實時熒光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及應(yīng)用

1、2013-11-26實時熒光定量實時熒光定量PCR技術(shù)技術(shù)的原理及應(yīng)用的原理及應(yīng)用（Real Time Quantitative PCR） Contents一、實時一、實時熒光定量熒光定量PCRPCR的定義的定義二、二、RT-PCRRT-PCR技術(shù)的技術(shù)的原理及試驗流程原理及試驗流程三、三、RT-PCRRT-PCR技術(shù)的數(shù)據(jù)分析技術(shù)的數(shù)據(jù)分析四、四、RT-PCRRT-PCR技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用實時熒光定量實時熒光定量PCR目錄目錄PCR電泳實時熒光定量實時熒光定量PCR的定義的定義普通PCR在在PCRPCR結(jié)束后對結(jié)束后對 進行定量分析進行定量分析終點產(chǎn)物終點產(chǎn)物 PCRPCR技術(shù)技術(shù)和和熒光

2、檢測技術(shù)熒光檢測技術(shù)的結(jié)合的結(jié)合通過通過熒光染料熒光染料或或熒光標(biāo)記的特異性探針熒光標(biāo)記的特異性探針，對，對PCRPCR產(chǎn)物進行產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤，標(biāo)記跟蹤，實時在線監(jiān)控實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程反應(yīng)過程，通過儀器和相應(yīng)的，通過儀器和相應(yīng)的軟軟件件分析結(jié)果分析結(jié)果，對待，對待測樣品的測樣品的初始模板進行定量初始模板進行定量或定性分析或定性分析。 克服了普通克服了普通PCRPCR：1 1、終點定量重復(fù)性不好、終點定量重復(fù)性不好 2 2、EBEB有毒，熒光太貴等缺點有毒，熒光太貴等缺點實時熒光定量實時熒光定量PCR的定義的定義PCRPCR技術(shù)技術(shù)和和熒光檢測技術(shù)熒光檢測技術(shù)的結(jié)合的結(jié)合通過通過熒光染料熒光

3、染料或或熒光標(biāo)記的特異性探針熒光標(biāo)記的特異性探針，對，對PCRPCR產(chǎn)物進行產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤，標(biāo)記跟蹤，實時在線監(jiān)控實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程反應(yīng)過程，通過儀器和相應(yīng)的，通過儀器和相應(yīng)的軟軟件件分析結(jié)果分析結(jié)果，對待，對待測樣品的測樣品的初始模板進行定量初始模板進行定量或定性分析或定性分析。實時熒光定量實時熒光定量PCR的定義的定義RT-PCR技術(shù)的原理及試驗流程技術(shù)的原理及試驗流程RT-PCR技術(shù)的原理及試驗流程技術(shù)的原理及試驗流程RT-PCR反應(yīng)體系模板4.5lTag mixture5.0lF(F)0.25lR(R)0.25l熒光染料 SYBR Green I熒光標(biāo)記的探針TaqMan探針法RT

4、-PCR技術(shù)的原理及試驗流程技術(shù)的原理及試驗流程Monitoring PCR with the SYBR Green I Dye（SYBR Green 法）法）變性變性退火退火延伸延伸RT-PCR技術(shù)的原理及試驗流程技術(shù)的原理及試驗流程SYBR Green法優(yōu)缺點法優(yōu)缺點RT-PCR技術(shù)的原理及試驗流程技術(shù)的原理及試驗流程RT-PCR技術(shù)的原理及試驗流程技術(shù)的原理及試驗流程Monitoring PCR with TaqMan（ TaqMan法）法）RT-PCR技術(shù)的原理及試驗流程技術(shù)的原理及試驗流程TaqMan法法TaqMan探針法優(yōu)缺點探針法優(yōu)缺點RT-PCR技術(shù)的原理及試驗流程技術(shù)的原理及

5、試驗流程n絕對定量絕對定量(Absolute Quantification(Absolute Quantification，AQ)AQ) 病原體檢測 轉(zhuǎn)基因食品檢測 基因表達研究n相對定量相對定量(Relative Quantification(Relative Quantification，RQ)RQ) 基因在不同組織中的表達差異 藥物療效考核 耐藥性研究RT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細胞或基因組數(shù)量RT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析內(nèi)標(biāo)內(nèi)標(biāo)（Endogenous ControlEndogenous Cont

6、rol）通常是18S、28S、-actin、GAPDH基因等看家基因在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小PCRPCR分四個階段分四個階段RT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析RT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析-CtPCR擴增循環(huán)數(shù)扣除背景熒光后的相對熒光量1. 1. 熒光熒光域值（域值（thresholdthreshold）的）的設(shè)定設(shè)定在定量在定量PCRPCR中，需要經(jīng)過數(shù)個循環(huán)后熒光信號才能夠中，需要經(jīng)過數(shù)個循環(huán)后熒光信號才能夠被檢測到，一般以被檢測到，一般以1515個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號。信號。RT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)

7、據(jù)分析數(shù)據(jù)分析-CtPCR擴增循環(huán)數(shù)扣除背景熒光后的相對熒光量2. 2. Ct Ct 值的定義值的定義 在在熒光定量熒光定量PCRPCR技術(shù)中，有一個很重要的概念技術(shù)中，有一個很重要的概念 Ct Ct值。值。C C代表代表CycleCycle，t t代表代表thresholdthreshold，CtCt值的含義是：值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（如循環(huán)數(shù)（如圖所圖所示）。示）。RT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析-Ct3. Ct3. Ct值與起始模板的關(guān)系值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的研究表明，每個模板

8、的CtCt值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CtCt值越小。利用已知起始拷貝值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準品可作出標(biāo)準曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)的標(biāo)準品可作出標(biāo)準曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代數(shù)，縱坐標(biāo)代CtCt值。因此，只要獲得未知樣品的值。因此，只要獲得未知樣品的CtCt值，即可從值，即可從標(biāo)準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。標(biāo)準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 PCR擴增循環(huán)數(shù)扣除背景熒光后的相對熒光量RT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析3. Ct3. Ct值與起始模板的關(guān)系

9、值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的研究表明，每個模板的CtCt值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，CtCt值越小。利用已知起始拷貝值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準品可作出標(biāo)準曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)的標(biāo)準品可作出標(biāo)準曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代數(shù)，縱坐標(biāo)代CtCt值。因此，只要獲得未知樣品的值。因此，只要獲得未知樣品的CtCt值，即可從值，即可從標(biāo)準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。標(biāo)準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。 RT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析相對定量分析方法相對定量

10、分析方法 -Ct前提:目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴增效率接近100且偏差在 5以內(nèi) 1、用目標(biāo)基因的CT值減內(nèi)參基因的CT值： CT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) CT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control) 2、用試驗樣本的CT值減校準樣本的CT值： CT= CT（test/control) - CT（calibrator) 3、計算表達水平比率： 相對表達量RQ= 2 CTRT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析SYBR Green 熔解曲線分析熔解曲線分析RT-PCR技術(shù)的技術(shù)的數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析 臨床疾病診斷臨床疾病診斷：各型肝炎、艾滋病、禽流感等傳染病診斷和療效評價；腫瘤標(biāo)志物及瘤基因檢測實現(xiàn)腫瘤病診斷；遺傳基因檢測實現(xiàn)遺傳病診斷。 動物疾病檢測動物疾病檢測：禽