蛋白質定量新方法及相關技術研究

1、項目名稱：蛋白質定量新方法及相關技術研究首席科學家：張麗華 中國科學院大連化學物理研究所起止年限：2012.1至2016.8依托部門：中國科學院一、關鍵科學問題及研究內容擬解決的關鍵科學問題隨著對復雜生物體系蛋白質組質譜數(shù)據(jù)挖掘和蛋白質功能分析的深入進行，迫切需要獲得大量蛋白質的定量信息。發(fā)展具有自主知識產(chǎn)權的高精度、高準確度、高覆蓋率和高通量的規(guī)模化蛋白質定量新材料、新技術、新方法和新系統(tǒng)，對于推動蛋白質科學的深入研究具有重要意義。因此，本項目針對目前規(guī)?；鞍踪|定量現(xiàn)有方法和技術存在的缺陷，擬重點解決以下關鍵科學和技術問題： （1）蛋白質或肽段回收率、分辨率和鑒定覆蓋率低的問題； （2）蛋

2、白質組相對和絕對定量分析的精確度和準確度差的問題； （3）規(guī)?；鞍踪|定量分析的通量和自動化程度低的問題。 研究內容針對科學問題（1），開展高效低殘留的樣品處理和分離新材料的研究（研究內容1）；針對科學問題（2），開展基于色譜-質譜的蛋白質組相對和絕對定量新方法和新技術的研究（研究內容2和3）；針對科學問題（3），開展集成化蛋白質組定量分析系統(tǒng)的研究（研究內容4）。此外，利用發(fā)展的新材料、新技術、新方法和新系統(tǒng)，示范性開展重要模式生物（如酵母）和腫瘤（如肝癌）相關蛋白質組的定量研究（研究內容5）。1. 高效低殘留的蛋白質組樣品處理和分離新材料 1）樣品處理新材料：通過化學和物理方法，對磁性材料

3、、整體材料、介孔材料和多孔材料等樣品處理材料進行表面修飾，有效降低基質的非特異性吸附，提高蛋白質和多肽的回收率； 2）蛋白質豐度均衡新技術：基于噬菌體展示文庫、適配體文庫等配基，發(fā)展蛋白質組均衡技術，通過在去除多種高豐度蛋白質的同時富集低豐度蛋白質，提高蛋白質組鑒定的覆蓋率； 3）蛋白質高效分離新材料：研制新型大孔微球、超細粒徑顆粒和雜化整體材料，實現(xiàn)蛋白質的低殘留、高分辨分離。 2. 基于色譜-質譜的蛋白質組相對定量新方法和新技術1）標記相對定量方法：建立基于體內終端氨基酸同位素標記、串聯(lián)18O同位素標記、金屬離子或其他化學試劑等非同位素標記的大規(guī)模蛋白質相對定量新方法，提高標記相對定量的精

4、確度、準確度和覆蓋率； 2）非標記相對定量方法：發(fā)展基于流動相添加內標、曲線擬合等色譜-質譜聯(lián)合定量新方法、基于化學修飾的肽段高效率、高穩(wěn)定性離子化新技術，以及基于蛋白質特征肽段的多反應監(jiān)測質譜高通量相對定量方法，提高非標記相對定量的精確度和準確度； 3）定量數(shù)據(jù)解析算法：建立基于高階線性分解模型、統(tǒng)計模型、分析模型等多種蛋白質組數(shù)據(jù)處理方法，提高對不同豐度蛋白質的定量分析能力；研究肽段一級譜特征的識別與提取、二級譜圖母離子質量的校準、“混合”二級譜的識別與鑒定和肽段保留時間測算，提高質譜定量信息的可利用率；研究基于一級/二級譜圖的標記/非標記定量算法和肽段/蛋白定量比值準確性評價算法，提高蛋

5、白質定量計算的準確度。 3. 基于色譜-質譜的蛋白質組絕對定量新方法和新技術 1）內標肽的設計、合成和表征：設計合成內標肽，并采用標準氨基酸、穩(wěn)定同位素標記的氨基酸同位素稀釋法，結合選擇性反應檢測質譜，建立內標肽的準確表征新方法，為蛋白質組的準確定量提供參考物質； 2）標記蛋白質組絕對定量新方法：發(fā)展蛋白質的生物雙重標記、固相標記和金屬元素標記等蛋白質多重標記技術，以及色譜保留時間與多反應監(jiān)測質譜結合的目標蛋白質組絕對定量方法，提高蛋白質組絕對定量的通量，實現(xiàn)蛋白質組的動態(tài)監(jiān)測； 3）非標記規(guī)?；鞍踪|組絕對定量新方法：發(fā)展質譜圖計數(shù)與多反應監(jiān)測質譜結合的定量方法，以及絕對定量數(shù)據(jù)提取和處理方

6、法，提高復雜生物樣本中蛋白質組絕對定量的準確度。 4. 集成化蛋白質組定量分析系統(tǒng) 1）在線樣品處理系統(tǒng)：設計蛋白質在線變性、還原和烷基化裝臵，研制緩沖溶液交換接口，制備高效低殘留固定化酶反應器，并通過上述部件的集成，構建在線蛋白質組樣品處理系統(tǒng)，實現(xiàn)蛋白質組的高效、高通量和低損失率的在線處理； 2）在線標記系統(tǒng)：研制基于新型樣品處理材料的蛋白質組通用或選擇捕集柱，并通過優(yōu)化同位素或非同位素原位固相標記條件，構建在線標記系統(tǒng)，實現(xiàn)蛋白質或肽段的高通量標記； 3）集成化蛋白質組定量系統(tǒng)：構建樣品處理、標記、分離、鑒定和數(shù)據(jù)處理的規(guī)?；鞍踪|定量集成化系統(tǒng)。 5. 復雜樣本的定量蛋白質組分析 1)

7、 采用國際通用的模式生物（如酵母），對發(fā)展的新材料、新技術和新方法進行評價，并建立標準化操作流程； 2) 針對腫瘤（如肝癌等）發(fā)生發(fā)展相關的潛在分子標記物群和治療靶點群，示范性地開展相關蛋白質的規(guī)?；糠治?。二、預期目標1 總體目標 發(fā)展具有原始創(chuàng)新性的蛋白質定量新方法和相關技術，使我國在高效低殘留的蛋白質樣品處理和分離材料、基于色譜-質譜的蛋白質組絕對和相對定量技術，以及高通量、自動化的蛋白質組定量分析系統(tǒng)方面達到國際領先水平，并力爭引領國際發(fā)展趨勢。所發(fā)展的新材料、新方法、新技術和新系統(tǒng)能夠為我國科學家實現(xiàn)重要生物體系蛋白質組的高精確度、高準確度、高通量和深度覆蓋的定量分析，以及與疾病相

8、關的潛在生物標志物篩選以及藥物靶標蛋白質的尋找等蛋白質科學前沿領域研究提供重要技術支撐。 2. 五年目標通過本項目的實施，發(fā)展一批具有自主知識產(chǎn)權或原始創(chuàng)新的規(guī)?；鞍踪|定量新材料、新技術、新方法和新系統(tǒng)，顯著改善規(guī)?；鞍踪|定量的回收率、精確度、準確度、覆蓋率和通量。具體目標包括： 1) 研制高效低殘留蛋白質樣品處理和分離材料，將蛋白質或肽段的回收率提高到90%以上，峰容量達到100以上； 2) 提供高精確度蛋白質組相對定量新方法，變異系數(shù)小于20%；提供高準確度蛋白質組絕對定量新方法，誤差小于10%，經(jīng)質譜鑒定的目標蛋白質的絕對定量覆蓋率達到80%以上； 3) 構建自動化蛋白質定量分析系統(tǒng)

9、，實現(xiàn)樣品在線處理、分離和鑒定，單次運行可以定量1000種以上蛋白質，變異系數(shù)小于15%； 4) 編制蛋白質定量軟件，使譜圖鑒定率提高到50，定量準確性比Census軟件提高20%； 5) 發(fā)表SCI論文80篇以上，其中IF>8文章10篇，IF>5文章30篇；申請發(fā)明專利20項； 6) 培養(yǎng)杰青1-2人，博士30人，博士后10人；形成一支優(yōu)秀的定量蛋白質組新方法和相關技術的人才隊伍。 三、研究方案1. 總體學術思路、技術路線和可行性分析總體學術思路：本項目的總體學術思路如圖1所示。將針對蛋白質組研究前沿領域迫切需要解決的規(guī)模化蛋白質定量精確度和準確度差、分析通量和覆蓋率低等關鍵科學

10、問題，擬從樣品處理和分離材料、高精度和高準確度的相對定量、絕對定量方法和技術，以及集成化定量分析系統(tǒng)四個層面出發(fā)，側重發(fā)展可滿足蛋白質組定量分析需求的新材料、新技術、新方法和新系統(tǒng)，為推動我國蛋白質科學的發(fā)展提供重要技術支撐。圖1 項目總體學術思路技術途徑： 本項目將通過蛋白質組樣品處理和分離新材料、基于色譜-質譜的定量新技術、以及集成化定量分析平臺等3個層面的多種途徑實現(xiàn)總體學術思路。 1）高效低殘留的樣品處理和分離新材料：采用點擊化學、可逆加成斷裂鏈轉移聚合和原子轉移自由基聚合反應等方法，對樣品預處理材料進行表面修飾；采用自組裝、熱聚合、光聚合、溶膠凝膠法、凝膠法、融鹽法、分散聚合、沉淀聚

11、合和蒸餾沉淀聚合反應等方法，制備蛋白質分離材料；利用噬菌體展示抗體可變區(qū)片段文庫和適配體庫為配基，研制蛋白質均衡器。2）基于色譜-質譜的高精確度和高準確度的蛋白質定量新方法和新技術：采用體內終端氨基酸同位素標記、雙功能試劑/稀土金屬絡合物化學標記、流動相添加內標法、曲線擬合法、化學衍生技術、可信肽段預測方法、高階數(shù)據(jù)處理等技術，發(fā)展高精確度的蛋白質組相對定量新方法；采用化學合成內標肽技術、生物表達內標肽技術、穩(wěn)定同位素標記的氨基酸同位素稀釋法和質譜多反應監(jiān)測等技術，發(fā)展高準確度的蛋白質組絕對定量新方法。 3）高通量、自動化定量分析新系統(tǒng)：采用熱變性、化學變性、微透析技術、固定化酶反應器、固相標

12、記技術、緩沖液臵換技術、多維色譜分離、生物質譜鑒定等技術，構建集成化蛋白質組定量分析新系統(tǒng)；采用熒光標記、固相衍生、深紫外激光誘導熒光、量子點標記、細胞計數(shù)等技術，發(fā)展超高靈敏度的目標蛋白質群的定量分析新方法。 可行性分析：本項目設置的研究內容不僅是國家中長期規(guī)劃綱要規(guī)定的研究任務，而且是目前國際蛋白質組學研究領域的前沿和熱點問題。參加本項目的研究團隊由在十五和十一期間國內從事蛋白質組分離鑒定新技術新方法研究的優(yōu)勢單位組成。不僅在蛋白質定性分析方面具有很好的基礎，而且在規(guī)?；鞍踪|定量分析方面研究水平處于國際前沿水平。因此，完全有能力在蛋白質組定量新方法和相關技術領域取得重大突破。 在樣品處理

13、和分離材料方面，研制了新型親水性人工抗體材料，在去除高豐度蛋白質的同時，避免了因非特異性吸附引起的低豐度蛋白質丟失，可將血清中鑒定的蛋白質數(shù)目提高30%以上（Chem. Comm., 2011, 47, 3969-3971; unpublished data）；制備了多種新型聚合物復合納米材料，實現(xiàn)了低豐度蛋白質的富集效率達到3個數(shù)量級（Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3345-3349; Angew. Chem. Int. Ed., 2008, 47, 2646-2648; Anal. Chem., 2008, 80, 6758-6763），回收率達到80%

14、以上（Anal. Chem., 2009, 81, 503-508; Chem.-Eur. J., 2009, 15, 10158-10166; Chem.-Asian J., 2010, 5, 1185-1191)。在分離材料方面，研制了無機-有機雜化親水整體材料，在改善蛋白質分離效率同時，提高了蛋白質的回收率（Anal. Chem., 2010, 82, 5447-5454）。此外，還通過溶膠-凝膠法發(fā)展了一系列以金屬氧化物為基質的細粒徑分離微球（Chem. Comm., 2009, 20, 2929-2931），顯著改善了蛋白質的分離能力。 在蛋白質組相對和絕對定量新技術新方法方面，建立

15、了金屬-雙功能試劑-生物質譜方法、18O標記-雙功能試劑-生物質譜法、氘代酸酐標記-生物質譜法以及同系物酸酐標記-兩維凝膠電泳-生物質譜法等蛋白質相對定量新方法，并成功用于一氧化氮刺激的酵母蛋白質組變化研究、小鼠酒精脂肪肝蛋白質組研究，以及四氯化碳誘導肝損傷蛋白質組變化研究（Anal. Chem., 2006, 78, 6614-6621; Anal. Chem., 2007, 79, 7700-7707; Proteomics Clin. Appl., 2010, 4, 111）；將甲基化同位素標記技術與蛋白質分離技術相結合，提高了定量技術的整體通量，篩選出了501個在早期大腸癌和正常組織中

16、差異表達的蛋白質（J. Proteome Res., 2010, 9, 4701-4709）；利用串聯(lián)18O同位素標記進行人卵巢癌血清的糖蛋白質組定量研究，發(fā)現(xiàn)了56 個糖肽的糖基化程度發(fā)生了顯著改變（J. Proteome Res., 2010, 9, 227-236）；建立了基于穩(wěn)定同位素稀釋-多反應檢測質譜的目標蛋白質絕對定量和驗證方法，并將所建方法用于肝癌病人血漿中玻璃粘連蛋白和簇集蛋白的絕對定量分析，其結果與文獻報道結果一致相對標準偏差小于20（J. Proteome Res., 2010, 9, 3319-3327）。 在集成化蛋白質組分析平臺方面，實現(xiàn)了蛋白質在線變性、還原、酶解

17、、分離和鑒定的集成，將蛋白質組樣品處理時間從離線的20 h縮短到在線的7 min（Anal. Chem., 2009, 81, 6534-6540）；研制了集成化蛋白質富集、緩沖溶液交換和酶解裝臵，不僅可以顯著提高蛋白質組樣品的處理通量，而且可以避免多步離線操作而引起的蛋白質損失，蛋白質回收率達到80%以上（Anal. Chem., 2010, 82, 2574-2579）；發(fā)展了柱上標記技術，實現(xiàn)了肽段標記、分離和鑒定的集成化，提高了規(guī)模化蛋白質定量分析能力（Anal. Chem., 2010, 82, 3007-3015）。 此外，該研究團隊不僅擁有利用基于色譜-質譜聯(lián)用進行蛋白質定量的先

18、進設備，而且是一支年輕而又富有創(chuàng)新敬業(yè)精神的隊伍，主要研究骨干均為工作在第一線的青年人才。基于以上考慮，該團隊完全有條件和能力完成所確立的研究內容和任務，并取得一批具有自主知識產(chǎn)權的突破性和創(chuàng)新性研究成果。為推動我國蛋白質科學跨越式發(fā)展，并達到國際領先水平提供重要技術支撐。2. 創(chuàng)新點 1） 采用點擊化學、可逆加成斷裂鏈轉移聚合和原子轉移自由基聚合等可控反應策略，研制分辨率高、殘留低的樣品處理和分離材料，提高蛋白質組樣品的回收率和分辨率；通過發(fā)展基于新型配基庫的可降低蛋白質豐度分布范圍的均衡器技術，提高蛋白質組鑒定的覆蓋率； 2） 建立二級質譜特征肽段多對離子檢測、可信肽段實時監(jiān)測校正的非標記

19、定量方法，以及發(fā)展基于化學修飾的高穩(wěn)定質譜離子化以及金屬元素標記新技術，提高蛋白質組相對定量分析的精確度； 3） 采用蛋白質雙重生物代謝標記、固定化標記內標肽技術和智能化的多反應監(jiān)測質譜新方法，提高目標蛋白質組絕對定量分析的準確度； 4） 發(fā)展基于熒光標記、量子點標記的細胞計數(shù)與蛋白質定量相結合的新方法，提高目標蛋白質群定量的靈敏度； 5） 發(fā)展固相原位樣品處理技術，構建集成化定量蛋白質組分析系統(tǒng)，實現(xiàn)定量蛋白質組高通量的自動化分析。 3. 課題設置本項目針對現(xiàn)有規(guī)?；鞍踪|定量技術和方法存在的精確度和準確度差、覆蓋率和分析通量低等科學問題，發(fā)展蛋白質組定量新方法和相關技術。根據(jù)總體學術思路，

20、設臵四個課題。第一課題重點研制高效低殘留的蛋白質組樣品處理和分離新材料，解決蛋白質回收率和分離效率低的問題；第二課題重點發(fā)展基于色譜-質譜的蛋白質相對定量新技術新方法，解決規(guī)模化蛋白質定量分析精確度差的問題；第三課題重點發(fā)展基于色譜-質譜的蛋白質組絕對定量新技術新方法，解決規(guī)?；鞍踪|定量分析準確度差的問題；第四課題重點構建集成化蛋白質組定量分析系統(tǒng)，提高規(guī)模化蛋白質定量的分析通量、覆蓋率和自動化水平。四個課題之間緊密相關(見圖2) 。前三個課題重點發(fā)展新材料、新技術和新方法；課題四將對所發(fā)展的新材料、新技術和新方法進行集成，實現(xiàn)高精度的規(guī)?；鞍踪|定量分析。此外，將采用模式生物-酵母對上述發(fā)

21、展的定量新方法和相關技術體系進行評價，并示范性地開展腫瘤相關蛋白質的規(guī)?；糠治?。課題1 ： 高效低殘留的蛋白質樣品處理和分離新材料研究內容： 鑒于在蛋白質樣品處理方面存在因基質材料的非特異性吸附和“海綿效應”（蛋白質間非特異性相互作用）引起的蛋白質損失，以及蛋白質分離能力有限等諸多問題，本課題擬從以下三個方面開展研究，提高定量蛋白質組分析的回收率、覆蓋率和分辨率。 具體內容包括：1）新型蛋白質/多肽處理材料的功能化修飾：基于活性/可控聚合反應或點擊化學的修飾方法，在磁性材料表面鍵合親水性可控的聚合物鏈段，提高蛋白質組樣品在基于磁性材料的處理過程中的回收率。研制具有傳質速度快、背壓小等優(yōu)點的

22、新型整體材料，實現(xiàn)蛋白質組樣品的在線處理。研制表面性能可控、孔徑可調的新型介孔材料和多孔材料，實現(xiàn)基于體積排阻機理的蛋白質和多肽的分離。2）降低蛋白質豐度范圍的均衡技術：通過制備親水性冷凝膠基質材料和親水性磁性顆?；|材料，降低蛋白質在基質材料表面的非特異性吸附；基于生物分子間特異性相互作用，分別選擇M13噬菌體展示抗體可變區(qū)片段文庫和隨機寡核苷酸庫作為配基，并將其鍵合到親水性基質材料上，實現(xiàn)配基庫的高效、高容量固載；優(yōu)化樣品上樣和洗脫條件，在去除多種（含未知）高豐度蛋白質的同時，實現(xiàn)低豐度蛋白質的富集；通過降低蛋白質的豐度分布范圍，提高蛋白質組定量的覆蓋率。3）新型高效蛋白質分離材料的研制：

23、分別基于點擊化學、可逆加成斷裂鏈轉移聚合和原子轉移自由基聚合反應等方法，在已有大孔硅膠微球或聚合物微球表面進行功能基團和親水基團的可控修飾，制備新型蛋白質分離微球，提高蛋白質分離的分辨率和回收率。采取不同方法（熱聚合、光聚合、溶膠凝膠法）制備適于蛋白質分離的聚合物整體材料、硅膠整體材料和有機-無機雜化整體材料，并在此基礎上，研制可實現(xiàn)理化性質差異顯著的蛋白質分離的高效、低殘留的超長超細內徑毛細管整體柱。采用凝膠法、融鹽法、分散聚合、沉淀聚合或蒸餾沉淀聚合法，制備超細粒徑微球材料，并通過修飾功能基團和親水基團，實現(xiàn)蛋白質的高效、低殘留分離。預期目標： 1）通過對樣品處理材料進行表面化學修飾，有效

24、降低基質的非特異性吸附，提高蛋白質和多肽的回收率；2）通過發(fā)展可顯著降低蛋白質組豐度分布范圍的均衡技術，提高蛋白質組鑒定的覆蓋率；3）通過研制新型分離材料，提高蛋白質分離的分辨率和回收率。承擔單位： 中國科學院大連化學物理研究所、南開大學課題負責人： 楊開廣經(jīng)費比例： 22%課題2 ： 基于色譜-質譜的蛋白質組相對定量新方法和新技術研究內容：針對規(guī)?；鞍踪|相對定量中標記反應效率低、非標記方法重復性差以及定量軟件效能低等科學問題，本課題擬開展三個方面的研究，提高相對定量方法的精確度、準確度以及覆蓋率。 具體內容包括：1）標記相對定量新方法和新技術：通過復合納米材料對低豐度蛋白質高效率、高回收率

25、富集和體內終端氨基酸標記（IVATL）二級質譜定量技術的結合，實現(xiàn)復雜生物體系中低豐度蛋白質的定量分析。采用硼酸修飾納米材料富集糖基化修飾肽段，對非糖肽進行標記（如iTRAQ），并根據(jù)其同位素峰強度的差異對糖蛋白進行定量；再對糖基化位點進行18O標記，并根據(jù)糖肽同位素峰強度的差異對其糖基化程度進行定量分析。發(fā)展基于非同位素雙功能試劑/稀土金屬絡合物化學標記的蛋白質組相對定量新方法。2）非記相對定量新方法和新技術：通過引入信噪比、正確的質荷比和同位素峰分布等參數(shù)濾去噪音信息，提高肽段質譜峰預測的準確性；在此基礎上，通過“可信肽段預測”，即根據(jù)可信肽段鑒定結果來預測該肽段在液相色譜柱中的洗脫時間，

26、并結合母離子的m/z值來定位該肽段在其他液質聯(lián)用循環(huán)中的信號，提高鑒定到的肽段的非標記定量的準確性。通過在流動相中加入設計和優(yōu)化的內標肽，實時監(jiān)測質譜電噴霧的狀況，并發(fā)展合適的算法對獲取的數(shù)據(jù)進行歸一化，實現(xiàn)對質譜信號的實時地校正，從而提高無標定量分析的重現(xiàn)性。通過發(fā)展高穩(wěn)定的離子化技術，提高肽段的質譜響應，進而確保蛋白質組的精確性和準確性3）關鍵計算問題研究與軟件系統(tǒng)開發(fā)：充分發(fā)揮色譜-質譜聯(lián)用數(shù)據(jù)與高階數(shù)據(jù)處理技術相互結合的優(yōu)勢，用高階校正方法同時改善蛋白質組質譜定性色譜定量的數(shù)據(jù)處理效果；根據(jù)色譜質譜數(shù)據(jù)的特點，開發(fā)與之相適應的高階張量分解算法，提高蛋白質組定量數(shù)據(jù)處理的速度和效率。對原

27、始質譜數(shù)據(jù)中的一級與二級譜圖信息進行整合分析，盡可能去除由于儀器引入的誤差與干擾，提高質譜信息的可利用率；對定性和定量分析結果進行嚴格、準確地評價與過濾，盡可能排除假陽和假陰性結果；開發(fā)支持新型標記和非標記定量策略的算法庫，以及通量大、可靠性好、擴展性強和易于操作的具有完全自主知識產(chǎn)權的定量蛋白質組學數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)。預期目標：1）通過建立規(guī)?；鞍踪|標記相對定量新方法，提高定量的精確度、準確度和覆蓋率； 2）通過發(fā)展規(guī)?；鞍踪|非標記相對定量新方法，提高定量的精確度和準確度； 3）通過發(fā)展定量數(shù)據(jù)解析算法，提高對不同豐度蛋白質的定量分析能力、質譜定量信息的可利用率和蛋白質定量計算的準確度。承擔單

28、位： 復旦大學、中國科學院計算技術研究所課題負責人： 陸豪杰經(jīng)費比例： 24%課題3 ： 基于色譜-質譜的蛋白質組絕對定量新方法和新技術研究內容： 針對絕對定量蛋白質組學中存在的規(guī)?；瘍葮穗闹苽淅щy、標記反應效率低、規(guī)?；喾磻O(jiān)測難以實現(xiàn)和非標記方法重復性差等科學問題，本課題擬開展三個方面的研究，提高絕對定量方法的準確度、通量和精確度。具體內容包括：1）內標肽的設計、合成和表征：針對需要定量的蛋白質組樣品，根據(jù)文獻報道和已有蛋白質表達譜數(shù)據(jù)庫，考察其色譜行為和質譜特性，選擇每種蛋白質的特征肽段；設計化學合成或生物表達內標肽技術路線，制備內標肽；建立對其進行色譜純化的方法，以及基于標準氨基酸、

29、穩(wěn)定同位素標記的氨基酸同位素稀釋法結合選擇性反應檢測質譜等對其含量進行準確表征的方法，進而確定內標肽的準確含量，并制備出內標肽，為目標蛋白質組絕對定量提供參考物質。2）蛋白質組絕對定量標記新方法：發(fā)展蛋白質的生物雙重標記、固相標記和金屬元素標記等蛋白質多重標記技術以及色譜保留時間與多反應監(jiān)測質譜結合的目標蛋白質組絕對定量方法，提高目標蛋白質組準確定量的通量，實現(xiàn)目標蛋白質組的動態(tài)監(jiān)測和絕對定量分析。3）非標記規(guī)模化蛋白質組絕對定量新方法：對生物樣本中蛋白質組的酶切混合物進行高精度的液質聯(lián)用分析，然后對獲取的質譜圖計數(shù)歸一化處理，獲得絕對定量結果；在不同動態(tài)范圍選擇至少五種蛋白質，對這些蛋白質進

30、行多反應監(jiān)測質譜準確定量；通過相應蛋白質的非標定量與準確定量結果的相關系數(shù)對其他非標定量結果進行校正；通過發(fā)展絕對定量數(shù)據(jù)提取和處理方法，提高復雜生物樣本中蛋白質組絕對定量的準確度。預期目標：1）通過建立內標肽的設計、合成和表征方法，為蛋白質組的準確絕對定量提供參考物質； 2）通過建立蛋白質組標記以及色譜保留時間與多反應監(jiān)測質譜結合的蛋白質組絕對定量方法，實現(xiàn)蛋白質組的動態(tài)監(jiān)測和絕對定量分析； 3）通過建立非標記規(guī)?；鞍踪|組絕對定量新方法，同時發(fā)展絕對定量數(shù)據(jù)提取和處理方法，提高復雜生物樣本中蛋白質組絕對定量的準確度。承擔單位： 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所、北京理工大學

31、 課題負責人： 張養(yǎng)軍經(jīng)費比例： 24%課題4 ： 集成化蛋白質組定量分析系統(tǒng) 研究內容： 針對蛋白質組樣品處理、分離和定量分析費時、費力、樣品易污染、易丟失等科學問題，本課題擬發(fā)展蛋白質定量樣品處理新裝臵、自動化標記新技術，構建集成化定量蛋白質組分析系統(tǒng)，提高規(guī)模化蛋白質定量的通量和自動化水平。具體內容包括：1） 在線樣品處理裝置：設計蛋白質在線變性、還原和烷基化裝臵，研制緩沖溶液交換接口，制備高效低殘留固定化酶反應器，并通過上述部件的集成，研制在線蛋白質組樣品處理裝臵，實現(xiàn)蛋白質組的高效、高通量和低損失率處理。2） 原位固相標記系統(tǒng)：制備性能穩(wěn)定、背壓低、上樣量大的通用性或選擇型蛋白質或多

32、肽捕集柱，并以此為反應器，通過在固相介質上連續(xù)引入標記試劑，實現(xiàn)全蛋白質組或目標蛋白質組的固相原位標記。將在線標記系統(tǒng)與分離鑒定系統(tǒng)聯(lián)用，實現(xiàn)樣品標記、色譜分離和質譜鑒定的全自動分析，提高規(guī)?；鞍踪|定量分析的精確度和分析通量。3） 集成化蛋白質定量分析系統(tǒng)構建：通過將研制的新材料、新方法、新技術和新系統(tǒng)在線集成，構建適于細胞、組織或體液定量分析的高精度蛋白質定量集成化分析系統(tǒng)，實現(xiàn)蛋白質組樣品的高分辨、高精度、高準確度、高通量和深度覆蓋定量分析。4）超高靈敏度蛋白質定量分析方法和系統(tǒng)：構建基于多維色譜的蛋白質分離平臺，并利用疾病標識蛋白質在多維色譜分離中進行色譜峰定位；利用固相衍生和激光誘導

33、熒光檢測聯(lián)用技術制作目標蛋白的定量標準曲線。利用上述色譜峰定位和定量標準曲線的結合，實現(xiàn)疾病樣品中目標低豐度蛋白質的高靈敏度定量，并利用質譜進行鑒定和結果驗證。預期目標： 1）通過研制蛋白質組在線樣品處理裝臵，實現(xiàn)蛋白質組的高效、高通量和低損失率處理； 2）通過發(fā)展蛋白質組在線標記系統(tǒng)，提高蛋白質或肽段的標記通量； 3）通過構建集成化定量蛋白質組分析系統(tǒng)，并制定標準化操作流程，提高蛋白質組定量分析的精確度、準確度、通量和覆蓋率。承擔單位： 中國科學院大連化學物理研究所、復旦大學 課題負責人： 張麗華經(jīng)費比例： 30% 四、年度計劃研究內容預期目標第一年1. 通過對磁性材料的表面修飾，研制低殘留

34、樣品處理磁性材料；探索超細粒徑微球的制備方法，用于多肽的高效分離方法；2. 研究基于細胞培養(yǎng)代謝標記結合二級質譜定量策略、二級質譜定量過程中譜圖識別和分析新方法、基于串聯(lián)18O標記的定量新技術，以及多種標記和18O標記技術進行串聯(lián)組合定量策略；3. 發(fā)展化學和生物合成標準肽段方法、內標肽的色譜純化和儲存方法，以及色譜和質譜純度表征方法，以及基于標準氨基酸、穩(wěn)定同位素標記的氨基酸同位素稀釋法結合選擇性反應檢測質譜的含量測定方法；4. 研制蛋白質樣品的傳輸載體膜材料、熱變性裝置、緩沖液置換接口和低殘留固定化酶反應器；1. 研制2-3種低殘留的樣品預處理磁性材料和1-2種多肽高效分離填料；2. 建立

35、并標準化細胞培養(yǎng)代謝標記結合二級質譜定量的新方法和串聯(lián)18O標記的定量新技術；發(fā)展1種基于二級質譜定量的新算法；3. 建立2種內標肽的設計合成方法、1種內標肽儲存方法、1種內標肽色譜純化方法和2種純度表征方法，以及1種內標肽含量測定方法；4. 提供1種低殘留的蛋白質傳質膜材料；研制1種緩沖液置換接口，使緩沖液置換效率達到90%以上；制備2-3種低殘留固定化酶反應器，酶解時間小于2 min；5. 發(fā)表SCI收錄文章8篇，申請發(fā)明專利3項；第二年1. 研制新型聚合物整體材料、硅膠整體材料和無機-有機雜化整體材料；2. 研究納米材料富集和細胞培養(yǎng)代謝標記和二級質譜定量相結合的高精度定量技術、硼酸修飾

36、納米材料富集糖基化修飾肽段和串聯(lián)18O標記定量相結合的糖蛋白質定量技術，以及MRM結合可信肽段預測技術的低豐度目標蛋白質的定量技術；3. 發(fā)展固定化酶反應器的制備技術；建立磁球固定化酶18O酶促標記結合色譜保留時間依賴的智能化多反應檢測質譜方法；將所建方法用于實際生物樣本中目標蛋白質組的分析，對方法進行優(yōu)化，建立高通量、低成本的蛋白質絕對定量新方法。4. 優(yōu)化各級樣品處理的條件，構建集成化蛋白質組在線樣品預處理裝置；研制通用性在線固相標記系統(tǒng)；構建基于多維色譜的蛋白質分離平臺；1. 提供2-3種高效低殘留的樣品處理和分離整體柱；2. 實現(xiàn)1-2種復雜生物體系中低豐度蛋白質的定量分析、1-2種重

37、大疾病相關的組織/細胞中糖基化蛋白質的蛋白質水平和糖基化程度水平的同時定量以及幾個低豐度目標蛋白質的高靈敏度、高準確度定量；3. 發(fā)展兩種固定化酶技術；建立一種固定化酶18O酶促的蛋白質組標記以及色譜保留時間與多反應監(jiān)測質譜結合對蛋白質組進行絕對定量的方法，實現(xiàn)目標蛋白質組和關鍵蛋白質的動態(tài)監(jiān)測和絕對定量分析，并使絕對定量方法的誤差小于10%；4. 在30 min內實現(xiàn)蛋白質組高效、快速、低損耗的在線變性、還原和酶解，并形成標準操作流程；制備2-3種通用型蛋白質或多肽捕集柱，并以此為反應器，在15 min內實現(xiàn)全蛋白質組的固相原位標記，標記效率達到90%；構建1-2種多維色譜蛋白質分離技術平臺

38、，實現(xiàn)蛋白質組樣品的高效、快速分離；5. 發(fā)表SCI收錄文章19篇，申請發(fā)明專利4項；第三年1. 通過聚合物自組裝技術，制備親水的介孔/多孔聚合物材料；研制適于生物分子固載的親水冷凝膠整體材料；2. 研究非同位素化學標記試劑及其用于蛋白質組相對定量新方法、支持新型化學標記試劑的標記定量策略的算法，以及化學衍生等高穩(wěn)定的離子化技術；3. 建立雙功能試劑的選擇、改性方法，以及非同位素標記結合質譜分析的目標蛋白質絕對定量新方法；將所建方法用于實際生物樣本的分析；4. 研制選擇性在線固相標記系統(tǒng)；發(fā)展在線標記與分離鑒定系統(tǒng)的聯(lián)用方法；發(fā)展固相衍生和激光誘導熒光檢測聯(lián)用技術；1. 提供1-2種低殘留的樣品處理聚合物材料和1種蛋白質均衡器基質材料；2. 篩選到1-2種合適的化學標記試劑，并建立蛋白質組相對定量的新方法；發(fā)展1-2種適于新型化學標記定量的新算法，以及1種提高肽段的質譜響應的新技術，為提高低豐度肽段定量穩(wěn)