分子生物學(xué)基本技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用VIP

1、分子生物學(xué)基本技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用 DNA重組技術(shù)（或基因工程）是20世紀(jì)生物學(xué)的偉大成就，并已滲透到生命科學(xué)包括醫(yī)學(xué) 各個(gè)領(lǐng)域，為腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究和臨床診斷及治療提供了嶄新的技術(shù)和有用的工具。扼要介紹在分子腫瘤學(xué)領(lǐng)域中常用的分子生物學(xué)基本技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用，著重介紹它們的原理和應(yīng)用。至于具體的技術(shù)方法和操作步驟可參閱分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第二版，科學(xué)出版社，1992年）等實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)。一、常用的分子生物學(xué)基本技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測(cè)方法的靈敏性，它已成為分子生物學(xué)中最常用的基本技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的

2、檢測(cè)等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強(qiáng)度等）可按堿基互補(bǔ)原成雙鏈。雜交的雙方是待測(cè)核酸序列及探針（probe）,待測(cè)核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細(xì)胞總RNA。核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或RNA片段。根據(jù)其來(lái)源和性質(zhì)可分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。固相雜交固相雜交（solid-phase hybridization）是將變性的DNA固定于固體基質(zhì)（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進(jìn)行雜交，故也稱(chēng)為膜上印跡雜交。斑步

3、雜交（dot hybridization）是道先將被測(cè)的DNA或RNA變性后固定在濾膜上然后加入過(guò)量的標(biāo)記好的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。該法的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，事先不用限制性?xún)?nèi)切酶消化或凝膠電永分離核酸樣品，可在同一張膜上同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)；根據(jù)斑點(diǎn)雜并的結(jié)果，可以推算出雜交陽(yáng)性的拷貝數(shù)。該法的缺點(diǎn)是不能鑒定所測(cè)基因的相對(duì)分子質(zhì)量，而且特異性較差，有一定比例的假陽(yáng)性。印跡雜交（blotting hybridization）Southern印跡雜交：凝膠電離經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶消化的DNA片段，將凝膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤固定，再與相對(duì)應(yīng)

4、結(jié)構(gòu)的已標(biāo)記的探針進(jìn)行那時(shí)交反應(yīng)，用放射性自顯影或酶反應(yīng)顯色，檢測(cè)特定大小分子的含量。可進(jìn)行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RELP）等。Northern印跡雜交:由Southerm印雜交法演變而來(lái)，其被測(cè)樣品是RNA。經(jīng)甲醛或聚乙二醛變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，進(jìn)行雜交反應(yīng)，以鑒定基中特定mRNA分子的量與大小。該法是研究基因表達(dá)常用的方法，可推臬出癌基因的表達(dá)程度。差異雜交（differential hybridization）是將基因組文庫(kù)的重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用兩種混合的不同cDNA探針（如：轉(zhuǎn)移性和非

5、轉(zhuǎn)移性癌組織的mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA）分別與濾膜上的DNA雜交，分析兩張濾膜上對(duì)應(yīng)位置雜交信息以分離差異表達(dá)的基因。適用于基因組不太復(fù)雜的真核生物（如酵母）表達(dá)基因的比較，假陽(yáng)性率較低。但對(duì)基因組非常復(fù)雜的鹽酸核生物（如人），則因工作量太大，表達(dá)的序列所占百分比較低（僅5左右），價(jià)值不大。cDNA微點(diǎn)隈雜交（cDNA microarray hybridization）是指將cDNA克隆或cDNA的PCR產(chǎn)物以高度的列陣形式排布并結(jié)合于固相支持物上（如：尼龍膜或活化的載玻片）以微點(diǎn)陣，然后用混合的不同DNA探針與微點(diǎn)陣上的DNA進(jìn)行雜交。再利用熒光、化學(xué)發(fā)光、共聚焦顯微鏡等技術(shù)掃描微點(diǎn)陣上的

6、雜交信息。它比差異雜交技術(shù)的效率高、速度快、成本低，適用于大規(guī)模的分析。已成商品問(wèn)世。其缺點(diǎn)是無(wú)法克服保守的同源序列及重序?qū)﹄s交信息的干擾。寡核苷酸微點(diǎn)隈雜交（oligonucleotide microarray hybridization）是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共價(jià)結(jié)合于支持物表面，與平均長(zhǎng)度為20-50nt的混合RNA或cDNA探針進(jìn)行雜交，以提高雜交的特異性和靈敏度。應(yīng)用共聚焦顯微鏡可檢測(cè)跨越三個(gè)數(shù)量級(jí)的雜交信息。適用于低豐度mRNA的檢測(cè)，以區(qū)分基因家族不同成員的差異表達(dá)特征，或鑒定同一轉(zhuǎn)錄在不同組織和細(xì)胞中的選擇性剪接。但有工作量較大、成本較高、速度較慢等弱點(diǎn)。

7、液相雜交（solution hbridization）指使變性的待測(cè)核酸單鏈與放射笥核素標(biāo)記的已知的酸單鏈（探針）在溶液中保溫，使之形成雜交復(fù)合物。反應(yīng)結(jié)束后，用羥磷灰石法或酶解法將未被雜交的單鏈和雜交雙鏈分開(kāi)，然后結(jié)膈后在雜妝分子中的探針量，就可推算出被測(cè)的核酸量。遞減雜交（subtractive hybridizatio）是利用兩種來(lái)源一致而功能不同的組織細(xì)胞提取mRNA（或逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA）,在一定的條件下以過(guò)量的驅(qū)動(dòng)mRNA或cDNA與測(cè)試的單鏈cDNA或mRNA進(jìn)行液相雜交，通過(guò)羥基磷灰石柱層析篩選除去兩者間同源的雜交體。經(jīng)多輪雜交策選、除去兩者之間相同的基因成分，保留特異表達(dá)的目

8、的基因或工基因片段。以后者篩選cDNA文庫(kù)，可獲得特異表達(dá)的目的基因cDNA全長(zhǎng)序列。核酸原位雜交用特定標(biāo)記的已知順序核酸作為探針與細(xì)胞級(jí)或組織切片中核酸進(jìn)行復(fù)性雜交并對(duì)其實(shí)行檢測(cè)的方法，稱(chēng)為核酸原位雜交（nucleic acid hybridization in situ）。用來(lái)檢測(cè)DNA在細(xì)胞核或染色休上的分布，與細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行雜交以研究該組織細(xì)胞中特定基因表達(dá)水閏；還用于細(xì)胞、組織中有無(wú)特異性菌、病毒檢測(cè)的研究。該法的優(yōu)點(diǎn)是特異性高，可精確定位；能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響；不需要從組織中提取核酸，對(duì)于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性；并可完

9、整地保持組織與細(xì)胞的形態(tài)。因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)的研究，如基因定位、基因制失，基因易位、特異基因整合部物色檢測(cè)等研究。近年來(lái)由定性發(fā)展到定量，方法更為完善。DNA分子克隆技術(shù)（也稱(chēng)基因克隆技術(shù)）在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉(zhuǎn)入細(xì)胞獲得大量拷貝的過(guò)程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步驟包括：制備目的基因?qū)⒛康幕蚺c載體用限制性?xún)?nèi)切酶切割和連接，制成DNA重組導(dǎo)入宿主細(xì)胞篩選、鑒定擴(kuò)增和表達(dá)。載體（vecors）在細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制，并帶動(dòng)重組的分子片段共同增殖，從而產(chǎn)生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或NDA片段的大量拷貝，有了這些與親本分子完全相同的分子克隆，

10、就可以深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能，隨著引入的DNA片段不同，有兩種DNA庫(kù)，一種是基因組文庫(kù)（genomic library）,另一種是cDNA庫(kù)。載體所謂載體是指攜帶靶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具。細(xì)菌質(zhì)粒 是一種細(xì)菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，分子大小為1-20kb，對(duì)細(xì)菌的某些代謝活動(dòng)和抗藥性表型具有一定的作用。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上人工改造拼接而成。最常用的質(zhì)粒是pBR322。噬菌體（phaeg） 噬菌體是感染細(xì)菌的病毒，按其生活周期分為溶菌型及溶原型兩型。用野生型噬菌體改造和構(gòu)建的噬菌體載體是線性雙鏈DNA，基因組約為50kb，最常用的嘵菌體為DNA及其衍生系

11、列。黏性質(zhì)粒（cosmid） 是由質(zhì)粒與噬菌體DNA組成的一種4-6kb的環(huán)狀雜種DNA。表達(dá)型載體 將上述細(xì)菌質(zhì)粒載體或噬菌體載體接上啟動(dòng)基因及多聚核糖體的基因序列組成了表達(dá)型載體?；驇?kù)的建造含有某種生物體全部基歷的隨機(jī)片段的重組DNA克隆群體，其含有感光趣的基因片段的重組子，可以通過(guò)標(biāo)記探針與基因庫(kù)中的重組子雜交等方法而篩選出來(lái)，所得到的克隆經(jīng)過(guò)純化和擴(kuò)增，可用于進(jìn) 一步的研。其主步驟包括：（1）構(gòu)建基因庫(kù)迅速的載體；(2)DNA片段的制備；（3）DNA片段與載體DNA的連接；（4）包裝和接種。cDNA庫(kù)的建造是指克隆的DNA片段，是由逆轉(zhuǎn)錄酶自mRNA制備的cDNA。cDNA庫(kù)包括某特

12、定細(xì)胞的全部cDNA克隆的文庫(kù)，不含內(nèi)含子。特異基因的篩選常用的方法有：（1）克隆篩選即探針篩選法；（2）抗體檢測(cè)法，檢測(cè)其分泌蛋白質(zhì)來(lái)篩選目的基因；（3）放射免疫篩選法，查出分泌特異抗原的基因；（4）免疫沉淀法，進(jìn)行特異基因的篩選。核酸序列測(cè)定DNA的堿基序列決定著基因的特性，DNA序列分析 （測(cè)序，sequencing）是分子生物學(xué)重要的基本技術(shù)。無(wú)論從基因庫(kù)中篩選的癌基因或經(jīng)PCR法擴(kuò)增的基因，最終均需進(jìn)行核酸序列分析，可藉以了解基因的精細(xì)結(jié)構(gòu)，獲得其限制性?xún)?nèi)切酶圖譜，分析基因的突變及對(duì)功能的影響，幫助人工俁成基因、設(shè)計(jì)引物，以及研究腫瘤的分子發(fā)病機(jī)制等。測(cè)序是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝

13、膠電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化學(xué)降解少和Sanger的雙脫氧法等，近年來(lái)已有DNA序列自動(dòng)測(cè)定儀問(wèn)世?；瘜W(xué)降解法是在DNA的片段的5端標(biāo)記核素，然后用專(zhuān)一性化學(xué)試劑將DNA特異地降解，在電泳和自顯影后，可得到從標(biāo)記端延伸的片段供測(cè)讀序列和進(jìn)行比較。一般能讀出200-250個(gè)核苷酸序列。雙脫氧法是采用核苷酸鏈終止劑，如：2，3-雙脫氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一種)摻入到DNA鏈中以終止鏈的延長(zhǎng)，與摻入4種正常的dNTP的混合物分成四組進(jìn)行反應(yīng)，這樣可得到一組結(jié)尾長(zhǎng)衙不一、不同專(zhuān)一性核苷酸鏈終止劑結(jié)尾

14、的DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影，可讀出合成的DNA核苷酸序列，根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，可推算出模板DNA分子的序列?；瘜W(xué)降解法只需一化學(xué)試劑，重復(fù)性好，容易掌握；而雙脫氧法需單鏈模板、特異的寡核苷酸引物及高質(zhì)量的DNA聚合酶，便隨著M13噬菌體載體的發(fā)明和運(yùn)用，合成的引物容易獲得，測(cè)序技術(shù)不斷改進(jìn)，故此法已被廣泛應(yīng)用。基脫氧法的自動(dòng)激光熒光測(cè)序儀，使測(cè)工作更快速和簡(jiǎn)便，而且保證高度重復(fù)性。至于RNA測(cè)序現(xiàn)大多采用將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后同測(cè)序，然后反推RNA序列。聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)簡(jiǎn)稱(chēng)PCR技術(shù)，是一種利用DNA變性和復(fù)性原理在體外進(jìn)行特定的DNA片斷高效擴(kuò)增的技術(shù)，可檢

15、出微量靶序列（甚至少到1個(gè)拷貝）。在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴(lài)于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。僅需用極少量模板，在一對(duì)引物介導(dǎo)下，在數(shù)小時(shí) 內(nèi)可擴(kuò)增至100萬(wàn)-200萬(wàn)份拷貝。PCR反應(yīng)分三步：變性、退火及延伸。以上三步為一循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)的模板，這樣經(jīng)過(guò)九小時(shí)的循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)循環(huán)的模板，這樣經(jīng)過(guò)數(shù)上時(shí)的循環(huán)后，可得到大量復(fù)制的特異性DNA片段。反應(yīng)條件一般為94變性30秒，55退火30秒，70-72延伸30-60秒，共進(jìn)行30次循環(huán)左右，最后再延伸725分鐘，4冷卻終止反應(yīng)。1.逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)用來(lái)擴(kuò)增RNA的方法。2.競(jìng)爭(zhēng)逆

16、轉(zhuǎn)錄PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT-PCR)低豐度RNA定量的好方法。3.多重PCR（multiples PCR）在同一PCR體系中加入多對(duì)引物可用于基天長(zhǎng)度很長(zhǎng)，發(fā)生多處缺失的檢測(cè)。擴(kuò)增同一模板的幾個(gè)區(qū)域。4.多種PCR可同時(shí)加入多套以生物素標(biāo)記的引物起進(jìn)手PCR反應(yīng)。5.反向PCR（iverse polymerase chain reaction）對(duì)一個(gè)已知的DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究。6.不對(duì)稱(chēng)PCR在擴(kuò)增循環(huán)中引入不同引物濃度，以得到單鏈DNA并進(jìn)行列測(cè)定，以了解目的基因

17、的序列。7.錨定PCR（anchored polymerase chain reaction）幫助克服序列未知或序列未全知帶來(lái)的障礙。在未知序列未端添加同聚物尾序，將互補(bǔ)的引物連接于一段帶限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)的錨上，在錨引物和基因另一側(cè)特異性引物的作用下，將未知序列擴(kuò)增出來(lái)。8.著色互補(bǔ)試驗(yàn)或熒光PCR（color complementation assay or fluorescent PCR）原理是用不同熒光染粒，分別標(biāo)記于不同寡核苷酸引物上，同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA片段，反應(yīng)完畢后，利用分子篩選去多余的引物。用紫外線照射擴(kuò)增產(chǎn)物，就能顯示某一DNA區(qū)帶熒光染料顏色的組合，如果某一DNA區(qū)帶熒光染色

18、料顏色的組合，如果某一DNA區(qū)帶缺失，則會(huì)缺乏相應(yīng)的顏色。9.雙溫PCR（two-temperature PCR）僅僅執(zhí)行兩步溫度程序。合并退火與延伸溫度。一般常用溫度是94-95和46-47。可以提高反應(yīng)的速度和特異性。上述這些PCR技術(shù)的應(yīng)用：（1）PCR技術(shù)擴(kuò)增特定序列為基礎(chǔ)，采用多種方法進(jìn)行檢測(cè)，如PCR-RFLP、PCR-SSCP從已克隆的雙鏈DNA中產(chǎn)生特異性序列作為分子探針；（2）通過(guò)選擇性擴(kuò)增cDNA中產(chǎn)生特異性序列作為分子探針；（2）通過(guò)選擇性擴(kuò)增cDNA中的特殊片段，產(chǎn)生針對(duì)尚未克隆的基因的探針；（3）從微量mRNA中產(chǎn)生cDNA文庫(kù)；（4）產(chǎn)生大量用于序列分析的DNA；（

19、5）分析 基因突變；（6）做染色體步移。10.原位PCR技術(shù)：PCR雖然能擴(kuò)增包括福爾馬林固定、石蠟包埋組織的各種標(biāo)本的DNA，但擴(kuò)增的DNA或RNA產(chǎn)物不能在組織細(xì)胞中定位，因而不能直接與特定的組織細(xì)胞特征相聯(lián)系，這是該技術(shù)一個(gè)局限性。原位雜交雖具有良好的定位能力，但由于其敏感性問(wèn)題，尤其是在石蠟切片中，尚不能檢測(cè)出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR（In situ PCR,簡(jiǎn)稱(chēng)IS PCR），它可使擴(kuò)增的特定DNA片段在分離細(xì)胞和組織切片中定位，從而彌補(bǔ)了PCR和原位雜交的不足，具有良好的應(yīng)用前景。目前，已有多種設(shè)計(jì)的原位PCR擴(kuò)增儀系統(tǒng)問(wèn)世，使操作簡(jiǎn)便，軟件靈活，已成為拉增固定細(xì)胞

20、和石蠟包埋組織中特定DNA和RNA序列的有用工具。IS PCR的技術(shù)特點(diǎn)（1）既具有PCR的特異性與高靈敏性，又具有原位雜交的定位準(zhǔn)確性；（2）測(cè)到低于2個(gè)拷貝量的細(xì)胞內(nèi)特定DNA序列，甚至可檢測(cè)出單一細(xì)胞中的僅含一個(gè)拷貝的原病毒DNA；（3）有助于細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列定位與其形態(tài)學(xué)變化的結(jié)合分析；（4）可用于正常或惡性細(xì)胞，感染或非感染細(xì)胞的鑒定與區(qū)別。IS PCR的基本方法IS-PCR是PCR和原位雜交兩種技術(shù)的綾事，實(shí)質(zhì)是一種將靶DNA或RNA在原位擴(kuò)增后再進(jìn)行原位雜交的技術(shù)，操作程序基本兼有兩種技術(shù)的所有過(guò)程，首先在適當(dāng)處理的細(xì)胞和組織切片上滴加PCR反應(yīng)液，然后把載玻片放入熱循環(huán)儀中進(jìn)

21、行擴(kuò)增，最后通過(guò)標(biāo)記的探針進(jìn)行原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。初步應(yīng)用有關(guān)原位PCR技術(shù)應(yīng)用成功的第一篇報(bào)道是對(duì)感染綿羊中樞神經(jīng)系統(tǒng)visna病毒在綿羊脈絡(luò)從一細(xì)胞中檢查，通過(guò)PCR擴(kuò)增，僅用150堿基對(duì)的短探針就可通過(guò)ISH檢查到了細(xì)胞內(nèi)的visna病毒。從開(kāi)始在試管內(nèi)細(xì)胞行PCR擴(kuò)增后再涂片做ISH(原位雜交)檢查，已發(fā)展到用福爾馬林固定、石蠟切片的常規(guī)病理組織方法做原位PCR檢查。有傳統(tǒng)的標(biāo)記探針的原位PCR法（間接法），也有將標(biāo)記物先標(biāo)記PCR的引物，讓標(biāo)記物擴(kuò)增后再行ISH檢查的直接法。因此，目前就原位PCR方法而言，尚未能獲得統(tǒng)一，也即未能比較出哪一種方法最可靠簡(jiǎn)便，各家報(bào)道的原位PCR技術(shù)

22、中，在標(biāo)本處理和種類(lèi)上尚不同（細(xì)胞懸液、涂片、組織切片等），想檢測(cè)的靶核酸也不同（病毒或體細(xì)胞的DNA或mRNA），擴(kuò)增的方法上有不同（單引物、多引物），最后顯示的方法也不同（直接法、間接法）。這些還都有待在今后的工作中積累經(jīng)驗(yàn)，以求一致。原位PCR應(yīng)用的課題，目前正片于開(kāi)始階段，還很局限，對(duì)人體B細(xì)胞淋巴瘤中Ig單拷貝基因重組的檢查以及對(duì)人體外周血中單核細(xì)胞HLA-DQ不同亞型的測(cè)定，歸納起來(lái)，主要應(yīng)用于兩方面；（1）檢測(cè)外源懷基因片段，集中在病毒感染的檢查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）內(nèi)源性基因片段，如人體的單基因病、重組基因、易位的染色體、Ig的mRNA片段、癌基因片段等

23、。基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將特定的遺傳信息傳遞到真核細(xì)胞中，這種能力不但革新了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中許多基本問(wèn)題的研究，也推動(dòng)了診斷和治療方面的分子技術(shù)發(fā)展，并使基因治療成為可能。目前基因轉(zhuǎn)移技術(shù)已廣泛用于基因的結(jié)構(gòu)和功能分析、基因表達(dá)與調(diào)控、基因治療與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等研究。本部分將介紹目前基因轉(zhuǎn)移的主要方法；重點(diǎn)介紹基因轉(zhuǎn)移的病毒方法的基因轉(zhuǎn)染（transfection）技術(shù)。基因運(yùn)載系統(tǒng)將某一特定的靶基因傳遞到靶細(xì)胞，需要應(yīng)用某一基因運(yùn)載系統(tǒng)，目前將這一系統(tǒng)概括為兩大類(lèi)：非病毒辣方法和病毒方法。1.基因轉(zhuǎn)移的非病毒方法直接注射法 將含有DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起鄰近的細(xì)胞攝入DNA燕進(jìn)行表達(dá)，在肌細(xì)胞中，

24、基因表達(dá)可持續(xù)數(shù)月。磷酸鈣共沉淀法 將氯化鈣、DNA和磷酸鹽緩沖液混合，形成磷酸鈣微沉淀 ，附著于細(xì)胞膜并經(jīng)過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用耐是入細(xì)胞質(zhì)。該方法的轉(zhuǎn)化效率通常很低。脂質(zhì)體染法 指質(zhì)體能在體內(nèi)或體外提供運(yùn)載外源性遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的載體。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的最大優(yōu)勢(shì)在于能在活體內(nèi)應(yīng)用。受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 依靠受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑以轉(zhuǎn)移外源基因。受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法是在質(zhì)粒DNA和某種特異的多肽（配體）之間形成復(fù)合體，而這種多肽能為細(xì)胞表面的肥體所識(shí)別。如若將DNA在體內(nèi)運(yùn)送至肝內(nèi)，可以選將DNA和能與肝細(xì)胞受體特異結(jié)合的去唾液酸糖蛋白質(zhì)偶聯(lián)，以便通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞過(guò)程而被攝入，這種DNA大部分被肝臟

25、所攝取。應(yīng)用該方法轉(zhuǎn)移的外源基因在活體內(nèi)的表達(dá)持續(xù)時(shí)間較短，在評(píng)估實(shí)際應(yīng)用前影上還在一些問(wèn)題。顯微注射法 在顯微鏡下，將DNA經(jīng)同細(xì)胞玻璃針地接注入細(xì)胞，該法適合于各種培養(yǎng)生長(zhǎng)的細(xì)胞，但需要一定的設(shè)備和操作用支巧。電穿孔法 利用脈沖場(chǎng)將DNA導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞。微粒子轟擊法（基因槍?zhuān)┙鼛啄臧l(fā)展較快的轉(zhuǎn)移方法。使用高能微粒子轟擊將DNA導(dǎo)入培胞或活的哺乳動(dòng)物組織內(nèi)。亞微粒的鎢和金能自發(fā)地吸附DNA，將這些微彈加強(qiáng)速到很的速度轟擊細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用這種方法靶基因可在皮膚、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等細(xì)胞中表達(dá)。胚胎干細(xì)胞法 胚胎干細(xì)胞是從受精卵開(kāi)始分裂至4個(gè)國(guó)胞階段未分化和具有多種潛能的生殖細(xì)胞，能在體

26、外培養(yǎng)，可作為正面細(xì)胞，制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，以研究基因定向整合或基因剔險(xiǎn)及基因及能。精子載體法 最近發(fā)現(xiàn)用精子和NDA-劑孵育，可捕獲得DNA。通過(guò)受精過(guò)程，將外源性基因?qū)胧芫眩刹东@得物物，大大間化了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備過(guò)程。2.基因轉(zhuǎn)移的病毒的方法病毒作為基因轉(zhuǎn)移的是基因遞送有有并工具，病毒載體的優(yōu)點(diǎn)有：（1）在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中傳播重組的DNA分子作為穩(wěn)定的遺傳成分；（2）在可能將有有制陷的或突變的基因置于病毒調(diào)節(jié)信號(hào)的控制下以進(jìn)行研究；（3）能將克隆的基因作為病毒微染色體的一部分 ，并能進(jìn)分離；（4）轉(zhuǎn)移效率較高。其主要缺點(diǎn)是病毒載體對(duì)外源基因的最大容納量只有2500bp。目前常用的病毒載體有下

27、列幾種。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒辣為RNA病毒，它們的基因組編碼在一條單鏈RNA他婦上，病毒進(jìn)入細(xì)胞通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄作用，病毒RNA即轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子，DNA進(jìn)入細(xì)胞核并整合在細(xì)胞染色體中，這種整合的病毒稱(chēng)為原病毒。在原病毒的兩端各有一長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）,LTR內(nèi)側(cè)還有為復(fù)制所必需的其他順序，包括包裝信號(hào)。目前常用的逆轉(zhuǎn)病毒載體有CMV和SV。DNA病毒載體 主要有腺病毒相關(guān)病毒載體，腺端正毒載體，皰疹病毒載體。對(duì)DNA病毒載體的研究是當(dāng)前基因基因治療研究中的重點(diǎn)領(lǐng)域。常用的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將外源基因?qū)氚屑?xì)胞需要一定的載體和導(dǎo)入方法，基因轉(zhuǎn)技術(shù)則是將純化的含有靶基因的質(zhì)粒DNA送入細(xì)胞內(nèi)，

28、并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。轉(zhuǎn)染方法有多種，根據(jù)不同的細(xì)胞，貼壁或懸浮細(xì)所可選用不同的方法，其目的是要達(dá)到設(shè)置轉(zhuǎn)染效率，影響轉(zhuǎn)染產(chǎn)率的因素有多種，包括轉(zhuǎn)染方法、操作技術(shù)、質(zhì)粒DNA的純度、靶細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)等，下面重點(diǎn)介紹向幾種常用的轉(zhuǎn)染技術(shù)：靶細(xì)胞的準(zhǔn)備 被用于作靶基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其生長(zhǎng)狀態(tài)如何，將直接決定了基因轉(zhuǎn)染效率。如為貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，一般要求在轉(zhuǎn)染前一日，必需應(yīng)用胰酶處理成單細(xì)胞懸液，重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，細(xì)胞密度以鋪滿(mǎn)培養(yǎng)器皿的60%為宜，轉(zhuǎn)染當(dāng)日，在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)換一將近新鮮培養(yǎng)液。對(duì)于懸浮細(xì)胞，也需在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)換一次新鮮培養(yǎng)液。靶基因質(zhì)粒DNA的準(zhǔn)備 用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無(wú)蛋白質(zhì)，無(wú)RN

29、A和其了化學(xué)物質(zhì)的污染，OD260/280比值應(yīng)在1.8以上。應(yīng)用酚-氯仿抽提法制備的質(zhì)粒DNA一般難以達(dá)到此標(biāo)準(zhǔn)，目前大多采用進(jìn)口的術(shù)提取純化試劑盒。具體的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)有鱗酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法、DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法及電擊基因轉(zhuǎn)導(dǎo)塵等。靶基因被導(dǎo)入細(xì)胞后，一般在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?8小時(shí)后即可進(jìn)行靶基因表達(dá)的檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。如若建立穩(wěn)定的細(xì)胞系，則可對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行篩選，根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物，最常用的直核表達(dá)基因載體的標(biāo)志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的建立和應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

30、是以實(shí)驗(yàn)方法交源基因?qū)胨拗魇芫鸦蛟缙谂咛ゼ?xì)胞染色體基因組內(nèi)，使其穩(wěn)定整合和遺傳給后代動(dòng)物。它主要采用顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染法、精子載體法、電轉(zhuǎn)移法與胚胎干細(xì)胞法。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立，推動(dòng)了腫瘤在分子水平上的研究，它使人們認(rèn)識(shí)到激活的原癌基因的異常表達(dá)及功能失常，是腫瘤發(fā)生的初階段。將癌基因與特定細(xì)胞的調(diào)控序列連在一起，可使癌基因在特定細(xì)胞中表達(dá)，研究靶細(xì)胞對(duì)不同癌基因的易感性，闡明某一癌基因?qū)μ囟?xì)胞生長(zhǎng)、分化及功能的影響；它還可以研究多種基因的協(xié)同作用，有助于對(duì)多步驟致癌機(jī)進(jìn)行深和的探討。轉(zhuǎn)基因小鼠不但用以研究癌基因的功能，還可以通過(guò)使某一基因功能丟失（如用基因剔除技術(shù)）研究抑

31、癌基因在腫瘤發(fā)一中的作用。另外，轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)致癌原的測(cè)試，為腫瘤的預(yù)防，治療及發(fā)現(xiàn)新的致癌物質(zhì)都提供了有價(jià)值研究工具。二、分子生物學(xué)技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)在腫瘤診斷、預(yù)后和治療中的應(yīng)用已取得了一定的進(jìn)展，主要反映在基因過(guò)量表達(dá)的檢測(cè)、基因突變的檢測(cè)、腫瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析、腫瘤的易感性預(yù)測(cè)、病因檢測(cè)、早期診斷、腫瘤療效的監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷等八方面?；蜻^(guò)量表達(dá)的檢測(cè)無(wú)論是癌基因或抑癌基因，其蛋白制裁產(chǎn)物的過(guò)量表達(dá)可以用相應(yīng)的抗體應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤組織中的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，也可應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbrnt assay,ELISA）和免

32、疫印跡（western blot）方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞或血清中的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。隨著生物學(xué)研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)在越來(lái)越多的蛋白質(zhì)，包括各種癌基因和抑癌基因產(chǎn)物、細(xì)胞因子、受體乃生長(zhǎng)因子等在細(xì)胞調(diào)控中擔(dān)負(fù)重要功能。不少蛋白質(zhì)已被純化，大量的單、多克隆抗體被制備，目前幾乎所有被克隆的癌基因、抑癌基因都有其相應(yīng)的抗體問(wèn)世，其中大多數(shù)抗體及試劑盒已商品化，為這些蛋白質(zhì)產(chǎn)物的測(cè)定提代供了十分有利的條件。免疫組化可在組織切片上進(jìn)行，其特點(diǎn)是在保持組織結(jié)構(gòu)的條件下原位進(jìn)行分析，特異性和敏感性都較強(qiáng)。ELISA是在細(xì)胞懸液中進(jìn)行，可對(duì)特定蛋白質(zhì)進(jìn)行定量人析。Westrn blot既或?qū)M織細(xì)胞進(jìn)行分析，也可對(duì)釋放至血液中

33、的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，其敏感性和特性均較強(qiáng)。新一代測(cè)定蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法 為流式經(jīng)胞儀（folw Cytometry）測(cè)試法，道先標(biāo)記熒光于相應(yīng)的抗體蛋白制裁，標(biāo)記有熒光的抗體蛋白質(zhì)與特異抗原的細(xì)胞結(jié)合后，用流式細(xì)胞儀對(duì)含有不同熒光信號(hào)的細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)、測(cè)試。該方法適膈對(duì)細(xì)胞群體進(jìn)行分析。更新一代的影響細(xì)胞測(cè)試示（image cytometry）則可應(yīng)用特定的波長(zhǎng)的光密度進(jìn)行積分，從而得到特定蛋白質(zhì)的含量。在已報(bào)道的研究結(jié)果中，人類(lèi)計(jì)多腫瘤都存在相關(guān)基因蛋白質(zhì)產(chǎn)物的過(guò)量表達(dá)，如乳腺癌組織C-erbB-2表達(dá)陽(yáng)性率可達(dá)50左右，p53陽(yáng)性也在50左右，并與腫瘤的組織類(lèi)型、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移傾向和預(yù)后有關(guān)。p53

34、基因表達(dá)產(chǎn)物在大多數(shù)腫瘤中都過(guò)量表達(dá)，包括胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、膽囊癌、甲狀腺癌、卵巢癌、膠質(zhì)細(xì)胞瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤等，其陽(yáng)性率20-60之間，對(duì)其他基因如myc、ras、bc12、Rb、p21、p27、p57、p16踏它轉(zhuǎn)移抑制基因nm23等表達(dá)物搭腫瘤組織中的表達(dá)進(jìn)行了廣泛而深入的研究，但不同研究者報(bào)道的陽(yáng)性率之間存在較大的差異，甚至在陽(yáng)性物質(zhì)的組織細(xì)胞定位也不一致，這可能與多種因素有關(guān)，如抗體的選擇、病例的選擇、技術(shù)方法的不同、觀察結(jié)果中主觀因素的影響等。為使應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤基因表達(dá)產(chǎn)物的研究更具科學(xué)性和應(yīng)用價(jià)值，需要晝快做到免疫組織化學(xué)研究標(biāo)準(zhǔn)化和

35、規(guī)范化?；驍U(kuò)增的檢測(cè)腫瘤基因的擴(kuò)增可產(chǎn)生過(guò)量的表達(dá)蛋白，還可表現(xiàn)為基因拷貝數(shù)的增加和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的增加，這兩種變化都可通過(guò)分子診斷的方法進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)典方尖為核酸分子雜交，包括原位雜交（in situ hybridizsation,ISH）和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization,FISH）、Southern blot(DNA雜交)、Northern blot(RNA雜交)、原位PCR和RT-PCR等。幾種常見(jiàn)腫瘤中癌基因的擴(kuò)增率（附錄表1）。附尋表1 幾種常見(jiàn)腫瘤癌基因的擴(kuò)增率基因 腫瘤類(lèi)型 擴(kuò)增率（） C-erbB2 乳腺癌 16-33 胃、

36、食管癌 5-13 卵巢癌 20-33 膽囊癌 45-58 肝癌 25-45 c-myc 乳腺癌 25-30 結(jié)、直腸癌 3-6 膽囊癌 40-60 肺鱗癌 15-25 肝癌 25-42 N-myc 肺腺癌 2-11 K-ras 乳腺癌 3-10 胰腺癌 45 卵巢癌 4-8 膽囊癌 30-61 int2 乳腺癌 4-23 N-ras 肝癌 24 Mdm2 肝癌 15-26 C-fas 肝癌 39 K-sam 胃癌 21 Met 胃癌 19 基因突變的檢測(cè)癌基因和抑癌基因突變?cè)谀[瘤發(fā)生中出現(xiàn)的頻率較高，突變的結(jié)果使癌基激活或抑癌基因失活，導(dǎo)政協(xié)委員細(xì)胞表型發(fā)生變化和腫瘤發(fā)生。基因突變是復(fù)雜的過(guò)程

37、，不僅在腫瘤細(xì)胞中檢測(cè)到突變的基因，對(duì)于某些癌前病變或癌前狀態(tài)的組織細(xì)胞中也存在不同形式和不同程度的基因突變，在同一種腫瘤的不同發(fā)展階段可能會(huì)涉及多咱基因的不同突為，在同一種腫瘤的不同發(fā)展階段可能會(huì)涉及多種基因的不同形式的突變，充分說(shuō)明腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多步驟的復(fù)雜的生物程。突變形成在DNA和染色體水平上，基因突主主要有下列幾種形式。點(diǎn)突變 基因在特定位置發(fā)生一個(gè)核苷酸的改變，使相應(yīng)蛋白質(zhì)的一個(gè)氨基酸改變，繼而改變了蛋白質(zhì)的空間構(gòu)型和生物功能。1982年Weinberg和Barbacid等在對(duì)人膀胱癌細(xì)胞株EJ和T42的研究中，同時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)核苷酸的突變就能使H-ras基因激活，異常表

38、達(dá)并使正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化。研究表明，人類(lèi)大部分的腫瘤幾如何都存在相關(guān)的基因的點(diǎn)突變，如肺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、胃癌、乳腺癌、膽囊癌、胰腺癌等腫瘤存在H-ras、K-ras、N-ras的第12、13、和61編碼子的點(diǎn)突變，卵巢癌中K-ras等12編碼子高頻率的點(diǎn)突變等。ras基因是腫瘤細(xì)胞中突變率較高的一種癌基因（附錄表2）。附錄表2 人類(lèi)腫瘤中ras基因點(diǎn)突變頻率（）Ras基因類(lèi)型 腫瘤類(lèi)型 突變頻率（） K-ras 肺腺癌 30 K-ras 結(jié)腸癌 50 K-ras 胰腺癌 90 K-ras 膽管腺癌 90 H-ras 宮頸癌 25 H-ras 甲狀腺癌 60 N-ras 黑素瘤 20 N-ras

39、 精原細(xì)胞瘤 40 N-ras 急性髓性白血病 30 家族性腺瘤性息肉病、結(jié)腸癌、胃癌的APC、DCC、MCC基因點(diǎn)突變，p53、p16、p15等幾種報(bào)癌基因則在多種腫瘤中存在點(diǎn)突變，且突變點(diǎn)范圍很廣，如p53基因的點(diǎn)突變從第4至第10外顯子均可出現(xiàn)，常見(jiàn)腫瘤p53基因突變位點(diǎn)（附錄表3）。附錄表3 人類(lèi)腫瘤p53基因突變熱點(diǎn)和頻率腫瘤類(lèi)型 突變頻率（） 突變熱點(diǎn)（密碼子） 肺癌 56 157，248，273 結(jié)腸癌 50 175，245，248，273 食管癌 45 不確定 卵巢癌 44 273 胰腺癌 44 273 皮膚癌 44 248，278 胃癌 41 不確定 頭頸部鱗癌 37 248

40、 膀胱癌 34 280 前列腺癌 30 不確定 肝細(xì)胞癌 45 249， 膠質(zhì)瘤 25 175，248 乳腺癌 22 175，248，273 子宮內(nèi)膜癌 22 248 甲狀腺癌 13 248，273 白血病 12 175，248 宮頸癌 7 273 軟組織肉瘤 31 不確定 點(diǎn)突變可以表現(xiàn)為錯(cuò)義突變（missense）、無(wú)義突變（nonsense）、終止密碼子（stop codon）和移碼突變（framshirft）等多種形式。近年研究認(rèn)為，基因點(diǎn)突變?cè)诓煌哪[瘤組織中具有一定的規(guī)律，如胰腺癌和膽囊癌的K-ras點(diǎn)突變主要位于第12密碼子的第一或第二位堿基，與黃曲霉素相關(guān)的肝癌p53基因突變主

41、要集中于第249密碼子的第三位堿基?；蛉笔?基因片段的缺失是另一種主要的突變形式，缺失的范圍差別較大，可以是1-2個(gè)堿基，也可以一個(gè)片段甚至一個(gè)外顯子缺失。常見(jiàn)的缺失位占如乳腺癌的3p、7q、11p、13q、16q、17p等，結(jié)腸癌的5q、17p、18q等，小細(xì)胞肺癌FHIT基因第5外顯子的的缺失是腫瘤形成的原因細(xì)胞惡生轉(zhuǎn)化后的結(jié)果，仍值得深入探討?；蛉笔c腫瘤的臨床病理及生物學(xué)行為密切相關(guān)，如乳腺呂的基因缺失與病理分期、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移存在一定關(guān)系，這種現(xiàn)象已在多種腫瘤中觀察到?；蛉笔е休^為頻發(fā)的分子事件是存在于抑癌基因中的等位基因丟失，詳見(jiàn)后述。基因易位或重排 在腫瘤細(xì)胞中基因從染色體的正常

42、位置轉(zhuǎn)移到其他染色體的某個(gè)位置上，稱(chēng)為易位或重排。70年代初醫(yī)學(xué)細(xì)胞遺傳學(xué)興起不久，就發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生與染色體的異常有關(guān)，但一直未能得到預(yù)期的結(jié)果。近年來(lái)，由于染色體高分辨顯帶技術(shù)和分子診斷技術(shù)的發(fā)展，確定了與腫瘤發(fā)生有關(guān)基因的在相應(yīng)染色體常有易位和重排。易位與重排易使癌基因被激活，或使抑癌基因失活，從而細(xì)胞惡變。細(xì)胞部基因的編碼序列在DNA分子上是不連續(xù)的，由內(nèi)含子分隔，其中有些序列起到啟動(dòng)子和調(diào)節(jié)基因的作用，如染色體出現(xiàn) 易位、重排等改變時(shí)，可使細(xì)胞癌基基與正常的抑制子分開(kāi)而被置于活化DNA序列的控制之下，其中具有代表性的例子為Burkitt淋巴瘤。已知所有的Burkitt淋巴瘤都存在8q2

43、4的易位，c-myc基因位于8q24，而編碼Igk、IgH和Ig由分別位于第2、14、22號(hào)染色，8q24與這些染化體發(fā)生易位后，c-myc基因則有可能發(fā)生重排而活化。在慢性和急性粒細(xì)胞白血病和急性淋巴細(xì)胞白血病中，癌基因abl從第9號(hào)染色體易位到第22號(hào)體，在不同位點(diǎn)與bcr基固執(zhí)上游部分相連，產(chǎn)生一種獲得酪氨酸激酶活性的融合蛋白質(zhì)。著名的費(fèi)城染色體（ph）即為有缺失的第22號(hào)染色體，為慢性髓細(xì)胞性白血病的主要分子改變。又如Ewing肉瘤也觀察到sis基因從第22號(hào)染色體易位到第11號(hào)染色體。除了染色體的基因易位外，基因重排也發(fā)現(xiàn)了存在于多種腫瘤，如胃癌的hst基因的重排等。幾種常見(jiàn)腫瘤的染

44、色體異位（附錄表4）。附錄表4 幾種常見(jiàn)腫瘤的染色體易位常見(jiàn)腫瘤 染色體異常 涉及的癌基因 小無(wú)裂細(xì)胞淋巴瘤 t(8；14)（q24；q32） c-myc 濾泡性淋巴瘤 t(14；18)(q32；q21) bcl-2 急性早幼粒白血病 t(15；17)(q22；q12-21) c-fes 急性非淋巴細(xì)胞性白血病 t(9；22)(q34；q11) c-abl Burkitt淋巴瘤 t(8；2)(q24；p11) c-myc t(8；14)(q24；p32) c-myc t(8；22)(q24；q11) c-myc Ewing肉瘤 t(11；22)(q24；q12) c-sis 卵巢囊癌 t(6；

45、14)(q21；q24) c-myb 腮腺混合瘤 t(3；8)(p25；q21) ? 透膽細(xì)胞肉瘤 t(12；22)(q13；q12) AFT1 滑膜肉瘤 t(x；18)(p11；q11.2) SSX1,SSX2 橫紋肌肉瘤 t(2；13)(q35；q14) PAX3 橫紋肌肉瘤 t(1；13)(p36；q14) PAX7 其他類(lèi)型的基因突變 除前述的點(diǎn)突變、基因缺失、易位或重排等幾種訂的基因突變形式外，基因突變還可以插入、甲基化、染色體非組蛋白改變等導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)異常，致使癌基因激活或抑癌基因失活。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與基因變化的關(guān)系十分復(fù)雜，形式多種多樣，至今為止，遠(yuǎn)未闡述清楚?；蛲蛔兊臋z測(cè)方法

46、基因突變的研已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，檢測(cè)方法也隨之迅速發(fā)展。人類(lèi)細(xì)胞癌基因的突變類(lèi)型已如上所述，對(duì)于基因突變的檢測(cè)，1985以前，利用Southern印跡法，可以篩選出基因的缺失、插入和移碼重組等突變形式。對(duì)于用該法法不能檢測(cè)的突變，只能應(yīng)用復(fù)雜費(fèi)時(shí)的DNA序列測(cè)定分析法。多聚酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)是突變研究中的最重大進(jìn)展，使基因突變檢測(cè)技術(shù)有了長(zhǎng)足的發(fā)展，目前幾乎所有的基因突變檢測(cè)的分子診斷技術(shù)都是建立于PCR的基礎(chǔ)之上，并且由PCR衍生出的新方法不斷出現(xiàn)，目前已達(dá)二十余種，自動(dòng)化程度也愈來(lái)愈高，分析時(shí)間大大縮短，分析結(jié)果的準(zhǔn)確性

47、也有很大很提高。其中包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和異源雙鏈分析法（heteroduplex analysis,HA）。下面分別介紹幾種PCR衍生技術(shù)及經(jīng)典突變檢測(cè)方法，可根據(jù)檢測(cè)目的和實(shí)驗(yàn)室條件選擇時(shí)參考。PCR-SSCP法 PCR-SSCP法是在非這性聚丙烯酰胺凝膠上，短的單鏈DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同構(gòu)象，一個(gè)堿基的改變將影響其構(gòu)象而導(dǎo)致其在凝膠上的移動(dòng)速度改變。其基本原理為單鏈DNA在中性條件下會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)依賴(lài)于其堿基組成，即使一個(gè)堿基的不同，也會(huì)形成不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)而

48、出刺同的遷移率。由于該法簡(jiǎn)單快速，因而被廣泛用于未知基因突變的檢測(cè)。用PCR-SSCP法檢測(cè)小于200bp的PCR產(chǎn)物時(shí)，突變檢出率可達(dá)70-95，片段大于400bp時(shí)，檢出率僅為50左右，該法可能會(huì)存在1的假陽(yáng)性率。應(yīng)用PCR-SSCP法應(yīng)注意電泳的最佳條件，一般突變類(lèi)型對(duì)檢測(cè)的靈敏度無(wú)大的影響，同時(shí)該法不能測(cè)定突變的準(zhǔn)確位點(diǎn)，還需通過(guò)序列分析來(lái)確定。Sarkar等認(rèn)為對(duì)于大于200bp的片段，用其RNA分子來(lái)做SSCP會(huì)提高其錄敏度。應(yīng)用PCR-SSCP檢測(cè)點(diǎn)突變已見(jiàn)報(bào)道于人類(lèi)大部分的腫瘤組織或細(xì)胞，如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。檢測(cè)的基因包括多種癌基因及抑癌基因，也是檢測(cè)

49、抑癌基因p53突變最常用的方法，僅檢測(cè)第5-8外顯子即可發(fā)現(xiàn)85以上的p53基因突變。由于該法簡(jiǎn)便快速，特別適合大樣本基因突變研究的篩選工作。異源雙鏈分析法（HA） HA法直接在變性凝膠上分離雜交的突變型一野生型DNA雙鏈。由于突變和野生型DNA形成的異源雜合雙鏈DNA在其錯(cuò)配處會(huì)形成一突起，在非變性凝膠中電泳時(shí)，會(huì)產(chǎn)生與相應(yīng)的同源雙DNA不同的遷移率。該法與SSCP相似，所不同的是SSCP分離的是單鏈DNA，HA法分離的是雙鏈DNA，也只適合于小片段的分析。但HA對(duì)一些不能用SSCP檢出的突變有互補(bǔ)作用，兩者結(jié)合使用，可使突變檢出率提高到近100。突變體富集PCR法（mutant-enric

50、hed PCR）本法的基本原理是利用ras基因家族某個(gè)密碼子部位存在已知的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，如K-ras基因第12密碼子的BstNI位點(diǎn)，第13密古巴子有Bg位點(diǎn)。用鏈續(xù)二次的巢式PCR來(lái)擴(kuò)增包括K-ras第12、13密碼子的DNA片段，在兩次擴(kuò)增反應(yīng)之間用相應(yīng)的內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的DNA片段，野生型因被酶切而不能進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增，而突變型則能完整進(jìn)入第二次PCR擴(kuò)增并得到產(chǎn)物的富集。變性梯度凝膠電泳法（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE） DGGE法分析PCR產(chǎn)物，如果突變發(fā)生在最先解鏈的DNA區(qū)域，檢出率可達(dá)100，檢測(cè)片段可達(dá)1kb，最適圍

51、為100bp-500bp。基本原理基于當(dāng)雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進(jìn)行到與DNA變性濕度一致的凝膠位置時(shí)，DNA發(fā)生部分解鏈，電泳適移率下降，當(dāng)解鏈的DNA鏈中有一個(gè)堿基改變時(shí)，會(huì)在不同的時(shí)間發(fā)生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。由于本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來(lái)檢測(cè)，需要一套專(zhuān)用的電泳裝置，合成的PCR引物最好在5末端加一段40bp-50bp的GC夾，以利于檢測(cè)發(fā)生于高熔點(diǎn)區(qū)的突變。在DGGE的基礎(chǔ)上，又發(fā)展了用濕度梯度代替化學(xué)變性劑的TGGE法（溫度梯度凝膠電泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。DGGE和TGGE均有商品化的

52、電泳裝置，該法一經(jīng)建立，操作也較簡(jiǎn)便，適合于大樣本的檢測(cè)篩選?；瘜W(xué)切割錯(cuò)配法（chemical cleavage of mismatch,CCM）CCM為在Maxam-Gilbert測(cè)序法的基礎(chǔ)上發(fā)展的一項(xiàng)檢測(cè)突變的技術(shù)，其檢測(cè)突變的準(zhǔn)確性可與DNA測(cè)序相仿。其基本原理為將待測(cè)含DNA片段與相應(yīng)的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混俁變性雜交，在異源雜合的雙鏈核酸分子中，錯(cuò)配的C能被羥胺或哌啶切割，錯(cuò)配的T能被四氧化餓切割，經(jīng)變性凝膠電泳即可確定是否存在突變。該法檢出率很高，也是檢片段最長(zhǎng)的方法，已有報(bào)功檢測(cè)了1.7kb片段，如果同時(shí)對(duì)正、反義鏈進(jìn)行分析，檢出率可達(dá)100。應(yīng)用熒光檢測(cè)系統(tǒng)可

53、增強(qiáng)敏感度，可檢測(cè)到10個(gè)細(xì)胞中的1個(gè)突變細(xì)胞。該法中的化學(xué)試劑有毒，又發(fā)展了碳二亞胺檢測(cè)法（catodiimide,CDI）,CDI為無(wú)毒物質(zhì)，也可檢測(cè)大片段DNA的點(diǎn)突變。等位基因特異性寡核苷酸分析法（allele-specific oligonucleotide,ASO） ASO為一種以雜交為基礎(chǔ)對(duì)已知突變的檢測(cè)技術(shù)。以PCR和ASO相結(jié)合，設(shè)計(jì)一段20bp左右的寡核苷酸片段，其中包含了發(fā)生突變的部位，以此為探針，與固定在膜上的經(jīng)PCR拉增的樣品DNA雜交?？梢杂酶鞣N突變類(lèi)型的寡核苷酸探針，同時(shí)以野生型探針為對(duì)照，如出現(xiàn)陽(yáng)性雜交帶，則表運(yùn)河樣品中存在與該ASO探針相應(yīng)的點(diǎn)突變，ASO需嚴(yán)

54、格控制雜交條件和設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照避免假陽(yáng)性和假陰性。目前已有商品化的檢測(cè)盒檢測(cè)部分癌基因ASO突變。DNA芯片技術(shù)（DNA chip） DNA芯片技術(shù)是90年代后發(fā)展的一項(xiàng)DNA分析新技術(shù)，它集合了集成電路計(jì)算機(jī)、激光共聚焦掃描、熒光標(biāo)記探針和DNA合成等先進(jìn)技術(shù)?？捎糜诨蚨ㄎ?、DNA測(cè)序、物理圖譜和遺傳圖譜的構(gòu)建等。在基因突變檢測(cè)方面DNA芯片也有廣闊的前景，其基本原理為將許多已知序列的寡核苷酸DNA排列在1塊集成電路板上，彼此之間重疊1個(gè)堿基，并覆蓋全部所需檢測(cè)的基因，將熒光標(biāo)記的正常DNA和突變DNA發(fā)別與2塊DNA芯片雜交，由于至少存在1個(gè)堿基的差異，正常和突變的DNA將會(huì)得到不同的雜交

55、圖譜，經(jīng)過(guò)共聚集顯微鏡分別檢測(cè)兩種DNA分子產(chǎn)生的熒光信號(hào)，即可確定是否存在突變，該方法快速簡(jiǎn)單、片動(dòng)化程度高，具有很大的發(fā)展?jié)摿?，將在基因突變檢測(cè)中心發(fā)揮非常重要的作用。連接酶鏈反應(yīng)（ligase chain reaction,LCR） 與其他核酸擴(kuò)增技術(shù)比較，其最大特點(diǎn)為可準(zhǔn)確區(qū)分基因序列中單個(gè)基因突變，由Landegree于1988年首次應(yīng)用于鐮刀獎(jiǎng)細(xì)胞貧血的分子診斷。LCR是以DNA連接酶將某一DNA鏈的5-磷酸與另一相鄰鏈3-羥基連接為基礎(chǔ)，應(yīng)用兩對(duì)互補(bǔ)的引物，雙鏈DNA經(jīng)加熱變性后，兩對(duì)引物分別與模板復(fù)性，若完全互補(bǔ)，則在連接酶的作用下，使相鄰兩引物的5-磷酸與3-羥基形成磷酸二酯

56、二酯鍵而連接，前一次的連接產(chǎn)物又作為下一次循環(huán)反應(yīng)的模板，如果配對(duì)的堿基存在突變則不能連接和擴(kuò)增。LCR產(chǎn)物檢測(cè)最初是通過(guò)這32p標(biāo)記上游引物3未端，經(jīng)變性凝膠電泳分離后放射自顯影加以鑒定，其檢測(cè)敏感性達(dá)到200個(gè)靶分子。也可設(shè)計(jì)1個(gè)橫跨兩引物的檢測(cè)探針，用它與LCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交檢測(cè)。近年有應(yīng)用熒光素、地高辛等非核素標(biāo)記方法。Batt在1994年發(fā)展了一種更為簡(jiǎn)的方法，好微孔板夾心雜交法。由于LCR的快速、特蛋和敏感的特性，以及能檢測(cè)單個(gè)堿基突變的能力，因此被應(yīng)用于腫瘤基因突變的分子診斷，并與PCR結(jié)合用以提高其敏感性。等位基因特異性擴(kuò)增法（Allele-specific amplificat

57、ion,ASA）ASA于1989年建立，是PCR技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展，也稱(chēng)擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system,ARMS）、等位基因特性PCR（allele-specific PCR,ASPCR）等，用于對(duì)已知突變基因進(jìn)行檢測(cè)。該法通過(guò)設(shè)計(jì)兩個(gè)5端引物，一個(gè)與正常DNA互補(bǔ)，一個(gè)與突變DNA互補(bǔ)，對(duì)于純合性突變，分別加入這兩種引物及3端引物進(jìn)行兩個(gè)平行PCR，吸有與突變DNA完互補(bǔ)的引物才可延伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。如果錯(cuò)配位于引物的3端則導(dǎo)致PCR不能延伸，則稱(chēng)為ARMS。ARMS和ASPCR借鑒多重PCR原理，可在同一系統(tǒng)中同時(shí)檢測(cè)兩種或多種等位基因突變位點(diǎn)。ASA法的檢出率依賴(lài)于反應(yīng)條件的優(yōu)化和可能發(fā)生的引物與靶DNA有氏配時(shí)錯(cuò)配延伸，特別是當(dāng)錯(cuò)配堿基為G：T時(shí)，這時(shí)可通過(guò)調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件如引物靶DNA，Taq DNA聚合酶的濃度等來(lái)得高瓜在特異性。在反應(yīng)體系中加入甲酰胺也可減少非特異性擴(kuò)增。還可通過(guò)在引物3端的第二個(gè)堿基引入一個(gè)錯(cuò)配堿基，使之與模板之間形成雙重錯(cuò)配以阻止錯(cuò)誤延伸。RNA酶A切割法（RNase A cleavage） 在一定條件下，氨基源雙鏈核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中的錯(cuò)配堿基可被RNaseA切割，切割產(chǎn)