植物響應(yīng)寒冷脅迫的CBF基因表達(dá)調(diào)控

1、植物響應(yīng)寒冷脅迫的CBF®因表達(dá)調(diào)控寒冷脅迫是農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中一種嚴(yán)重的自然災(zāi)害，世界每年因此造成的損失十分巨大。自然環(huán)境下溫度是決定植物地域分布的主要限制因子，在栽培條件下更影響著農(nóng)作物及園藝植物等的產(chǎn)量和品質(zhì)，低溫對(duì)植物的影響尤為突出。低溫脅迫常使某些起源于熱帶、亞熱帶地區(qū)的植物因冷敏感性而無(wú)法在溫帶以北地區(qū)露地安全越冬，這就給引種帶來(lái)不利，因此，探明植物抗寒性形成的生理機(jī)制和遺傳因素，不僅在理論上具有重要的科學(xué)意義，在解決生產(chǎn)實(shí)際問(wèn)題上也具有廠泛的應(yīng)用價(jià)值。經(jīng)過(guò)研究，至今人們己在植物抗寒的形態(tài)學(xué)、生理生化、生物物理、生態(tài)及細(xì)胞遺傳學(xué)方面取得廣泛進(jìn)展，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)植物抗寒

2、的分子生物學(xué)研究成為近十年的研究熱點(diǎn)之一，導(dǎo)入外源基因提高植物的抗寒性已成為現(xiàn)代植物育種的主要手段，并開(kāi)始逐步探索利用基因工程手段進(jìn)行植物抗寒育種及有關(guān)生理研究。1 CBF家族擬南芥CBF/DREB僖因家族是一個(gè)包括CBF1CBF2CBF3CBF4CBF5CBF6的小基因家族。雖然CBF4與其他CBF具有相同保守的AP2區(qū)域，但CBF4不受低溫誘導(dǎo)，而是受干旱誘導(dǎo)，是一個(gè)抗旱轉(zhuǎn)錄因子。過(guò)量表達(dá)的CBF4轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，其抗旱性和抗寒性均明顯提高。CBF么CBF2和CBF3基因在擬南芥中屬于一個(gè)編碼同蛋白的基因小家族，具有快速冷誘導(dǎo)表達(dá)特性。這3個(gè)基因連鎖于擬南芥4號(hào)染色體的短臂上，與分子標(biāo)記

3、m60QpG11緊密連鎖。CBF4定位于5號(hào)染色體上1。CBF1/2/3蛋白結(jié)構(gòu)中有pkkpagrkkfretRhifadsawR特異氨基酸識(shí)別蛋白，還發(fā)現(xiàn)具有與蛋白激酶C和酪蛋白激酶n結(jié)合的位點(diǎn)2oCBFs與它們靶細(xì)胞的啟動(dòng)子中CRT/DRT（C-重復(fù)元件/干旱響應(yīng)元件）元件結(jié)合并且誘導(dǎo)這些基因的轉(zhuǎn)錄以響應(yīng)低溫。CBF碓寒冷馴化過(guò)程中是重要的組件；三個(gè)低溫誘導(dǎo)CBFs的過(guò)表達(dá)植株導(dǎo)致了在溫暖條件下CBF靶基因的誘導(dǎo)，并且不需要經(jīng)過(guò)寒冷馴化就可具有耐寒性的能力3。2 CBF轉(zhuǎn)錄因子基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)2.1 CBF/DREB1春化途徑春化發(fā)育特性是植物的重要性狀，由春化相關(guān)基因調(diào)控，低溫是春化發(fā)育中

4、關(guān)鍵因素。許多植物在遭受?chē)?yán)寒前,若經(jīng)過(guò)一個(gè)緩慢的降溫過(guò)程,抗寒性會(huì)逐漸提高,這一過(guò)程稱(chēng)為低溫馴化。CBF基因在耐寒方面的作用對(duì)擬南芥進(jìn)行了詳細(xì)的研究，低溫馴化期間擬南芥大約20%勺基因表達(dá)都直接或間接受CBFW錄因子的調(diào)控4。擬南芥中CBFs直接靶基因包括CORE因強(qiáng)烈的誘導(dǎo)表達(dá)5。谷物中類(lèi)似的CBF靶基因，其上游調(diào)控區(qū)域也含有CRT/DRE%件6。圖1Stockinger等7大麥5號(hào)染色體長(zhǎng)臂在FR-H2基因位點(diǎn)上CBF基因和VRN-H1/Fr-H1基因的示意圖.CB崔因不僅受寒冷誘導(dǎo)，而且也受VRN-H1負(fù)調(diào)控影響。冬季型大麥表達(dá)VRN-H1蛋白的vrn-H1基因需要經(jīng)過(guò)越冬才表達(dá)，因?yàn)閂

5、rn-H1是不表達(dá)的。不同因素會(huì)影響Vrn-H1的表達(dá)。VRN-H1的活性可能直接抑制CBF表達(dá)，或者可能導(dǎo)致中間物質(zhì)激活來(lái)抑制CBF表達(dá)，或者兩者同時(shí)在轉(zhuǎn)錄前或轉(zhuǎn)錄后水平上起作用。如圖1所示，冬麥基因型已經(jīng)分離出兩個(gè)主要基因座，F(xiàn)r-1和Fr-28。Fr-1和Fr-2位于部分同源群5號(hào)染色體上，之間距離20-50cm取決于群體定位不同9。大麥中Fr-1基因表示為Fr-H1（H表示大麥）。VRN1編碼蛋白為MAD嬖轉(zhuǎn)錄因其受低溫誘導(dǎo)促進(jìn)開(kāi)花，是植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因子10 。VRN-1共同隔離的Fr-19,兩個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)之一均可調(diào)節(jié)小麥的春花需求。對(duì)于Fr-2上CBF同源基因表達(dá)的

6、調(diào)控可能是復(fù)雜的，這種復(fù)雜性取決于內(nèi)源性和外源性的相互作用。VRN-1/Fr-1是一個(gè)部分負(fù)調(diào)控在Fr-2的某些CBF基因。VRN-H1通過(guò)一個(gè)連鎖基因在VRN-H1/Fr-H1發(fā)揮多效性作用對(duì)CBF表達(dá)產(chǎn)生負(fù)影響。因?yàn)閂RN-1是一個(gè)MADSDN結(jié)合蛋白，它可能直接結(jié)合到CBF基因組區(qū)域，或者可能間接影響其他調(diào)控因子來(lái)控制CBF表達(dá)。冬季中攜帶vrn-1等位基因的基因型的CB崔因表達(dá)比春季生長(zhǎng)中攜帶vrn-1等位基因的基因型的CB法達(dá)水平更高7。除此之外，一旦冬季攜帶等位基因vrn-1的基因型受到春化作用，其CBFW錄水平抑制到與非春化植物相同的水平7o這表明，VRN-1會(huì)抑制在FR-2位置

7、的CBFs的表達(dá)，從而降低抗凍性。群體分離的VRN-H1攜帶隱性vrn-H1等位基因的植株比攜帶顯性vrn-H1等位基因的植株具有更高的CBF和COFg因的轉(zhuǎn)錄水平7。此外，當(dāng)植物受到冷脅迫后，短日照下植株（減少VRN-H1水平）的CBF和COR專(zhuān)錄水平明顯高于長(zhǎng)日照處理的植物。植物體內(nèi)多種CBF基因以及下游COR®基因轉(zhuǎn)錄水平的降低伴隨著VRN-1轉(zhuǎn)錄水平增加可以為植物進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段后對(duì)寒冷耐受性降低提供合理的解釋。擬南芥成花激活MAD流式基因SOC隨過(guò)直接抑制CBFg因作為冷響應(yīng)途徑的負(fù)調(diào)控子11o擬南芥哥倫比亞野生型株系，SOC休E葉片中表達(dá)最強(qiáng)烈，在根尖花序和莖段中也可檢測(cè)

8、到其表達(dá)。socl突變型和SOCti表達(dá)株系中三個(gè)CBF基因表達(dá)水平增加了，而CBF的調(diào)控基因ICE1,HOS1和ZAT12的轉(zhuǎn)錄水平均未受到影響。染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證明相比socl突變型，SOC他表達(dá)植株體內(nèi)CBF啟動(dòng)子中富集了CArG盒式區(qū)域，這說(shuō)明SOC1®過(guò)直接抑制CBF基因轉(zhuǎn)錄來(lái)負(fù)調(diào)控寒冷響應(yīng)11。有趣的是，小麥中與擬南芥SOC1WSOC的同源基因表達(dá)不受春化作用和光周期的影響，這表明不同物種同種基因不同功能10。雖然擬南芥SOC休口谷物VRN-1似乎與葉片中CBF和CORE因下調(diào)控制相關(guān)，擬南芥中VRN-1對(duì)CBF基因的影響似乎不同于SOC1MCBF基因的直接影響。擬南芥

9、soc1突變型表現(xiàn)為CBF基因?qū)漤憫?yīng)增強(qiáng)以及提高的抗凍性，這說(shuō)明秋季SOCM氐水平轉(zhuǎn)錄有利于植物適應(yīng)寒冷環(huán)境11oSOC轉(zhuǎn)錄水平伴隨著擬南芥開(kāi)花初始時(shí)間強(qiáng)烈增加，這表明SOC扃轉(zhuǎn)錄水平將會(huì)對(duì)CBF基因和他們的下游CO砌基因進(jìn)行下調(diào)控制。2.2 響應(yīng)低溫的CBFs調(diào)控表達(dá)當(dāng)植物暴露于4環(huán)境后，15min內(nèi)低溫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子CBF1,2和3的積累會(huì)快速表達(dá)12o還冷中植物CBF轉(zhuǎn)錄因子在2左右出現(xiàn)高峰，然后會(huì)下降到一定程度略高于溫暖環(huán)境下它們的表達(dá)。一旦將植物移入溫暖環(huán)境，CBFW錄因子便快速降解12。ICE1,一個(gè)類(lèi)似MYCbHLH!以結(jié)合到MYCH別位點(diǎn)的蛋白，研究表明它參與CBFs的誘導(dǎo)1

10、3o這個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)點(diǎn)突變會(huì)造成低溫響應(yīng)CBF3表達(dá)劇烈減少。ICE1是HOS值素化目標(biāo)蛋白，HOS傀一個(gè)E3連接酶也是寒冷馴化的負(fù)調(diào)控子14。SIZ1,一個(gè)SUMO-E31接酶，可以阻止ICE1的泛素化，導(dǎo)致低溫響應(yīng)的CBFs表達(dá)量增加15o雖然CBF1和CBF2的啟動(dòng)子中具有MYCH別序列，ice1突變體中CBF1和CBF2的表達(dá)水平受到影響，說(shuō)明低溫響應(yīng)的三個(gè)CBF轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控表達(dá)可能是想法獨(dú)立的。對(duì)比ice1突變體，這個(gè)基因完全敲除后CBF1/2/3的表達(dá)水平并沒(méi)有顯著影響，說(shuō)明除了ICE1之外還可能有別的因子調(diào)控CBFs的表達(dá)。過(guò)表達(dá)ICE1植株內(nèi)增加了低溫響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子C

11、BF2和CBF3mRNA勺積累。然而，溫暖條件下ICE1過(guò)表達(dá)植株內(nèi)并沒(méi)有誘導(dǎo)出三個(gè)CBFs，說(shuō)明ICE1單獨(dú)表達(dá)不足以誘導(dǎo)CBFs。植物體內(nèi)可能具有ICE1無(wú)法克服的抑制因子，ICE1修飾或者僅在低溫環(huán)境時(shí)另一些調(diào)節(jié)子會(huì)發(fā)揮作用或者CBFmRN照定性的改變。環(huán)己酰亞胺處理也會(huì)誘導(dǎo)CBFmRNA）積累，這種結(jié)果的一個(gè)解釋是一個(gè)潛在負(fù)調(diào)控元件對(duì)于CBFs的溫暖抑制重要性12oMYB1導(dǎo)口ZAT12作為CBFs的負(fù)調(diào)控子。MYB1序口ZAT12的過(guò)表達(dá)均會(huì)減少CBFs低溫誘導(dǎo)的積累16oMYB1馱失植株會(huì)增加某些低溫響應(yīng)的潛在因子的積累16。然而，MYB1喊ZAT12基因敲除后CBFs的影響不受影

12、響，可能由于在擬南芥內(nèi)大型MYB和鋅指結(jié)構(gòu)家族具有冗余基因或者由于在CBF調(diào)控中某些潛在負(fù)調(diào)控元件的功能所致。2.3 寒冷馴化的非依賴(lài)CBF途徑有趣的是，許多寒冷敏感植物，例如番茄包含低溫誘導(dǎo)的功能性CBF蛋白。番茄中CBF1是受寒冷誘導(dǎo)的，并且與擬南芥的功能相同，當(dāng)CBF1過(guò)表達(dá)導(dǎo)致擬南芥獲得連續(xù)耐寒性17。然而，即使擁有這個(gè)寒冷誘導(dǎo)的功能性CBF蛋白，番茄依然不具有耐寒性。這說(shuō)明番茄中CBF下游所需的組件可能丟失或者擬南芥中存在另外的可以提高耐寒所需組件的途徑而番茄中沒(méi)有這些途徑。突變體實(shí)驗(yàn)證明影響耐寒性的機(jī)制與CBF途徑相互獨(dú)立。esk1突變體連續(xù)性耐寒，然而植株并沒(méi)有表現(xiàn)出CBFs或一

13、些CBF靶基因水平顯著增加18。esk1突變體內(nèi)積累了高水平脯氨酸（冷凍保護(hù)劑），暗示了一個(gè)解釋耐寒性增強(qiáng)的可能機(jī)制。然而，ESK1編碼一個(gè)含有未知功能區(qū)域的新蛋白，所以脯氨酸水平增加以及耐寒性增加的機(jī)制仍然未知。MYB專(zhuān)錄因子內(nèi)一個(gè)突變,hos10,會(huì)影響ABA生物合成基因NCED3勺調(diào)控，最終導(dǎo)致耐寒性降低而CBF調(diào)節(jié)子基因COR15aRD292ADHff口KIN1的表達(dá)增加19o耐寒性誘導(dǎo)中存在一個(gè)功能性CBF途徑意味著單獨(dú)CBF途徑可能不足以完全提供給野生型耐寒性。3應(yīng)答其他環(huán)境因子的CBFs調(diào)控表達(dá)植物對(duì)不同環(huán)境信號(hào)的重疊響應(yīng)表達(dá)時(shí)，研究了響應(yīng)多種環(huán)境因素的CBFs復(fù)雜表達(dá)調(diào)控。晝夜

14、規(guī)律對(duì)CBF誘導(dǎo)也有影響。由于晝夜規(guī)律溫暖條件下CBF3mRN冰平在早晨達(dá)到高峰。重要的是，生物鐘對(duì)CBF低溫誘導(dǎo)具有影響，鐘門(mén)控制著誘導(dǎo)。當(dāng)植物移入凌晨低溫環(huán)境下，這與CBF渥夜表達(dá)的高峰時(shí)間相抵觸，寒冷中CBFs的誘導(dǎo)水平高于處于CBF表達(dá)低谷移入寒冷環(huán)境的植株20o這說(shuō)明氧化鐘與冷信號(hào)共同作用確保CBFs的誘導(dǎo)以及在合適時(shí)間作出寒冷的響應(yīng)。用相同的方式，證明光量子對(duì)寒冷誘導(dǎo)的CBFs以及它們靶基因轉(zhuǎn)錄也有影響。一個(gè)與GUSa合并含有四個(gè)拷貝CRT勺報(bào)告基因發(fā)現(xiàn)需要光照才能進(jìn)行低溫誘導(dǎo)。一個(gè)10min的紅光脈沖足以完成這個(gè)低溫響應(yīng)；然而，當(dāng)紅光脈沖后緊跟著遠(yuǎn)紅光脈沖的話(huà)這種低溫響應(yīng)就會(huì)被消

15、除21。這個(gè)實(shí)驗(yàn)說(shuō)明光敏色素可以調(diào)控低溫響應(yīng)。Kim等證明了這是一個(gè)依賴(lài)光敏色素B的響應(yīng)。這個(gè)光量子參與調(diào)解CRT元件的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明CBFs本身響應(yīng)光照后進(jìn)行積累調(diào)控或者光照信號(hào)處于介于CBFmRNAR累和CBF基因調(diào)控之間的下游監(jiān)測(cè)點(diǎn)發(fā)揮作用。光量子信號(hào)已證明在16調(diào)節(jié)CB腺錄因子的誘導(dǎo)。紅光與遠(yuǎn)紅光低的比率就能導(dǎo)致16c時(shí)CBF誘導(dǎo)量增加。此外，這種低比率紅光/遠(yuǎn)紅光的光照實(shí)驗(yàn)可以在16提高種子的耐寒性，而22下則不能22。因此光信號(hào)的參與對(duì)CBF的誘導(dǎo)和激活是重要的。除此之外，實(shí)驗(yàn)證實(shí)機(jī)械力也會(huì)誘導(dǎo)CBFs的轉(zhuǎn)錄。接觸或攪拌擬南芥植株后，CBF1/2/3會(huì)快速的誘導(dǎo)到平均水平或者高于寒冷誘導(dǎo)

16、的水平1。從CBF調(diào)控的多種方法中整合信息也許會(huì)提供給我們理解響應(yīng)低溫CBF誘導(dǎo)機(jī)制的合理解釋。寒冷誘導(dǎo)中鈣離子的參與證明是通過(guò)CRTs實(shí)現(xiàn)的。岡田酸處理能抑制4個(gè)CRTW貝報(bào)告基因的寒冷誘導(dǎo)21。岡田酸被證實(shí)可抑制鈣離子的順勢(shì)急劇積累，但是對(duì)鈣離子的緩慢積累沒(méi)有影響，通過(guò)抑制蛋白磷酸酶活性來(lái)減少鈣離子內(nèi)流23。抑制含有4個(gè)CRTW貝的報(bào)告基因所需的濃度相對(duì)2c類(lèi)型蛋白磷酸酶的抑制是特定的21o兩個(gè)2c類(lèi)型蛋白磷酸酶，ABI1和ABI2是作為擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞中控制鈣離子內(nèi)流的ABA信號(hào)下游的組成成分24。岡田酸對(duì)寒冷誘導(dǎo)的鈣離子水平具體影響是未知的；然而，這個(gè)實(shí)驗(yàn)提升了鈣離子通過(guò)CRT元件來(lái)激活

17、CBF靶基因的可能性?；钚匝酰≧OS調(diào)節(jié)信號(hào)途徑可能也對(duì)誘導(dǎo)CBFs具有重要作用。FRO1是一個(gè)線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合體1的脫氫酶亞基NADHfro1突變體中顯示為RO延續(xù)積累25。fro1突變體對(duì)寒冷敏感，寒冷響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄子COR15a,COR47Kin和RD29a的誘導(dǎo)降低。這種降低導(dǎo)致fro1植株耐寒性下降。有趣的是fro1突變體增加的CBF水平與野生型相比，發(fā)現(xiàn)響應(yīng)低溫的CBF誘導(dǎo)在12小時(shí)時(shí)有了唯一變化。也許這表明活性氧信號(hào)參與了基于晝夜規(guī)律或光照的CBF表達(dá)?；钚匝跣盘?hào)與鈣離子信號(hào)之間存在廣泛的交叉作用。例如，活性氧信號(hào)能夠激活質(zhì)膜Ca2嘀子通道通透性，而Ca2何以調(diào)控活性氧清除機(jī)制26,27。參與CBFs誘導(dǎo)的鈣離子可能對(duì)理解CBF響應(yīng)多種環(huán)境信號(hào)