道地藥材五鶴續(xù)斷基因組脫氧核糖核酸提取方法的改進

1、 11-04-24 11:20:00 作者：羅洪斌，張健，丁莉編輯：studa20【摘要】 目的為研究道地藥材五鶴續(xù)斷的遺傳多樣性、種類鑒定和基因指紋圖譜的構(gòu)建等提供基本保證。方法以中藥材五鶴續(xù)斷藥源植物的鮮嫩葉片為材料，采用CTAB法并加以改進從中提取出基因組脫氧核糖核酸(DNA)，并檢測其提取效果。結(jié)果使用改進的CTAB法從鮮葉中提取五鶴續(xù)斷的基因組DNA濃度較高，能滿足PCR反應的要求。結(jié)論自行改進的CTAB法提取道地藥材五鶴續(xù)斷基因組DNA效果較好。 【關(guān)鍵詞】 五鶴續(xù)斷; 脫氧核糖核酸(DNA)提取; CTAB法; 改進道地藥材是傳統(tǒng)中醫(yī)藥文化中的精品，是在特定產(chǎn)區(qū)的外界環(huán)境和產(chǎn)區(qū)內(nèi)

2、該物種的地方種群遺傳性狀等綜合因素的作用下，形成的品質(zhì)優(yōu)、療效佳的中藥材1。道地藥材與非道地藥材是不同產(chǎn)區(qū)的生物品，藥材品質(zhì)存在差異，但兩者的形態(tài)和組織構(gòu)造差異往往不明顯，難以運用傳統(tǒng)方法準確鑒別藥材道地性。隨著分子生物學的發(fā)展，DNA分子鑒定技術(shù)及方法已廣泛運用于中藥材道地性與非道地性的鑒定2。而DNA的分離純化是DNA分子鑒定等分子生物學操作中的重要步驟，同樣也是藥用植物分子診斷技術(shù)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于中藥材中含有的小分子次生物質(zhì)，如萜類、黃酮、香豆素、有機酸、鞣質(zhì)等含有酚羥基的化合物，氧化后易與DNA結(jié)合，引起DNA降解或抑制酶的活性;而廣泛存在的多糖類由于與DNA同屬大分子化合物，在一般

3、提取過程中很難完全去除。因此有必要不斷摸索并建立不同條件下簡單、快捷、高純度的中藥材基因組DNA提取方法。本實驗就是以道地藥材五鶴續(xù)斷的幼嫩葉片為試驗材料，采用自行探索改良的CTAB法對五鶴續(xù)斷基因組DNA進行了提取，得到了質(zhì)量較高的五鶴續(xù)斷基因組DNA，為應用于五鶴續(xù)斷的遺傳多樣性、種質(zhì)鑒定和基因指紋圖譜的構(gòu)建等分子水平的研究提供了基本保證，也為其他道地藥材在分子生物學水平方面的研究提供了一定的參考資料。1 材料與儀器1.1 材料五鶴續(xù)斷葉片均采自湖北省恩施土家族苗族自治州鶴峰縣走馬鎮(zhèn)萬寺坪道地藥材五鶴續(xù)斷GAP研究及種植基地，經(jīng)湖北民族學院醫(yī)學院中藥教研室袁成玉副教授鑒定，用干燥劑將葉片干

4、燥后置于-80冰箱備用。1.2 試劑1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，3 mol/L 乙酸鈉，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，1 mol/L NaC1，氯仿/異戊醇241，異丙醇，無水乙醇，70%乙醇，10%CTAB溶液，1.5 x CTAB提取液，CTAB沉淀液，5 mol/L NaC1，1 mol/L乙酸鈉，10mg/ml RNaseA，高鹽TE(含1 mol/L NaC1)，1TE緩沖液，以上部分是用分析純配制試劑;Taq DNA聚合酶、dNTPs等，購自大連寶生物有限公司;十六烷基三甲基溴化錠(CTAB)為Geneview分裝，購自北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司;

5、瓊脂糖購自北京華美公司。1.3 儀器SANYO超低溫冰箱，Eppendorf 低溫高速離心機，Eppendorf 梯度PCR儀，BeckmanD/U530紫外分光光度計，恒溫水浴鍋，DYY-10C水平電泳儀，BIORAD凝膠成像系統(tǒng)，研缽和研棒，移液器。2 方法2.1 基因組DNA的提取DNA提取以CTAB常規(guī)法3，4為基礎。為了克服多酚、多糖等次生物質(zhì)對DNA純度的干擾，提高獲得DNA的數(shù)量和質(zhì)量，同時還受到條件的限制，本研究對其進行了改良：選取新鮮幼嫩的五鶴續(xù)斷葉片，酒精消毒后快速放入超低溫冰箱;在沒有液氮的情況下，利用超低溫冰箱的冷凍作用和暗視野效應，再用預冷的研缽和研棒快速粉碎五鶴續(xù)斷

6、葉片;不用飽和酚，增加一次氯仿/異戊醇的用量，避免殘留蛋白質(zhì)和酚等物質(zhì)影響DNA的質(zhì)量;用1 mol/L NaCl，除去多糖物質(zhì)，同時可減輕DNA的褐化。改良后的CTAB法具體提取步驟如下：快速取出保存在超低溫冰箱中的新鮮葉片3 g，放入已預冷凍的研缽中，迅速研磨成粉末，移入50 ml 離心管;然后加入8 ml的CTAB提取液(先預熱到80)，充分混勻，65水浴中保溫60 min，其間每20 min反轉(zhuǎn)搖勻1次，取出樣品，冷卻至室溫;加入4 ml氯仿，混勻后，平放在震蕩器上搖動10 min至抽提液與氯仿完全混合，室溫下4 000 r/min離心15 min;將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中;加入1/

7、10量的10%CTAB液，搖勻;加入等體積的氯仿/異戊醇(241)，震蕩15 min至混勻，室溫下4 000 r/min離心5 min;取上清液重復此步驟;取上清液，加入等量的沉淀液，搖勻，室溫放置10m in，然后4 000 rmin離心10 min;取上清液加入1倍體積的預冷異丙醇，混勻，-20靜置20 min使沉淀生成，12 000 r/min離心5 min;棄上清液，加入5 ml高鹽TE(含1 mol/L NaCl)和5 l 10 mg/ml RNase A 在55搖床中輕搖至完全溶解;加入1/10體積的3 mol/L乙酸鈉和2倍體積的冰凍無水乙醇，充分混勻，-20靜置20 min，使

8、沉淀凝聚，用玻璃棒鉤出呈絮恕狀的DNA，在70%乙醇中洗滌23次，最后去除乙醇將沉淀放置風干，加入300 l TE緩沖液至完全溶解沉淀，再短暫離心。2.2 DNA的檢測用紫外分光光度法測定 DNA 260 nm 及280 nm 吸光值，然后根據(jù)A 260/280值判斷DNA純度并根據(jù)DNA 260 nm檢測其濃度。用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA樣品：取8 l DNA樣品在1.0%的瓊脂糖凝膠(含0.5 l/ml的EB溶液染色)中進行電泳分離，在紫外透射儀下檢測DNA的純度及降解情況。用瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR產(chǎn)物：取8 l PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠(含0.5 l/ml的EB溶液染色)中

9、進行電泳分離，在紫外透射儀下檢測PCR產(chǎn)物的擴增效果。3 結(jié)果與分析3.1 提取方法的凝膠檢測和PCR反應檢測分析從圖1可以看出，基因組DNA濃度較高，呈現(xiàn)一條亮帶，無降解，說明對五鶴續(xù)斷鮮葉采用改進的CTAB法效果較好，能提取得到完整潔凈的基因組DNA。從圖2可明顯發(fā)現(xiàn)，用改進后的8個不同來源的基因組DNA為模板在五鶴續(xù)斷18S rRNA基因的PCR擴增中均得到理想的帶型。1.利川 2.恩施 3.建始 4.咸豐 5.宣恩 6.鶴峰 7.巴東圖1 五鶴續(xù)斷不同產(chǎn)地的樣品DNA電泳圖1.利川 2.恩施 3.建始 4.咸豐 5.宣恩 6.鶴峰 7.巴東圖2 不同產(chǎn)地的五鶴續(xù)斷18S rRNA基因的PCR產(chǎn)物電泳圖3.2 紫外分光光度計檢測由表1可見，對于新鮮葉子采用