wú)菌5#針刺消毒部位-取一滴血（大