植物DNA和RNA提取方法

1、實驗一植物基因組DNA勺提取一、實驗?zāi)康恼莆罩参锟侱NA的抽提方法和基本原理。學(xué)習(xí)根據(jù)不同的植物和實驗要求設(shè)計和改良植物總DNA抽提方法。二、實驗原理通常采用機械研磨的方法破碎植物的組織和細胞，由于植物細胞勻漿含有多種酶類（尤其是氧化酶類）對DNA的抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強還原劑（如巰基乙醇）以降低這些酶類的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并減少研磨過程中各種酶類的作用。十二烷基肌酸鈉（sarkosyl）、十六烷基三甲基溴化銨（hexadyltrimethylammomumbromide,簡稱為CTAB）十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate，簡

2、稱SDS籌離子型表面活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。再加入苯酚和氯仿等有機溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸（DNA、RNA冰溶性很強，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入無水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物總DNA溶液。三、實驗材料水稻幼葉四、主要試劑配方2%CTAB抽提緩沖溶液:CTAB4gNaCl16.364g1MTris-HCl20ml（0.5MEDTA8ml,先用70mlddH2O溶解，再定容至200ml滅菌,冷卻后%2-巰基乙醇（400ul）氯仿-異戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再

3、加4ml異戊醇，搖勻即可。五、實驗步驟1.DNA的提?。?）2%CTABJ由提緩沖液在65C水浴中預(yù)熱。（2）取少量葉片（約1g）置于研缽中，用液氮磨至粉狀；（ 3） 加入700ul的2%CTAB抽提緩沖液，輕輕攪動；（ 4） 將磨碎液分倒入ml的滅菌離心管中，磨碎液的高度約占管的三分之）（ 5） 置于65的水浴槽或恒溫箱中，每隔10min輕輕搖動，40min后取出；（ 6） 卻2min后，加入氯仿-異戊醇（24：1）至滿管，劇烈振蕩23min，使兩者混合均勻；（ 7） 入離心機中10000rpm離心10min,與此同時，將6004的異丙醇加入另一新的滅菌離心管中；（ 8） 000rpm離心1

4、min后，移液器輕輕地吸取上清夜，轉(zhuǎn)入含有異丙醇的離心管內(nèi)，將離心管慢慢上下?lián)u動30sec，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物；（ 9） 10000rpm離心1min后，立即倒掉液體，注意勿將白色DNA沉淀倒出，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；（ 10） 60sec后，直立離心管，加入720以的75%乙醇及804l5M勺醋酸鈉，輕輕轉(zhuǎn)動，用手指彈管尖，使沉淀與管底的DNA塊狀物浮游于液體中；（ 11） 置30min，使DNA塊狀物的不純物溶解；（ 12） 10000rpm離心1min后，倒掉液體，再加入80075%的乙醇，將DNA再洗30min;（ 13） 10000rpm離心30sec后

5、，立即倒掉液體，將離心管倒立于鋪開的紙巾上；數(shù)分鐘后，直立離心管，干燥DNA（自然風干或用風筒吹干）；（ 14） 入50小XTE合RNase獴沖液，使DNA溶解，置于37恒溫箱約15h,使RNA消解；（ 15） 于-20保存、備用。2.DNA質(zhì)量檢測瓊脂糖電泳檢測，原理和方法見實驗二。六、注意事項（ 1）葉片磨得越細越好。（ 2）移液器的使用。（ 3）由于植物細胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作應(yīng)迅速，以免組織解凍，導(dǎo)致細胞裂解，釋放出DNA酶，使DNA降解。思考題：1. 本實驗中所用到的各試劑的作用是什么CTAB,氯仿,異丙醇,75%乙醇,ED

6、TA2提取基因組DNA的方法有哪些各有何優(yōu)缺點實驗二多聚酶鏈式反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)®因擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測1 實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)的基本原理，掌握PCR的基本操作技術(shù)以及瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)。2 實驗原理PCR用于擴增位于兩端已知序列之間的DNA區(qū)段，即通過引物延伸而進行的重復(fù)雙向DNA合成?；驹砑斑^程如下：PCR循環(huán)過程中有三種不同的事件發(fā)生：（1）模板變性；（2）引物退火；（3）熱穩(wěn)定DNA聚合酶進行DNA合成。3 變性：加熱使模板DNA在高溫下（94-95）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。4 退火：在

7、體系溫度降至37-65，模板DNA與引物按堿基配對原則互補結(jié)合，使引物與模板鏈3端結(jié)合，形成部分雙鏈DNA,即退火階段。5 延伸：體系反應(yīng)溫度升至中溫72，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按5到3方向復(fù)制出互補DNA,即引物的延伸階段。上述3步為一個循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階段。從理論上講，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過2530個循環(huán)后DNA可擴增106109倍。典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgCl2、兩條合成的

8、DNA引物、耐熱DNATaq聚合酶。瓊脂糖凝膠電泳的原理：瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，沸水中溶解，45開始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA，其分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。漠化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其發(fā)射的熒光強度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強度大10倍以上，且熒

9、光強度與DNA的含量成正比。用肉眼觀察，可檢測到5ng以上的DNA。三、實驗材料及相關(guān)試劑基因組DNA,基因特異性引物，PCR擴增相關(guān)試劑，等四、實驗步驟1模板DNA的抽提：實驗一所得的水稻基因組DNA。2. PCR操彳(在冰上操作)：(1) PCR反應(yīng)混合液的配制：反應(yīng)體系25以牽無菌的mL離心管中按下列操作程序加樣：反應(yīng)物加樣體積/以L終濃度順序ddH2O110 x Buffer225 mmol/L 3MgCl210 mmol/L 4nn1 xn mmol/Ln200dNTP10tiM上游引物10以M下游引物DNATaq聚合酶m mol/LN mol/LN mol/L1 U(2)將反應(yīng)混合

10、液混勻,然后每個PCR管中分裝24反應(yīng)混合，再加1蟆板DNA,最后加1滴石蠟油，防止水分蒸發(fā)，然后稍離心。(3)將PCR管放到PCR熱循環(huán)儀中,按下列程序開始循環(huán)：94c4min1（預(yù)變性）I94b30sec,60c30sec,72c2min72c7min35個循環(huán)(4)注意事項由于PCR靈敏度非常高，所以應(yīng)當采取措施以防反應(yīng)混合物受痕量DNA的污染。a.所有與PCR有關(guān)的試劑，只作PCR實驗用，而不挪作它用。b.操作中所用的PCR管、離心管、吸管頭等都只能一次性使用。c.每加一種反應(yīng)物，應(yīng)換新的槍頭。3.PCR產(chǎn)物的檢測：瓊脂糖濃度（）;EB濃度（5以l/100mlTBE）（1）制膠（以15

11、0mL為例）a. 稱取1.8g瓊脂糖，加入150ml的TBE緩沖液（pH）,搖勻，用電子天平稱三角瓶的總重量。b. 電爐上加熱，至瓊脂糖完全溶解；然后在天平上加蒸餾水至原重量;c. 用凝膠將制膠板兩端封好，插入適當?shù)氖嶙?，將溶解的瓊脂糖（約50），倒入其中，直至厚度為46mm（如有氣泡要把氣泡趕出），在室溫下冷卻凝固（約3045min）；d.將制膠板置于電泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保證點樣孔完好。（2）點樣a.將“澳酚藍加入到PCR產(chǎn)物中，然后稍微離心；b.每孔點樣從J藍色樣品混合物將沉入點樣孔下部。（ 3）電泳打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至35V/cm（約100V）,可見到浪酚藍條帶由負極向

12、正極移動，約1小時后即可觀察。（ 4）染色將電泳好的凝膠放入含EB的水溶液中,染色15-20分鐘。（ 5）觀察將電泳好的膠置于紫外透射檢測儀上，戴上防護觀察罩，打開紫外燈，可見到橙紅色核酸條帶，根據(jù)條帶粗細，可粗略估計該樣品DNA的濃度。如同時有已知分子量的標準DNA進行電泳，則可通過線性DNA條帶的相對位置初步估計樣品的分子量。（ 6）注意事項a. 煮膠時，膠液的量不應(yīng)超過三角瓶容量的1/3，否則易溢出。b. 煮好的膠應(yīng)冷卻至50左右時再倒，以免制膠板變形，并減少漏膠的機會。c. 倒膠注意厚度（4-6mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齒孔形狀完好。也可待膠稍凝固后，放入4冰箱10多分鐘，以

13、加速膠的凝固。d. 加樣前趕走點樣孔中的氣泡，點樣時吸管頭垂直，切勿碰壞凝膠孔壁，以免使帶型不整齊。e. 一般情況下不必每點一個樣品都換槍頭，吸電泳緩沖液洗幾次即可再點下一個樣品。凝膠中含有EB，切勿直接用手接觸膠，廢棄膠應(yīng)集中處理，勿亂丟。思考題：1 .PCR反應(yīng)液中主要成分是哪些在PCR反應(yīng)過程中各起什么作用2 .為什么在PCR反應(yīng)過程中，使用三個不同的溫度變化3 .用PCR擴增目的基因，要想得到特異性產(chǎn)物需注意哪些事項實驗三植物總RNA的提取一、實驗?zāi)康耐ㄟ^本實驗學(xué)習(xí)從植物組織中提取RNA的方法二、實驗原理RNA是一類極易降解的分子，要得到完整的RNA,必須最大限度地抑制提取過程中內(nèi)源性

14、及外源性核糖核酸酶對RNA的降解。高濃度強變性劑異硫氰酸胍，可溶解蛋白質(zhì)，破壞細胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與核酸分離，失活RNA酶，所以RNA從細胞中釋放出來時不被降解。細胞裂解后，除了RNA,還有DNA、蛋白質(zhì)和細胞碎片，通過酚、氯仿等有機溶劑處理得到純化、均一的總RNA。三、儀器、藥品與試劑配方（一）儀器1 低溫離心機2 分光光度計3 瓊脂糖膠電泳系統(tǒng)，用前先用1%NaOH溶液浸泡過夜，之后再用DEPCK浸泡沖洗。4 高壓滅菌鍋5 研缽、剪刀、一次性手套等(2) 藥品1. 焦碳酸二乙酯(DEPC)2. 嗎啉代丙烷磺酸(MOPS)3. 異硫氰酸胍4. 醋酸鈉(NaAc)5. 氯仿6. 苯酚7. 甲醛8

15、. 乙醇9. 乙二胺四乙酸(EDTA)10. 瓊脂糖11. 異丙醇(3) 試劑配方1. %DEPCK0.1mlDEPC加入100ml三蒸水中，振搖過夜，再濕熱滅菌。2. 2mol/LNaAc、mol/LEDTA、4mol/L異硫氰酸胍、4mol/LLiCl等均用DEPC水配制。3. 5XMOPS電泳緩沖液（pHMOPSmol/LNaAc40mmol/LEDTA5mmol/L四、實驗步驟（一）總RNA的提?。ǚ桨敢唬?. 實驗前10天左右播種水稻種子，在3-4葉期，剪取1.2g幼葉。放入研缽，在液氮中研磨成粉末狀，移入10mL離心管。加入4mol/L異硫氰酸胍4mL苯酚3mL2mol/LNaAc

16、（pHmL氯仿mL混勻，冰浴放置30min。2. 4，8000r/min，離心13min。3. 棄沉淀，取上清至另一干凈無菌離心管中。4. 加入2倍體積無水乙醇，-70，h。5. 4，8000r/min，離心13min。6. 棄上清，在沉淀中加入1mL4mol/LLiCl,使其溶解。7. 移入mL離心管中，冰浴2h。8. 4，13000r/min，離心15min。9. 棄上清，在沉淀中加入400uLDEPC水，再加入400uL氯仿，混勻。10. 4，13000r/min，離心6min。11. 取上清,并加入1/10體積3mol/LNaAc（pH），2倍體積無水乙醇，-20放置30min。12.

17、 4，13000r/min，離心20min。13. 將沉淀RNA用70%乙醇洗滌2次。14. 將沉淀RNA室溫下稍干燥。15.加30uLDEPCC溶解，-70C保存。（二）總RNA的提取（方案二）利用TRIzol提取液抽提RNA,具體步驟如下：1. 取幼葉約250mg在液氮中研磨至細粉，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的ml離心管；2. 加入1mlTRIZOL提取液震蕩搖勻；3. 室溫放置5min后，加入ml的氯仿，劇烈搖動離心管5min；4. 在8條件下，12000rpm離心15min；5. 溶液分為兩層，下層為酚氯仿淺紅色液層，將上層液體移入干凈離心管，加入ml異丙醇在1530條件下，沉淀10min；6. 然后在

18、,28條件下，12000rpm離心10min,RNA沉淀管壁和底部；7. 去掉液體部分，加入1ml75%酒精洗2次；8.風干后，加入25dDEPC處理過的水溶解RNA,儲藏于-80C冰箱備用。(三)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析總RNA1配制%變性瓊脂糖凝膠(40mL)稱取0.48g,力口入DEPC/KmL,5X電泳緩沖液4mL,加熱使溶解，稍冷卻加入甲醛mL,混勻，室溫凝固h.2. RNA電泳檢測樣品制備RNA2以1甲醛以1甲酰胺110XMOPS2ii1RNALoading21Buffer滅菌的DEPC4以1水混合液輕輕混勻并離心，放于65下溫育5min后，置于冰上。3. 電泳檢測將%變性瓊脂糖

19、凝膠放入水平電泳槽中，加1XMOPS電泳緩沖液，覆蓋凝膠約1mm。將RNA樣品加到凝膠點樣孔中，在5V/cm條件下電泳30min，然后在EB中染色15-20min，在紫外燈下觀察提取的RNA的質(zhì)量。五、注意事項1 在研磨過程中，利用液氮時刻使組織保持冰凍狀態(tài)。2 RNA酶是一類生物活性非常穩(wěn)定的酶類，除了細胞內(nèi)源RNA酶外，外界環(huán)境中均存在RNA酶，所以操作時應(yīng)戴手套，并注意時刻換新手套。思考題：1.實驗中所用到的各試劑的作用是什么焦碳酸二乙酯(DEPC),嗎啉代丙烷磺酸(MOPS),異硫氰酸胍,醋酸鈉(NaAc),氯仿,苯酚,甲醛,乙醇,乙二胺四乙酸（EDTA）,異丙醇動植物組織mRNA提取

20、實驗方法一、材料水稻葉片或小鼠肝組織。二、設(shè)備研缽，冷凍臺式高速離心機，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測儀，電泳儀，電泳槽。三、試劑1、無RNA酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（1802小時）裝蒸餾水，然后加入的DEPC（體積/體積）,處理過夜后高壓滅菌。2、75%乙醇：用DEPCi理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。3、1渥析柱加樣緩沖液；20mmol/LTrisCl；LNaCl1mmol/LEDTA,%SDS4、洗脫緩沖液：10mmol/LTrisCl,1mmol/L EDTA% SDS。四、操作步驟(一)動植物總RNA提取-Trizol

21、法Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交，Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1mlTrizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。2、研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，1

22、2000g離心10分鐘。4、棄去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4下7500g離心5分鐘。5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55-60水溶10分鐘。RNA可進行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70。注意1、整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。2、加氯仿前的勻漿液可在-70保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4保存一周，-20保存一年。(二)mRNA提取由于mRNA末端含有多poly(A)+，當總RNA流徑oligo(dT)纖維

23、素時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸儲水中，mRNA可被洗下，經(jīng)過兩次oligo(dT)纖維素柱，可得到較純的mRNA。1、用LNaOH懸浮-1.0goligo(dT)纖維2、將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng)DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為，用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。3、用1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH值小于。4、將（一）中提取的RNA液于65溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2x柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當所有RNA溶液進入柱床后，加入1倍柱床體積的1x

24、層析柱加樣溶液。5、測定每一管的OD260,當洗出液中OD為0時，加入2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。6、測定OD260,合并含有RNA的洗脫組分。7、 加入1/10體積的3MNaAc，倍體積的冰冷乙醇，混勻，-2030分鐘。8、 4下12000g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀，4下12000g離心5分鐘。9、小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。10、 用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成(或保存在70%乙醇中并貯存于-70)。注意1、mRNA在70%乙醇中-70可保存一年以上。2、oligo(dT)纖維

25、素柱用后可用lNaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入疊氮鈉(NaN3)冰箱保存，重復(fù)使用。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。RNA提取流程RNA(totalRNA)和信使RNA(mRNA用抽提RNA的提取RNA和無RNA酶的環(huán)境原核生物能產(chǎn)生功能上截然不同的三種RNA,信使RNA(mRNA)核糖體RNA(rRNA),轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)而真核生物則能產(chǎn)生四種，還有一種為真核生物所持有的小是由基因轉(zhuǎn)錄而來的，它運送編碼蛋白所需的信息.由于mRNA代表了基因表達的水平,因此mRNA的分離,定量和檢測極為重要.應(yīng)用RNA對細胞和分子生物學(xué)的各個方面進行研究非常普遍.RN

26、A存在于從簡單的逆轉(zhuǎn)錄病毒到哺乳動物細胞的所有的生命形式之中.由于當前沒有一種方法能夠直接擴增RNA,因此,RNA的分離通常是決定實驗結(jié)果質(zhì)量的第一步，也是關(guān)鍵的一步.提取RNA過程中防止RNA酶的污染所采取的步驟RNA分離的實用方法既有簡單直接的方法(如分離rRNA和tRNA)也有困難和涉及復(fù)雜步驟的方法(如分離mRNA).在無細胞體系中克隆基因的體外轉(zhuǎn)錄非常有用，它可以產(chǎn)生足量的同源RNA分子用作探針或模板以識別和測定表達基因的量或用于RNA的生化研究，處理RNA樣品時必需仔細小心，其程度取決于樣品的用途和來源.由于RNA酶存在于所有的生物中并且能夠抵抗諸如煮沸這樣的物理破壞同此建立一個無

27、RNA酶的環(huán)境對于制備優(yōu)質(zhì)RNA很重要.對于制備mRNA來說這些預(yù)防措施尤其重要.方案:工作區(qū)域應(yīng)與進行普通微生物實驗的區(qū)域分離好,特別是那些用于細菌接種,培養(yǎng)基和試劑配制的區(qū)域，那些培養(yǎng)基和試劑用于從細菌和動物細胞中進行DNA的制備和操作.通常認為這些區(qū)域富含RNA酶.如有可能，使用標有"無RNA酶”的商品試管，吸頭，溶液和水.通常新的無菌處理過的塑料試管和吸管無RNA酶,3）雙蒸水（ddH2O）和溶液應(yīng)該用RNA酶的抑制劑DEPC焦碳酸二乙酯）進行處理：每100mL溶液或水中加入DEPO液，放在搖床上充分混勻并在37c下作用數(shù)小時.然后將溶液高壓滅菌15min使DEPC失活.4）

28、用分子級的試劑和DEPC&理過的水配制的溶液通常沒有RNA酶.5）分離RNA以前,將一些實驗室玻璃制品置于烤箱在300C烘烤4h以滅活核酶.如有可能,將其他設(shè)備也滅菌處理.從組織中提取RNA則要注意：動物器官的解剖器械存放組織塊的玻璃器皿凍存組織塊所用的器皿組織器官的沖洗液人汗含有RNA酶，故在所有步驟中均應(yīng)戴手套并經(jīng)常更換.記住我們的周圍環(huán)境含有大量的微生物和氣霧,它們來自吸液操作或來自我們自己的呼吸.這些可能造成RNA酶的污染一些組織像脾臟可能比其它組織含有更多的RNA酶.細菌比哺乳動物細胞中有更多的RNA酶.因此從這些細胞中制備RNA應(yīng)采取更嚴格的預(yù)防措施.分離后的RNA通過瓊脂

29、糖凝膠電泳再經(jīng)澳化乙錠染色后便可檢查其是否完整.rRNA（18s和28s）條帶模糊可能表明由RNA酶引起的RNA的降解.一步法分離RNA應(yīng)用從組織或細胞中分離細胞的總RNA從液體樣品中分離RNATRIREAGENT（Tripure雙一種用于RNA分離的商品溶液.該法源于chomc-zynski的RNA分離一步法.它更便于使用并且結(jié)果更加可靠.對于來源有限的樣品，我們推薦使用這種試劑.這種試劑能從同一樣品中同時分離RNA,DNA蛋白質(zhì).方案.用lmLTripure/50-100mg（組織）勻漿組織樣品.對于細胞，每10cm2面積（貼壁的單層細胞）或每106個細胞（細胞沉淀）使用1mL.將樣品轉(zhuǎn)至

30、管中.（-70C可保存1月）室溫下放置樣品5min.每1mLTripure中加入氯仿并搖動15s,置于室溫下215min.4C下12000g離心15min.將水相（上部）轉(zhuǎn)至一個新EP管.每1mLTripure加入異丙醇沉淀RNA.將樣品置于室溫下510min.4C,12000g離心10min.凝膠樣沉淀物為RNA.吸出上清并用1mL75*醇在渦旋振蕩器上洗滌RNA沉淀一次，4C,7500g離心5min.晾干RNA沉淀.然后用無RNA酶的水，甲酰胺或的SDS容液溶解沉淀.RNA的檢測:將樣品稀釋液于三處波長處讀取OD值.記錄OD值,通過計算確定RNA濃度或純度.公式如下對于ssDNA:ssDN

31、A=33X(OD26&OD310)湍釋倍數(shù)對于dsDNA:dsDNA=50X(OD260-OD310)稀釋倍數(shù)對于ssRNA:ssRNA=40X(OD260OD310)xffi釋倍數(shù)以上濃度單位為ug/mL.注意事項1)OD310值是背景，若鹽濃度較高，OD310"值也高.2)OD260/OD280對DNA而言其值大約為，高于有RNA污染.低于則有蛋白質(zhì)污染.3)OD260/OD280對RNA而言其值大約為.小結(jié)所有可能與RNA接觸的器材均得用DEPCM理.操作過程中應(yīng)帶口罩,手套.DEPC致癌之可能，盡量避免接觸皮膚提取的RNA應(yīng)盡早逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RTPCR)RTPCR間接用來擴增從RNA分子今得到的一段特異序列.RNA首先被逆轉(zhuǎn)錄為cDNA.用位于一段特異序列或者一