淀粉酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

1、 本科學生綜合性實驗報告學號 084120402 姓名 茶金梅 學院 生命科學 專業(yè)、班級 08生技 實驗課程名稱 酶工程實驗 教師及職稱 李俊俊 開課學期 2010 至 2011 學年 上 學期 填報時間 2011 年 12 月 29 日云南師范大學教務處編印一實驗設計方案實驗序號三實驗名稱淀粉酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵條件優(yōu)化實驗時間2010年12月實驗室生物基礎21 實驗目的了解酶制劑生產(chǎn)過程中實驗室發(fā)酵條件優(yōu)化的基本方法。2 實驗原理、實驗流程或裝置示意圖2.1 實驗原理 用微生物生產(chǎn)酶制劑受以下制約：培養(yǎng)基成分、物理條件。 為了得到最佳產(chǎn)酶量，必須對這些因素進行優(yōu)化，并通過單因子分析、正交試驗找

2、出最適合的發(fā)酵工藝條件。 碳、氮源是組成微生物細胞蛋白質(zhì)、酶和核酸的主要元素之一，是影響酶產(chǎn)量的兩個重要因素。 -淀粉酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵是好氧過程，因而發(fā)酵液中的溶氧濃度是發(fā)酵過程中的一個需要調(diào)節(jié)的重要參數(shù)。 接種量大小是決定菌體在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長速度的一個重要因素，選擇適當?shù)慕臃N量是必要的。 pH是決定菌體在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長速度的一個重要因素，因此最適pH的選擇就顯得格外重要。 發(fā)酵時間的長短決定了反應是否能完全發(fā)生，因此發(fā)酵時間也是發(fā)酵過程中的一個需要調(diào)節(jié)的重要參數(shù)。 正交試驗：用正交表來安排實驗分析和實驗結果。 正交試驗設計一般來說包括兩部分:試驗設計，也即方案的選擇與確定； 數(shù)據(jù)處理，進行

3、統(tǒng)計推斷。 正交試驗設計的基本步驟：第一步，確定目標、選定因素（包括交互作用）、確定水平；第二步，選用合適的正交表；第三步， 按選定的正交表設計表頭，確定試驗方案；第四步，組織實施試驗；第五步，試驗結果分析。 正交試驗的結果分析：極差分析、方差分析。方差分析：將總的離差平方和分解成各因素及各交互作用的離差平方和，構造F統(tǒng)計量，對各因素是否對試驗指標具有顯著影響，作F檢驗。 確定最優(yōu)方案 如果不考慮交互作用，則根據(jù)各因素在各水平下的總產(chǎn)量或平均產(chǎn)量的高低確定最優(yōu)方案；如果考慮交互作用，則取各種搭配下產(chǎn)量的平均數(shù)，按優(yōu)化標準確定最優(yōu)方案。2.2 實驗流程配制種子培養(yǎng)基 接種 搖瓶發(fā)酵 測酶活 配制

4、發(fā)酵培養(yǎng)基確定最佳方案 分析實驗結果3實驗設備及材料3.1設備250mL三角瓶、 移液管、大試管、培養(yǎng)皿、電子天平、超凈工作臺、培養(yǎng)箱、恒溫調(diào)速搖瓶柜、離心機（離心管）、恒溫水浴鍋、分光光度計、比色皿、記時器、電冰箱、3.2 試劑蛋白胨、酵母膏、NaCl、葡萄糖、NH4NO3、KH2PO4、 MgCl2·6H2O、 CaCl2·2H2O4實驗方法步驟及注意事項4.1 試驗方法步驟4.1.1 種子培養(yǎng)基的配制蛋白胨 1.0%酵母膏 1.0g% pH5.5NaCl 0.5%將菌種接種到裝有種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶內(nèi)，于37，200rpm，培養(yǎng)16h。4.1.2 單因子分析4

5、.1.2.1 碳源濃度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響在六只250ml三角瓶中，依次加入0.35g（0.5%）、0.70 g（1.0%）、1.05 g（1.5%）、1.40 g（2.0%）、1.75 g（2.5%）、2.10 g（3.0%）葡萄糖，然后在六只三角瓶中都加入0.7 g NH4NO3、0.07g KH2PO4、0.035 g MgCl2·6H2O、 0.007 g CaCl2·2H2O和70ml蒸餾水，攪拌溶解，調(diào)pH至6.0，高壓滅菌，冷卻后各接入11.2ml（16%）的種子培養(yǎng)基，相同培養(yǎng)條件下（37，72h，200rpm）搖瓶發(fā)酵，測定酶活。4.1.2.2 氮源濃度對發(fā)酵

6、產(chǎn)酶的影響在六只250ml三角瓶中，依次加入0.35g（0.5%）、0.70 g（1.0%）、1.05 g（1.5%）、1.40 g（2.0%）、1.75 g（2.5%）、2.10 g（3.0%）NH4NO3，然后在六只三角瓶中均加入1.4g葡萄糖、0.07g KH2PO4、0.035 g MgCl2·6H2O、 0.007 g CaCl2·2H2O和70ml蒸餾水，攪拌溶解，調(diào)pH至6.0，高壓滅菌，冷卻后各接入11.2ml（16%）的種子培養(yǎng)基，相同培養(yǎng)條件下（37，72h，200rpm）搖瓶發(fā)酵，測定酶活。4.1.2.3 培養(yǎng)基pH對產(chǎn)酶的影響在七只三角瓶中各加入1.

7、4g葡萄糖、0.7g NH4NO3、0.07g KH2PO4、0.035 g MgCl2·6H2O、 0.007 g CaCl2·2H2O和70ml蒸餾水，攪拌溶解，pH依次調(diào)至3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0和6.5，高壓滅菌，冷卻后各接入11.2ml（16%）的種子培養(yǎng)基，相同培養(yǎng)條件下（37，72h，200rpm）搖瓶發(fā)酵，測定酶活。4.1.2.4 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響在六只三角瓶中各加入1.4g葡萄糖、0.7g NH4NO3、0.07g KH2PO4、0.035 g MgCl2·6H2O、 0.007 g CaCl2·2H2O和70

8、ml蒸餾水，攪拌溶解，調(diào)pH至6.0，高壓滅菌，冷卻后各接入11.2ml（16%）的種子培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵（37， 200rpm）48h、60h、72h、84h、96h、108h，測定酶活。4.1.3 酶活的測定 稀釋酶液4.1.3.2 操作步驟空白管樣品管A樣品管B步驟1吸取1.8mL淀粉底物溶液吸取1.8mL淀粉底物溶液吸取1.8mL淀粉底物溶液步驟250保溫5分鐘50保溫5分鐘50保溫5分鐘步驟3加入待測酶液0.2毫升加入待測酶液0.2毫升步驟450精確保溫10min50精確保溫10min50精確保溫10min步驟5加入3mLDNS試劑終止反應加入3mLDNS試劑終止反應加入3mLDNS試

9、劑終止反應步驟6混合均勻混合均勻混合均勻步驟7加入0.2毫升待測酶液，沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸5min步驟8流水冷卻流水冷卻流水冷卻步驟9加蒸餾水10mL，混勻加蒸餾水10mL，混勻加蒸餾水10mL，混勻步驟10OD540nm比色OD540nm比色OD540nm比色4.1.4 正交試驗因素4.1.4.1 根據(jù)碳源濃度、氮源濃度、pH、接種量對酶活性的影響，每個因素選取三個水平（水平即在因素的允許變化范圍內(nèi)，要進行試驗的“ 點 ”）進行正交試驗。水平 A碳源濃度B氮源濃度C接種量D pH1最優(yōu)0.5%最優(yōu)0.5%最優(yōu)2%最優(yōu)0.52最優(yōu)最優(yōu)最優(yōu)最優(yōu)3最優(yōu)+0.5%最優(yōu)+0.

10、5%最優(yōu)+2%最優(yōu)+0.54.1.4.2 按照正交表L9 表（L是正交表的代號，L右下角的數(shù)字表示試驗次數(shù)）進行試驗。 試驗號ABCD1111121222313334212352231623127313283213933214.1.4.3 進行方差分析4.1.4.4 得出最佳方案4.2 注意事項 滅菌鍋使用時，先檢查是否有水，再接通電源。 試管上編號：貼上用圓珠筆寫上編號的膠布，以防止保溫或沸水加熱時脫落。 移液槍的使用：向試管內(nèi)加入待測酶液或DNS時，槍頭不要觸碰管壁，也不要伸入液面下，連續(xù)吸取同一種溶液時可以不用更換槍頭，實驗結束后要及時清洗槍頭。 精確記時：每一管加入酶液的時間要做記錄，

11、每管之間間隔的時間要合理。 煮沸和用流水沖洗時要避免試管進水。 接種時要保證在無菌環(huán)境下操作。 分光光度計使用時應提前半小時接通電源，打開機器開關使儀器通電，自檢。 測酶活時，將對照液及測定液分別裝入比色杯3/4體積并用鏡頭紙擦干外壁，放入樣品室。 讀數(shù)完畢，打開儀器蓋板，關閉開關，將比色杯沖洗干凈、浸泡于30酒精中。 水浴鍋中的水量要超過試管中的液面。 接種后應振蕩接種瓶，使菌種充分與培養(yǎng)基混合。 正交試驗設計時，確定因素應根據(jù)試驗目的，選取主要因素，略去次要因素；確定因素的水平時，應盡可能的保持各因素的水平數(shù)相同，以方便試驗數(shù)據(jù)的處理。5實驗數(shù)據(jù)處理方法5.1 酶活的計算酶活=(0.951

12、1x+0.0493)×1000×nt×V×M（其中，0.9511x+0.0493：葡萄糖的標準曲線方程；x：OD值；n：稀釋倍數(shù)；t：反應時間；V：酶液的體積；M：葡萄糖的分子量）5.2 正交試驗結果的分析 利用SPSS對正交試驗結果進行方差分析，得出實驗的最佳方案。6參考文獻1 余龍江發(fā)酵工程原理與技術應用北京：化學工業(yè)出版社，2006 2 陳守文酶工程北京：科學出版社，20083 安戈等.1株酸性-淀粉酶產(chǎn)生軍的鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化.安徽農(nóng)業(yè)科學，20094 劉建軍,姜魯燕. 根霉PE-8菌株的選育及其淀粉降解酶類的研究 1998(02) 5 孫君社.

13、酶與酶工程及其應用.北京：化學工業(yè)出版社.20066 李春喜等.生物統(tǒng)計學（第四版）.北京：科學版社.2008二實驗報告1實驗現(xiàn)象與結果1.1 實驗現(xiàn)象 發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后顏色會發(fā)生變化，由原來的白色變?yōu)榱咙S色。 搖瓶培養(yǎng)后，三角瓶中溶液的上方會出現(xiàn)一圈沉淀物。 沸水煮沸5min后，溶液的顏色加深，并且空白管中溶液的顏色比其余兩管的要淺一些。 做正交試驗時，搖瓶培養(yǎng)后三角瓶中出現(xiàn)了一些球狀物。1.2 實驗結果1.2.1 碳源（葡萄糖）濃度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響碳源濃度（%）0.51.01.52.02.53.0A管的OD值1.1521.5151.7251.9873.7642.931B管的OD值1.23

14、41.4961.6562.0013.9882.656平均值1.1931.50551.69051.9943.8762.7935酶活32.88841.14446.03254.050103.77173.8031.2.2 氮源（NH4NO3）濃度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響N源濃度(%)0.511.52.02.53.0A管的OD值0.042-0.057-0.0940.0320.0550.004B管的OD值0.043-0.023-0.0200.0510.0570.005平均值0.043-0.040-0.0570.0420.0560.0045酶活5.010004.9585.6982.9771.2.3 培養(yǎng)基pH對產(chǎn)酶

15、的影響pH3.54.04.55.05.56.06.5A管的OD值0.019-0.0110.0231.2471.7521.3791.083B管的OD值0.013-0.0110.0211.4411.6801.3911.291平均值0.016-0.0110.0221.3441.7161.3851.187酶活1.79201.95136.87746.70537.96032.7291.2.4 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響發(fā)酵時間（h）4860728496108A管的OD值0.1131.5001.5230.1490.1910.135B管的OD值0.1151.6211.6300.1580.1940.178平均值0.1

16、141.4461.5770.1540.1950.157酶活4.38139.57243.0335.4386.5215.5171.2.5 正交試驗1.2.5.1 各個因素選取的三個水平水平A碳源濃度（%）B氮源濃度（%）C接種量（ml） D pH12.02.0145.022.52.5165.533.03.0186.0 正交試驗的結果1號試驗結果編號 試管AB平均值總體均值12.1972.1022.1502.10422.1642.1482.15631.9892.0232.0062號試驗結果編號 試管AB平均值總平均值12.1652.2642.2152.14422.1122.1512.13232.04

17、12.1312.0863號試驗結果編號 試管AB平均值總平均值10.1830.1810.1820.17920.1720.1760.17430.1770.1820.1804號試驗結果編號 試管AB平均值總平均值12.0181.09321.03331.0935號試驗結果編號 試管AB平均值總平均值10.3021.16820.84930.1686號試驗結果編號 試管AB平均值總平均值11.3151.2951.3051.28721.2741.301.28731.2921.2811.2877號試驗結果編號 試管AB平均值總平均值11.0761.0751.0761.07321.0671.0691.0683

18、1.0721.0811.0778號試驗結果編號 試管AB平均值總平均值11.8791.80821.74631.7999號試驗結果編號 試管AB平均值總平均值11.9652.0161.9911.98121.8972.1142.00631.9971.8961.947正交表試驗號 OD平均值酶活（U/min.ml）酶活平均值（U/min.ml）12.15058.17156.9562.15658.3302.00654.36722.21559.88958.0222.13257.6962.08656.48030.1826.1786.0900.1745.9660.1806.12542.01854.68437

19、.8641.03328.6611.09330.24650.3029.34812.9850.84923.8000.1685.80861.30535.84735.5301.28735.3711.28735.37171.07629.79929.7361.06829.5851.07729.82381.87951.01249.1291.74647.4781.79948.89891.99153.97153.7152.00654.3671.94752.8081.2.3.2 正交方差分析結果SPSS分析結果整理如下：方差來源平方和自由度方差F顯著性A1156.8162578.40816.494極顯著B496.

20、1662248.0837.074極顯著C6278.34623139.17389.516極顯著D615.7362307.8688.779極顯著誤差631.2271835.068總和9178.291272對實驗現(xiàn)象、實驗結果的分析及其結論2.1 對實驗現(xiàn)象的分析 由于發(fā)酵培養(yǎng)基的成分在滅菌的過程中會發(fā)生變化，因此培養(yǎng)基的顏色滅菌前后會有一定的變化。搖瓶培養(yǎng)后，三角瓶中溶液的上方有一圈沉淀物，說明已經(jīng)發(fā)生了酶促反應，培養(yǎng)基中已有淀粉酶的存在了。沸水浴會使酶失活，而樣品管中的酶液與底物在這之前已發(fā)生了反應，而空白管中的底物還來不及反應就已失活，故空白管中溶液的顏色要比樣品管中溶液的顏色淺。搖瓶培養(yǎng)后三

21、角瓶中出現(xiàn)了一些球狀物，說明培養(yǎng)基已被污染。2.2 對實驗結果的分析2.2.1 碳源濃度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響當碳源濃度為2.5%時，淀粉酶的活性最高。2.2.2 氮源濃度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響當?shù)礉舛葹?.5%時，淀粉酶的活性最高。2.2.3 培養(yǎng)基pH對產(chǎn)酶的影響當pH為5.5時，淀粉酶的活性最高。2.2.4 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響當發(fā)酵時間為為72h時，淀粉酶的活性最高。2.2.5 正交試驗結果分析當碳源濃度為2.0%、氮源濃度為2.5%、接種量為16ml、pH為5.5時，淀粉酶的活性最高。2.2.6 方差分析碳源濃度、氮源濃度、接種量、pH對酶活的影響都達到了極顯著的水平。2.3 結論：淀粉酶發(fā)酵條件的最優(yōu)組合：碳源濃度為2.0%、氮源濃度為2.5%、接種量為16ml、pH為5.5。2 實驗總結3.1 本次試驗的成功之處及其原因分析 本次實