利用TRIzol - 試劑和液氮提取大鼠胰腺高質(zhì)量總RNA-

1、第30卷第 5期 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào) (醫(yī)學(xué)版 Vol. 30 No. 5 2009年 10月Journal of Xipan Jiaotong University (Medical Sciences Oct. 2009 利用 TRIzol ó試劑和液氮提取大鼠胰腺高質(zhì)量總 RNA 李冬民 1,2 ,任吳超 1,2 ,王璇 1,2 ,王飛苗 1,2 ,高玉 1,2 , 韓燕 1,2 ,寧啟蘭 1,2 ,宋天保 1,3 ,呂社民 1 ,2 (西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 :1.環(huán)境與疾病相關(guān)基因教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ;2.遺傳學(xué)與分子生物學(xué)系 ; 3.人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系 ,陜西西安 71006

2、1 摘要 :目的建立胰腺高質(zhì)量總 RNA快速、經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定的提取方法。方法應(yīng)用 TRIzol ó試劑和液氮提取大鼠胰腺總 RNA ,通過(guò)總 RNA含量和 A260/ 280比值的測(cè)定及 10 g/L非變性瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估總 RNA的質(zhì)量 ,并用 RT2PCR檢 測(cè)大鼠胰島素 1、胰高血糖素、胰2淀粉酶和 2actin的表達(dá)。結(jié)果利用 TRIzol ó和液氮提取的大鼠胰腺總 RNA量 可達(dá)到 36g/ mg胰腺組織 ,A260/ 280比值在 1. 751. 89之間。在 10 g/L非變性瓊脂糖凝膠電泳時(shí) ,均可見 28S及 18S條帶 ,并且在 28S、18S條帶間可見明

3、顯的云霧狀陰影。大鼠胰島素 1、胰高血糖素、胰2淀粉酶、 2actin RT2PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示均有清晰的條帶。結(jié)論應(yīng)用 TRIzol ó試劑和液氮成功地提取了大鼠胰腺高質(zhì)量的總 RNA ,后者 可用于 RT2PCR研究。 關(guān)鍵詞 :大鼠胰腺 ;總 RNA提取 ; TRIzol ó試劑 ;液氮 中圖分類號(hào) :Q813文獻(xiàn)標(biāo)志碼 :A文章編號(hào) :167128259 (2009 0520639204 , REN Wu2chao1 ,2 , WAN G Xuan1 ,2 , WAN G Fei2miao1,2 HAN Yan1,2 , NINGQi2lan1 ,2 , SO

4、N G Tian2bao1 ,3 (1. Key Laboratory of Environment and Genes Related to Diseases , Ministry of Education of China/ A method with TRIzol ó reagent and liquid nitrogen to extract high2quality RNA from rat pancreas LI Dong2min1,2 , GAO Yu1,2 , ,L B She2min1 ,2 Medical School of Xipan Jiaotong Univ

5、ersity , Xipan 710061 ; 2. Department of Genetics and Molecular Biology , Medical School of Xipan Jiaotong University , Xipan710061;3. Departmentof HumanAnatomy, Histology and Embryology , Medical School of Xipan Jiaotong University , Xipan 710061 , China ABSTRACT : ObjectiveTo establish a quick , e

6、conomical and reproducible method for high2quality RNA extraction from pancreas. MethodsWe utilized TRIzol ó Reagent and liquid nitrogen to isolate total RNA from the rat pancreas. The RNA quality was determined by detection of its content and optic density ( A at 260/ 280 nm , and electrophore

7、sis in 1 % non2denatured agarose gel. Then reverse transcription2polymerase chain reaction (RT2 PCR was performed to detect expression of the pancreas2specific genes. ResultsThe content of th 鼠胰腺中表達(dá)的 4個(gè)基因的引物序列和擴(kuò)增片段大小 大困難。我們經(jīng)過(guò)反復(fù) 試驗(yàn) ,利用 TRIzol ó試劑和液 氮從大鼠胰腺組織中成功提取完整的 RNA ,可用于 RT2PCR、Northern blott

8、ing、差異顯示、抑制性消減 雜交及芯片等的研究。 1材料與方法 1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí) E3雌性大鼠 4只 ,體重 220250 g,由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 1. 2主要試劑及儀器 TRIzol ó試劑 ( Invitrogen公 司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒 RevertaidTM First Strand cDNA Synthesis ( Fermentas公司 ; T aq DNA polymerase ( Ta KaRa公司 。蛋白核酸定量?jī)x CE2321 (GENEGUEST ;凝膠成像系統(tǒng) (SYNGENE ;PCR 熱循環(huán)儀 P TC2200 (BIO2RAD

9、。用 PrimerPrimier 5. 0設(shè)計(jì) PCR引物 ,并由上海桑尼生物科技有限公 司合成 ,引物序列見表 1。 2AGCAAGCA GGTCATTGTTCC23 2T T GCGGGTCCTCCACTTC23 2ACCGT TTACA TCGT GGCT23Sense primer : 5 Antisense primer : 5 Sense primer : 5 Antisense primer : 5 Tab. 1The primer sequence and size of PCR products of the 4 genes expressed in the rat panc

10、reas Gene Primer sequence Size of PCR products Sense primer : 5 Insulin 1 209 bp Antisense primer : 5 Glucagon 492 bp 2GTCTCT GGT GGCAA GGT TA T23 2ACA T T GGT GTA GCA GGGT T23 2amylase 318 bp 2CAAGGGCTCTGTCA GTAGG23 Sense primer : 52CACCC GCGA G TACAA CCTTC23 2actin 207 bp Antisense primer : 52CCCA

11、 TACCCACCA TCACACC23 1. 3大鼠胰腺的取材和保存取材所用的器械 180 干烤 6 h,不能干烤的塑料制品用 1 mL/L DEPC 水 37處理過(guò)夜 ,高壓烤干后備用。戊巴比妥鈉麻 醉 E3大鼠 ,快速取胰腺尾部組織約 2030 mg,裝 入 DEPC處理過(guò)的凍存管中 ,液氮中保存或液氮速 凍后 -80保存?zhèn)溆谩?1. 4利用 TRIzol ó和液氮提取大鼠胰腺總 RNA 將胰腺組織從液氮或 -80低溫冰箱中取出 ,立即 放入裝有適量液氮的研缽中迅速研磨成粉末 ,研磨過(guò) 程中始終保持研缽內(nèi)有液氮。然后 ,將胰腺組織粉末 移入 1.5 mL的 EP管中 ,加入 1

12、 mL TRIzol ó ,劇烈 震蕩 30 s,并在室溫放置 5 min。加入 0.2 mL氯仿 , 劇烈振蕩 15 s,室溫放置 3 min ,4 12 000 ×g離心 15 min,樣品分為 3層 :上層無(wú)色水相 ,下層粉紅色有 機(jī)相 ,中間白膜層。將上清轉(zhuǎn)移至另一新的 D EPC 處理過(guò)的 1.5 mL EP管中 (此步絕對(duì)不能吸入中間 白膜層 ,加入 0.5 mL異丙醇 ,混勻后 -20放置 30 min。4 12 000 ×g離心 10 min,棄去上清 ,用 750 mL/ L乙醇洗滌 RNA膠樣沉淀。 4 7500 ×g 離心 5 mi

13、n ,室溫放置 1015 min干燥 ,加入 60L D EPC 水溶解 RNA沉淀后 280保存。若長(zhǎng)期保 存 ,RNA也可用無(wú) RNA酶的去離子甲酰胺溶解。 1. 5大鼠胰腺總 RNA定量 及 A260/ 280比值鑒定用 99L DEPC水稀釋總 RNA 1L后 ,用核酸 /蛋白質(zhì) 微量定量?jī)x檢測(cè)大鼠胰腺總 RNA的含量及 A260/ 280 比值。 1. 610 g/L非變性的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大鼠胰 腺總 RNA電泳 RNA所用器械如制膠的模具、梳 子、電泳槽等用 30 mL/L過(guò)氧化氫溶液浸泡 30 min, 用 DEPC水沖洗 3遍 ,室溫晾干備用。用對(duì) RNA酶 有抑制作用的

14、D EPC水配置電泳緩沖液 TA E及其 他所有溶液。用新的 0. 5 ×TA E配制 10 g/L瓊脂糖 凝膠 ,溴化乙錠 ( EB直接加入凝膠中。點(diǎn)樣時(shí) ,樣品 RNA每 2. 5 L加入 0. 5 L6×上樣緩沖液 ,以 5 V/ cm電壓電泳 30 min左右取出凝膠 ,在凝膠成像 系統(tǒng)觀察所提取的 RNA并拍照記錄。 1. 7RT2PCR法檢測(cè)胰島素 1、胰高血糖素、胰2淀 粉酶和 2actin的表達(dá)按照 RevertaidTM First 5期李冬民 ,任吳超 ,王璇 ,等.利用 TRIzol ó試劑和液氮提取大鼠胰腺高質(zhì)量總 RNA Strand c

15、DNA Synthesis Kit操作說(shuō)明 ,反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系總體積 20L,含胰 腺總 RNA 5 g、M2MUL V逆轉(zhuǎn)錄酶 ( 200 u/L 1L。cDNA合成后保存在 -80冰箱中備用。 PCR擴(kuò)增大鼠胰島素 1、胰高血糖素、胰2淀粉 酶和 2actin :取高壓滅菌的 0.2 mL的 PCR小管 4 支 ,分別依次加入 10 ×PCR Buffer 2. 5 L、dN TP Mixture (各 2. 5 mmoL/L 2 L、T aq DNA poly2 merase (5 u/L 0. 125L、上下游引物各 1L、cD2 NA 0.5 L、

16、滅菌蒸餾水 17. 875 L,反應(yīng)總體積 25L?；靹蚝?,短暫離心。反應(yīng)條件 :94 5 min , 94 1 min ,60. 3 1 min ,72 1 min延伸 ,共 32 個(gè)循環(huán) ,最后 72 10 min。產(chǎn)物鑒定 :取 20L PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在 10 g/L瓊脂糖凝膠上電泳鑒定 ,用凝膠 成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。 2結(jié)果 2. 1大鼠胰腺總 RNA定量、 A260/ 280比值及 10 g/L 非變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果利用TRIzol ó試劑和 液氮提取的4只E3大鼠胰腺總RNA量可達(dá)到36 g/ mg胰腺組織, A260/ 280比值在1. 751. 89之間。 在1

17、0 g/ L非變性瓊脂糖凝膠電泳時(shí),均可見28S及 18S條帶,28S與18S條帶灰度比值大于1. 8 ,并且在 28S和18S條帶間可見明顯的云霧狀陰影(圖1。 RNA的提取是分子生物學(xué)中最常用的操作技術(shù) 之一。由于mRNA分子容易受到核糖核酸酶的破壞 而降解,加上核糖核酸酶廣泛存在且極為穩(wěn)定,因此 圖 1利用 TRIzol ó試劑和液氮提取的大鼠胰腺總 RNA 的 10 g/L非變性瓊脂糖凝膠電泳 Fig.1 10 g/L non2denatured agarose gel electrophoresis of the total RNA isolated from pancre

18、as of 4 E3 rats (1 -4 with TRIzol ó reagent and liquid nitrogen 2. 2RT2PCR法檢測(cè)大鼠胰腺特異性基因的表 達(dá) RT2PCR產(chǎn)物的 10 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示 ,大 鼠胰腺特異性表達(dá)基因胰島素 1 (209 bp、胰高血糖素 (492 bp和胰 2淀粉酶 (318 bp以及管家基因 2actin (207 bp均有清晰的條帶 ,未見非特異性擴(kuò)增 (圖 2。 圖 2大鼠胰腺特異性表達(dá)基因 RT2PCR產(chǎn)物的 10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳 Fig. 2 RT2PCR analysis of products o

19、f pancreas2specific genes from rat pancreas on 10 mL/ L agarose gel M : DNA marker ; 1 : insulin 1 ; 2 : glucagon ; 3 : amylase ; 4 : beta2 actin 3討論 抑制核糖核酸酶的活性成為 RNA提取過(guò)程中的關(guān) 鍵問(wèn)題。常規(guī)的組織和細(xì)胞 RNA的提取要求所有 與 RNA接觸的儀器和裝置都要嚴(yán)格處理 ,以盡量減 少外源性 RNA酶污染造成的 mRNA降解 2。然而 對(duì)于易于自溶和富含內(nèi)源性 RNA酶的胰腺組織的 RNA提取 ,常規(guī)方法因不能完全抑制 RNA酶活性

20、 而使胰腺 RNA的提取失敗。目前 ,僅有少量文獻(xiàn)報(bào) 道胰腺組織的 RNA提取方法 ,主要有兩種 :原位 胰腺導(dǎo)管灌注 RNA酶抑制劑 ,然后提取 RNA3 ; 將新鮮胰腺組織樣品保存于 RNAlater2ICE中 ,用液 氮或干冰速凍后 ,提取 RNA 425。第一種方法由于胰 腺導(dǎo)管灌注成功與否是提取胰腺完整 RNA關(guān)鍵 ,因 而要求有很高的導(dǎo)管穿刺技術(shù) ,穿刺失敗 ,則前功盡 棄 ,因而重復(fù)性差 ;第二種方法也是目前研究中主要 用的方法 ,但由于所用試劑較多 ,步驟繁瑣 ,也不容易 在眾多實(shí)驗(yàn)室推廣。 商業(yè)所售的 TRIzol ó試劑提取總 RNA ,實(shí)質(zhì)上 是酸性異硫氰酸胍

21、2酚2氯仿抽提一步法分離 RNA 6 。按照 TRIzol ó試劑操作步驟通過(guò)勻漿可非 常容易地提取多種組織的 RNA。如果直接用勻漿法 破碎富含核糖核酸酶的胰腺組織 ,由于胰腺組織中的 細(xì)胞不容易迅速與裂解液 TRIzol ó試劑充分接觸 , RNA酶不能迅速被滅活而致提取的 RNA降解。因 此 ,在抑制 RNA酶活性的同時(shí) ,使組織充分的裂解 , 642 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào) (醫(yī)學(xué)版 第 30卷 降解問(wèn)題也就迎刃而解。 RNA酶活性在低溫環(huán)境 (液氮、干冰 或 RNA酶抑制劑中可被完全抑制 728 , 與干冰和 RNA酶抑制劑相比 ,液氮具有更經(jīng)濟(jì)、易 于獲得的優(yōu)點(diǎn)。 在

22、研究中 ,我們利用 TRIzol ó試劑和液氮經(jīng)過(guò) 50余次的實(shí)踐 ,最終成功提取了大鼠胰腺高質(zhì)量的 總 RNA。總 RNA定量、 A260/ 280比值測(cè)定和 10 g/L 非變 性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果均提示 ,所提取的大鼠胰 腺總 RNA沒有降解 ,完整性很好。為了進(jìn)一步鑒定 所提取的 mRNA的質(zhì)量及其是否可以用于下游實(shí) 驗(yàn) ,如 RT2PCR、Northern blotting、差異顯示、抑制 性消 減雜交、芯片等的研究 ,我們選用 RT2PCR檢測(cè) 了大鼠胰腺特異性基因的表達(dá)。結(jié)果顯示 ,不但管家 基因 2actin條帶清晰 ,而且胰腺內(nèi)分泌部特異性表 達(dá)基因胰島素和胰高血糖

23、素以及外分泌部特異性表 達(dá)基因胰 2淀粉酶 ,在 marker所指示的位置均有清 晰的條帶 ,沒有非特異性擴(kuò)增條帶。在設(shè)計(jì)引物時(shí) , 我們特別注意選擇位于不同外顯子上的上下游引物 , 從而保證了R T2PCR模板來(lái)源于mRNA反轉(zhuǎn)錄后 的cDNA ,而非DNA。 利用TRIzol ó和液氮提取大鼠胰腺高質(zhì)量總 RNA的方法,不但經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單方便,而且重復(fù)性好。 但在具體操作中有幾點(diǎn)要特別注意:取胰腺組織的 動(dòng)作一定要快;胰腺組織在-80保存前一定要 用液氮速凍;研磨過(guò)程中要及時(shí)添加液氮,保證胰 腺組織在研磨時(shí)一直浸在液氮中,防止mRNA降解; 反轉(zhuǎn)錄時(shí)也要避免外源性RNA酶的污染。 J

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