無菌檢查方法的驗證

1、無菌檢查方法的驗證無菌檢查方法是為了檢查藥典要求無菌的制劑及其他制品是否無菌而建立的試驗方法， 是作為無菌產(chǎn)品批放行的重要依據(jù)及藥監(jiān)部門對無菌產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)管的一個重要工程。 因此如 何確保無菌檢查方法的準(zhǔn)確可靠至關(guān)重要， 而檢查方法的驗證是保證檢查結(jié)果的公正、 科學(xué) 和準(zhǔn)確的根底，因此各個主要國家的GMP或藥典都對無菌檢查方法的驗證提出了嚴(yán)格的要求，2022版中國藥典對分析方法驗證和檢查的要求也有大幅度的提高，同時也是GMP僉查中檢查的重點和容易發(fā)現(xiàn)問題的區(qū)域。驗證要求與方法無菌檢查方法驗證一般分為前驗證和再驗證兩種。前驗證，也稱預(yù)驗證，指在無菌分析方法正式使用前，按照預(yù)定驗證方案進(jìn)行的驗證。

2、如果沒有充分的理由，任何檢查方法必須進(jìn)行前驗證。再驗證， 指某一檢查方法經(jīng)過驗證并在使用一段時間后進(jìn)行的，旨在證實已驗證狀態(tài)沒有發(fā)生飄移而進(jìn)行的重新驗證及對檢查方法進(jìn)行修訂、改變時進(jìn)行的驗證。通常一個無菌產(chǎn)品的檢查流程為： 首先基于產(chǎn)品的劑型、 溶解度等性質(zhì)， 按照藥典的要 求確定是否需要進(jìn)行前處理 ; 然后根據(jù)產(chǎn)品的特性是否有抑菌性，確定是否需要增加去除產(chǎn) 品抑菌性的方法 ; 最后驗證整個檢查方法中用到的一切及試驗過程中的每一個環(huán)節(jié)包括樣品 的預(yù)處理方式、檢查過程、培養(yǎng)條件等均不影響樣品中微生物的生長。這里，驗證的重點環(huán)節(jié)包括：前處理方法直接影響后續(xù)步驟的效果和重現(xiàn)性，應(yīng)是驗證的重點。供試品

3、中抑菌活性的去除是當(dāng)前驗證工作的重點， 尤其強(qiáng)調(diào)應(yīng)充分驗證供試品本身對微 生物生長的影響。具體的驗證方法如下：菌種的選擇無菌檢查方法驗證中通常選擇以下 6 種試驗中常用的控制菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株， 它們分別代表 不同類型的菌種：枯草芽孢桿菌 CMCC(B)63 501 代表藥品中常見的污染菌芽孢桿菌、 金黃色葡萄球菌 CMCC(B)26 003 代表革蘭陽性菌、 生孢梭菌 CMCC(B)64 941代表厭氧菌、 大腸埃希菌 CMCC(B)44 102 代表革蘭陰性菌、白色念珠菌 CMCC(F)98 001 代表酵母菌、 黑曲霉菌 CMCC(F)98 003 代表霉菌。菌液的制備接種金黃色葡萄球菌、 大

4、腸埃希菌、 枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，3035 C培養(yǎng)1824h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，2328C培養(yǎng)2448h,上述培養(yǎng)物用 0.9%無菌氯化鈉溶液制成每 1ml含菌數(shù)小于100cfu的 菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，2328 C培養(yǎng)57天，加入 35ml 含 0.05%ml/ml 聚山梨酯 80的 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適 宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)， 用含 0.05%ml/ml 聚山梨酯 80的 0.

5、9%無菌氯化鈉溶 液制成每1ml含孢子數(shù)小于100cfu的孢子懸液。樣品的前處理無菌產(chǎn)品中每個成分應(yīng)該是均勻的， 因此只要確定在驗證的方法中， 按所需的總接種量 即可，而不必像樣品日常檢測中按規(guī)定的容器數(shù)取樣。如果制備樣品時需要使用溶解劑、稀釋劑、助溶劑、 破乳劑等溶劑，需要確保這些溶劑 是有效的，并且其使用對微生物生長無影響 ; 或者制備過程中需要對樣品進(jìn)行加熱助溶、離 心等操作時，需要確保加熱的溫度、離心速度和離心時間等對微生物生長或分布無影響。不需前處理的樣品免做。消除樣品抑菌性的方法無抑菌性樣品的驗證方法： 依據(jù)產(chǎn)品溶解性和微生物限度選擇適宜的中性稀釋劑溶解和 稀釋，用直接接種法驗證，

6、常用中性稀釋液或淋洗液。對于具有抑菌性樣品的驗證方法，首先確定樣品的抑菌作用 抑細(xì)菌、真菌試驗驗證 ， 選擇敏感標(biāo)準(zhǔn)菌株對供試品抑菌活性去除效果檢查 陽性菌回收試驗 。常用的消除樣品抑 菌活性的方法如下：稀釋法：利用降低供試品的相對濃度，將樣品稀釋至最低抑菌濃度下進(jìn)行。如：取規(guī)定 量的樣品溶液至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的樣品含量減少，至不含抑菌作用。薄膜過濾法：利用體積差異別離，通過薄膜過濾，微生物被截于濾膜，培養(yǎng)薄膜觀察有無微生物生長。通常薄膜孔徑應(yīng)不大于0.45卩m直徑一般為 50?mm假設(shè)采用其他直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。 濾器和濾膜在使用前采用適宜的方法進(jìn)行滅菌。 使用

7、時應(yīng) 保證濾膜在過濾前后的完整性。 水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試液其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分枯燥。供試液經(jīng)過濾膜過濾后，假設(shè)需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為100?ml?？倹_洗量不得超過 1000ml。化學(xué)中和法：利用化學(xué) 生物專屬性滅活，常用中和劑或滅活方法有：對氨基苯甲酸、卵磷脂、聚山梨酯-80等。對化學(xué)中和劑不敏感的樣品，用酶中和，如3 -內(nèi)酰胺酶。聯(lián)合使用：將以上兩種或幾種方法組合運用， 以消除樣品的抑菌性。 適用于抑菌作用較 強(qiáng)的中西藥制劑。其次按照以下要求制備 3 組樣品：樣品組：選擇以上適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ泻蜆悠?，參加少量驗證微生物接種量少于 10

8、0?cfu 。對照組： 0.1%蛋白胨或 pH7.0 無菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液 ,加少量微生物 接種量少于 100?cfu 。陽性對照組：將試驗菌株直接接種于培養(yǎng)基中 接種量少于 100cfu 。最后結(jié)果分析如下：樣品組與對照組微生物生長數(shù)量相似， 說明中和劑的中和方式有效消除了樣品的抑菌性 即有效性 ，如果對照組與陽性對照組的微生物數(shù)量相似， 說明樣品預(yù)處理、 消除樣品抑菌 性的方法、 檢測程序和培養(yǎng)條件等均不影響微生物生長 即無毒性 。樣品如無抑菌性， 省去 對照組試驗， 樣品組與陽性對照組直接比擬。 樣品組微生物生長數(shù)量不及陽性對照組微生物 生長數(shù)量， 說明樣品的預(yù)處理、 試驗用器具

9、材料、 培養(yǎng)條件等方面存在對微生物生長不利的 因素。為考查驗證方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，驗證至少需 3 個不同批次的同類樣品，分別進(jìn)行 3 次驗證試驗。無菌檢查方法驗證試驗設(shè)計薄膜過濾法： 按照藥典的要求取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的樣品總量按薄膜過濾法過濾、 沖 洗，在最后一次的沖洗液中參加小于 100cfu 的試驗菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽 流體培養(yǎng)或改良馬丁培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾桶內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器， 參加等量試驗菌，作為對照。按照藥典的要求的溫度和時間進(jìn)行培養(yǎng)。直接接種法： 取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 8 管，分別接 入小于 100cfu 的金黃

10、色葡萄球菌、 大腸埃希菌、 枯草芽孢桿菌、 生孢梭菌各 2 管 ;取符合直 接接種法培養(yǎng)基用量要求的改良馬丁培養(yǎng)基 4 管，分別接入小于 100?cfu 的白色念珠菌、 黑 曲霉各 2管。其中1管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量， 另1管作為對照， 按照藥典的 要求的溫度和時間進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果判斷同對照管比擬，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，那么說明驗證通過; 如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、 緩慢或不生長，驗證失敗，應(yīng)采用增加沖洗量、增加培 養(yǎng)基的用量、使用中和劑和滅活劑、 更換濾膜等方法，消除供試品的抑菌作用，重新進(jìn)行驗 證。新GMF檢查重點首先要檢查方法驗證方案設(shè)計的科學(xué)性和

11、完整性， 是否有與藥典方法相悖的地方， 尤其 是產(chǎn)品本身的抑菌性，檢查方法的選擇，是直接接種法還是薄膜過濾法等。無菌檢查方法驗證的硬件是否具備及是否已經(jīng)進(jìn)行了相關(guān)確實認(rèn)。 如使用黑曲霉菌是否 具有生物平安柜并進(jìn)行確認(rèn)， 無菌室確實認(rèn)及日常監(jiān)測， 培養(yǎng)箱的型號及數(shù)量和進(jìn)行確認(rèn)的 情況等，智能集菌器、全封閉無菌試驗過濾培養(yǎng)器的型號、性能，濾膜是否符合規(guī)定等。驗證中各個環(huán)節(jié)有關(guān)數(shù)據(jù)的真實性， 如產(chǎn)品本身抑菌性試驗數(shù)據(jù)， 菌種回收率和培養(yǎng)基 適用性和靈敏度檢查數(shù)據(jù)， 菌種的傳代、 銷毀和使用記錄， 無菌檢查操作記錄、 培養(yǎng)記錄等。無菌檢查中偏差的處理是否真的找到了根本原因， 是否在沒有確切的原因前就對

12、樣品重 新檢查并依據(jù)新的檢查結(jié)果放行產(chǎn)品。驗證的方法與無菌檢查操作規(guī)程和無菌檢查記錄是否完全一致，如操作步驟、 檢查方法、檢查環(huán)境、試驗耗材均需與實際檢查操作規(guī)程及驗證過程完全相符。為了考查驗證方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，驗證時是否至少采用了3 個不同批次的同類樣品，分別進(jìn)行了 3 次驗證試驗。使用新的濾膜或過濾器 不同廠家或批號、 型號 是否重新進(jìn)行樣品試驗組、 蛋白胨對照 組和陽性對照組的驗證確認(rèn)。除非樣品不能采用過濾的方法難溶解 ，企業(yè)是否采用全封閉的薄膜過濾法。菌液的保存條件和保存期限是否符合藥典的要求， 對于黑曲霉孢子懸液是否有驗證的資 料。無菌檢查的考前須知 培養(yǎng)基的適用性檢查包括培養(yǎng)基

13、的無菌性檢查和培養(yǎng)基的靈敏度檢查。 中國藥典附錄中規(guī)定的檢驗數(shù)量不包括陽性對照用樣品量，雖然附錄另處有專門說明，仍然容易忽略。無菌檢查時應(yīng)強(qiáng)調(diào)“檢驗數(shù)量， 主要是保證試驗結(jié)果的代表性， 而陽性對照試驗和驗 證時僅須滿足“檢驗量總量要求即可， 以保證試驗結(jié)果的可靠性， 驗證試驗可以由此減少 大量的樣品 ;工作菌株的傳代次數(shù)不得超過 5 代，以防止過度的傳代增加菌種變異的風(fēng)險。這里“代的定義是指， 活的培養(yǎng)物接種到微生物生長的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 任何亞培養(yǎng)的形式 均被認(rèn)為是轉(zhuǎn)種或傳代一次。菌液參加，按規(guī)定應(yīng)在最后一次沖洗液中參加陽性菌液，主要是考慮過濾器的有效性。 過濾器的有效性應(yīng)由提供企業(yè)控制，

14、用戶可采用適當(dāng)方法抽查 如檢查陽性菌液通過濾筒的 流出液 。實驗室菌種的處理和保存的程序應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化，以盡可能減少菌種污染和變異。 試驗時菌懸液并不是只要活的菌體就行， 而是要保持旺盛的生命力， 所以菌懸液存放時間不能太長。菌液制備后假設(shè)在室溫下放置，應(yīng)在2?h內(nèi)使用，假設(shè)保存在 28C,可在24?h內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28 C,在驗證過的貯存期內(nèi)使用。薄膜過濾法采用大樣品量集菌的方法，具有代表性，不易漏檢，儀器操作相對簡單。該系統(tǒng)是全封閉過濾系統(tǒng)，防止了操作過程中外源性微生物的污染，對試驗結(jié)果的可信性影響較小。因此無菌試驗采用薄膜過濾法還是直接接種法并不依賴于驗證結(jié)果，而是取決于樣品的特性，如能采用過濾的方法均應(yīng)采用薄膜過濾法檢查。假設(shè)樣品含有抑菌成分，當(dāng)采用薄膜過濾法時，應(yīng)先將供試液稀釋后在過濾，這樣可以減少濾膜對樣品的吸附，減少沖洗量，進(jìn)而減少微生物的損失或傷害。無菌檢查應(yīng)作為穩(wěn)定性考察的工程進(jìn)行，以便對產(chǎn)品有效期的制定和合理確實定儲存條件提供重要的依據(jù)。陽性結(jié)果的調(diào)查：在無菌檢查中必須小心防止任何可能污染樣品的行為。一旦發(fā)現(xiàn)微生物生長，該批產(chǎn)品就被判斷非無菌，必須進(jìn)行調(diào)查。只有可以造成微