利用cDNA-AFLP技術(shù)獲得小麥耐鹽性相關(guān)基因TaVHA-C

1、利用cDNA-AFLP技術(shù)獲得小麥耐鹽性相關(guān)基因TaVHA-C秘彩莉1,2，張學(xué)勇1，溫小杰1，劉 旭1（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)部作物品種資源與生物技術(shù)重點實驗室，北京100081； 2河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石家莊 050016）摘要：【目的】利用cDNA-AFLP技術(shù)對耐鹽性受主效基因控制的小麥品系98-160鹽脅迫前后基因表達的變化進行分析?！痉椒ā繉?12個克隆的cDNA差異表達片段進行了Blast-x分析。【結(jié)果】約有65.2%的片段與已知基因有較高的同源性，從中篩選出18個與小麥耐鹽性密切相關(guān)的片段，主要包括轉(zhuǎn)錄因子、與離子轉(zhuǎn)運有關(guān)的蛋白、信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白、脅迫相關(guān)

2、蛋白以及與蛋白-蛋白相互作用有關(guān)的蛋白。以94號片段為基礎(chǔ)，通過電子延伸和RT-PCR，克隆了小麥液泡膜ATPase亞基（TaVHA-C）的全長cDNA，Northern結(jié)果表明，在脅迫的早期（02 h）TaVHA-C基因的表達基本不變，隨著脅迫時間的延長（612 h），TaVHA-C基因的表達逐漸減弱，以后（2472 h）又逐漸增強。低溫對TaVHA-C基因的表達有明顯的抑制作用?！窘Y(jié)論】利用cDNA-AFLP技術(shù)分離差異表達片段進行相關(guān)基因的研究是可行的。關(guān)鍵詞：小麥；耐鹽性；cDNA-AFLP；TaVHA-CIsolation of TaVHA-C, A Gene in Wheat Re

3、lated to Salt-Tolerance via cDNA-AFLPBEI Cai-li1,2, ZHANG Xue-yong1, WEN Xiao-jie1, LIU Xu1(1Crop Science Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Crop Germplasm Resources and Biotechnology, Ministry of Agriculture, Beijing 100081; 2 Life Science Academy of Hebei Norma

4、l University, Shijiazhuang 050016 )Abstract: 【Objective】 98-160 is a wheat line with excellent salt-tolerance that is controlled by major genes. The expression profiles of 98-160 stressed by salt for different times were studied via cDNA-AFLP.【Method】 One hundred and twelve differentially expressing

5、 cDNA fragments were obtained, which were sequenced and analyzed by Blast-x. 【Result】 One hundred and twelve fragments were cloned and sequenced. The Blastx analysis showed that 62.5% of the sequenced fragments were similar to known genes in the database, in which 18 cDNA were tightly related to whe

6、at salt tolerance, most of them were transcription factor, transportation related protein, signal transduction related protein and proteins related to other stresses. Some fragments encoded proteins involved in protein-protein interaction. Based on a cDNA fragment similar to vacular ATPase C subunit

7、, full-length cDNA of a vacular ATPase C subunit in wheat (TaVHA-C) was obtained using electric PCR and RT-PCR. Northern blot analysis indicated that drought and salt stress had a similar effect on the expression of TaVHA-C. The expression of TaVHA-C was steady at the early stage of stress (0 to 2 h

8、ours), it decreased subsequently (6 to 12 hours) and increased in the end ( 24 to 72 hours). Significant inhibition was observed of low temperature on the expression of TaVHA-C. 【Conclusion】These results further proved that it was viable to isolate genes of plants with large genome size via cDNA-AFL

9、P .Key words: Wheat; Salt tolerance; cDNA-AFLP; TaVHA-C0引言【本研究的重要意義】土壤鹽漬化嚴(yán)重影響植物的生長，提高作物的耐鹽性對提高作物產(chǎn)量具有非常重要的意義。但耐鹽性是一個非常復(fù)雜的性狀，長期以來人們對植物耐鹽性的了解主要來自于生理學(xué)的研究成果，如有機溶質(zhì)的積累1，鹽誘導(dǎo)蛋白的產(chǎn)生等2?！厩叭搜芯窟M展】H+-ATPase存在于動植物細胞的質(zhì)膜和各種內(nèi)膜系統(tǒng)中，在建立跨液泡膜質(zhì)子梯度、促進液泡Na+區(qū)域化、提高植物耐鹽性方面發(fā)揮著重要作用3。從功能角度可將H+-ATPase分為兩類：利用跨膜的質(zhì)子電化學(xué)勢合成ATP，如F型H+-ATPas

10、e；利用水解ATP產(chǎn)生的能量，形成跨膜的質(zhì)子電化學(xué)勢，如P型和V型H+-ATPase。V-ATPase存在于所有已知真核生物中，是空泡膜系統(tǒng)中最重要的致電性質(zhì)子 泵4，全酶由兩部分組成，膜的外周部分是一個“頭-柄”狀結(jié)構(gòu)，為V1部分，與膜整合的部分為V0部分。V1部分由8個亞基（A-H）組成，負責(zé)ATP的水解；V0部分由5個亞基（c、c'、c''、a和d）組成，負責(zé)質(zhì)子的運輸。許多研究結(jié)果表明，在鹽脅迫和冷害條件下，V型H+-ATPase通過調(diào)節(jié)自身結(jié)構(gòu)以適應(yīng)環(huán)境變化，其活性也發(fā)生相應(yīng)的變化，當(dāng)土壤中存在高鹽、干旱和重金屬等脅迫時，細胞的存活主要依賴V型H+-ATPas

11、e活性的維持和調(diào)整5。在鹽生植物堿蓬中，其抗鹽的主要策略是增強V-ATPase的表達活性，從而為通過液泡膜進行離子轉(zhuǎn)運提供必要的能量，而且V-ATPase活性的增加不是通過結(jié)構(gòu)的變化，而是通過增加蛋白的表達量來實現(xiàn)的6。V-ATPase中的V-ATPases C亞基是親水性亞基，位于VHA柄部，與V-ATPases C亞基V1部分的裝配/解離關(guān)系密切。V-ATPases C亞基在細胞中的作用可能是作為一種錨定蛋白調(diào)節(jié)V-ATPases與肌動蛋白的聯(lián)結(jié)7。【本研究的切入點】長期以來人們對小麥耐鹽機理知之甚少，原因是小麥?zhǔn)钱愒戳扼w，遺傳背景較為復(fù)雜，因此研究小麥耐鹽特性的捷徑之一便是從基因表達的

12、差異入手，尋找與小麥耐鹽性相關(guān)的基因或cDNA片段?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究從基因的差異表達入手，利用cDNA- AFLP研究鹽脅迫前后基因表達的變化，以發(fā)現(xiàn)與小麥耐鹽性密切相關(guān)的cDNA片段，以此為基礎(chǔ)，克隆小麥液泡膜ATPase C subunit（TaVHA-C）基因的全長cDNA。1材料與方法1.1材料以耐鹽性受主效基因控制的小麥品系98-1608為材料。將98-160的種子浸泡過夜，然后轉(zhuǎn)入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，待幼苗長至5 cm時，轉(zhuǎn)入Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)。當(dāng)幼苗長至兩葉一心時，加入1.5% NaCl進行鹽脅迫，整個培養(yǎng)過程在25進行。脅迫時間分別為0、15 min、2 h

13、、6 h、12 h、24 h和72 h。1.2cDNA-AFLP分別提取7個處理的小麥樣品根的總RNA（Trizol，Invitrogen），cDNA的合成按Takara的cDNA synthesis kit（M-MLV version）操作說明進行。合成的雙鏈cDNA經(jīng)PstI/MseI雙酶切并加接頭進行預(yù)擴增，將預(yù)擴產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，以P/M引物組合進行選擇性擴增。選擴產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上進行分離和銀染。切取差異表達片段，用原引物進行二次擴增。PCR產(chǎn)物用Promega公司的T-easy載體進行連接和克隆。鑒定出的陽性克隆提取質(zhì)粒后在DNA Analyzer 3730 XL上

14、進行測序，測序結(jié)果在http:gov/blast網(wǎng)站上進行Blast-x比對。1.3 小麥TaVHA-C全長cDNA克隆和表達將液泡ATPase C亞基片段轉(zhuǎn)換成FASTA格式提交NCBI網(wǎng)站的electric PCR系統(tǒng)進行電子延伸。根據(jù)電子延伸的結(jié)果設(shè)計擴增TaVHA-C全長cDNA的引物，序列如下：V-ATPase 5-2: 5 gACCTCCTCCTCCCgCTCCCC CTCg 3；V-ATPase 3-1: 5 AAAAAgTAAACAgTTgTAACA gCgTAgC 3。98-160鹽脅迫2 h后根的總RNA的提取以及cDNA合成按前述方法進行。按如下程序進行PCR：94 5

15、min，（94 30 s，60.5 40 s，72 2.5 min）×32，72 10 min。擴增產(chǎn)物克隆到Promega公司的pGEM-T easy vector上進行測序驗證。分別提取98-160鹽（1.5%NaCl）、干旱（16.7% PEG）以及低溫（4）脅迫0、15 min、2 h、6 h、12 h、24 h和72 h葉片的總RNA。各取30 g總RNA在1.5%甲醛變性膠上電泳并轉(zhuǎn)移至尼龍膜，以TaVHA-C全長cDNA為探針進行Northern雜交，具體方法參照分子克隆第二版9。2結(jié)果與分析2.1與小麥耐鹽性表達相關(guān)的差異片段的cDNA- AFLP分析利用約200對P

16、/M引物組合研究了98-160鹽脅迫不同時間的基因表達變化，得到500多條差異表達片段。擴增片段長度大多在100500 bp。從圖1中可以看出，大多數(shù)基因的表達沒有明顯變化，只有少數(shù)基因在某一特定時間點表達，如左邊箭頭所示，提示其可能是一些起特殊作用的調(diào)控因子，發(fā)揮完作用后迅速被降解掉；有的基因在兩個不連續(xù)的時間點出現(xiàn)，如圖中右邊箭頭所示，預(yù)示其可能在鹽脅迫的不同時間發(fā)揮不同作用；有些只在脅迫早期出現(xiàn)，在脅迫晚期則消失，如中間箭頭所示，推測其可能與小麥早期的鹽脅迫反應(yīng)有關(guān)。因此，利用cDNA -AFLP結(jié)合不同的處理條件可以研究同一基因在不同條件下的動態(tài)表達，這是很多方法無法做到的。2.2 差

17、異表達片段的分析和功能預(yù)測從500多條差異表達片段中隨機選取233個進行二次擴增，成功擴增并克隆、測序的有112個。Blast-x比對結(jié)果表明，與已知基因有同源性的片段有73條，約占測序數(shù)的65.2%，編碼未知功能蛋白的基因有25條，約占22.3%，另有14條片段與已知基因或序列無任何同源性，可能是尚未發(fā)現(xiàn)的新基因。表中僅列出了與耐鹽性密切相關(guān)的18個cDNA片段的信息。有些基因只與生物的基本生長和代謝有關(guān)，在此未全列出。 1 2 3 4 5 61. CK; 2. 2 h; 3. 6 h; 4. 12 h; 5. 24 h; 6. 72 h圖1 一組選擴結(jié)果（引物組合M24P26）Fig.1

18、Amplified products by primer pairs M24P26表 與小麥耐鹽性相關(guān)的cDNA片段Table cDNA sequences related to wheat reaction to salt-stress類型Group編號No. of fragment大小Size (bp)編碼可能的蛋白Proteins encoded物種Speciese值e value轉(zhuǎn)錄因子Ttranscription factor18189Ste 12-類轉(zhuǎn)錄因子 Ste 12-like transcription factorColletotrichum5e-05與離子轉(zhuǎn)運有關(guān)Ion

19、transportion related protein58277陽離子轉(zhuǎn)運蛋白 Cation transport ATPaseCytophaga1e-1494381液泡膜ATP合成酶Putative vacuolar ATP synthaseOryza sativa1e-38與信號傳導(dǎo)有關(guān)Signal transduction related protein22207GTP-結(jié)合蛋白 Probable GTP-binding proteinFission yeast7e-2192446受體類激酶 Receptor-like kinase-likeOryza sativa2e-2298253鈣

20、神經(jīng)原B亞基 Calcineurin B subunitNeurospora crassa8e-12147177GTP-結(jié)合蛋白 Probable GTP-binding proteinFission yeast3e-17與脅迫有關(guān)的蛋白Stress related protein90282NBS-LRR類抗病蛋白NBS-LRR disease resistance proteinHordeum vulgare4e-19121253抗病蛋白Putative disease resistance proteinOryza sativa6e-09200170紫外傷害DNA結(jié)合因子蛋白 UV-dam

21、aged DNA binding factor - like proteinArabidopsis1e-24與蛋白相互作用有關(guān)Protein-protein interaction related protein8237分子伴侶 Putative chaperoninArabidopsis5e-1770295LRR類蛋白 Leucine-rich repeat-like proteinOryza sativa2e-08143297WD重復(fù)蛋白RBAP1 Putative WD-repeat protein RBAP1Oryza sativa4e-07151219泛素羧基末端水解酶Putativ

22、e ubiquitin carboxyl terminal hydrolaseOryza sativa6e-30197280鋅指蛋白 Zinc finger proteinHomo sapiens9.2202391TPR類蛋白 Tetratricopeptide repeat (TPR)-containing proteinArabidopsis thaliana1e-37227255泛素相關(guān)蛋白 Putative ubiquitin-associated (UBA) proteinOryza sativa2e-32其它Others125206羥甲基戊二酰輔酶A裂合酶 Hydroxymethy

23、lglutaryl-CoA lyase relatedArabidopsis5e-192.3 小麥TaVHA-V全長cDNA的克隆和表達以94號片段為基礎(chǔ)進行電子延伸，得到了1個約1.3 kb的片段，而且該片段具有完整的開放閱讀框。以此電子延伸結(jié)果為基礎(chǔ)設(shè)計引物進行PCR，得到1個1 369 bp的cDNA（圖2），該片段具有完整的開放閱讀框和加尾信號（aataa）。將該序列提交到NCBI圖2 TaVHA-C全長cDNA的擴增Fig.2 Amplification of TaVHA-C full length cDNA進行Blast-x比對，結(jié)果表明該基因與大麥的液泡膜ATPase C亞基的同

24、源性為88%，推測其為小麥的液泡膜ATPase C亞基。以TaVHA-C全長cDNA為探針，研究了TaVHA-C在鹽、干旱和低溫脅迫下的表達，結(jié)果如圖3。從圖中可以看出，鹽和干旱對TaVHA-C基因的表達影響基本一致，在脅迫的早期（02 h），TaVHA-C基因的表達基本不變，隨著脅迫時間的延長（612 h），TaVHA-C基因的表達逐漸減弱，以后（2472 h）又逐漸增強，說明這是植物對脅迫的一低溫脅迫(4)Leaves with low temperature (4)干旱誘導(dǎo) (16.7%PEG)Leaves under PEG stress (16.1%)鹽脅迫(1.5%NaCl)Lea

25、ves under salt stress (1.5%NaCl)1: CK; 2: 15min; 3: 2 h; 4: 6 h; 5: 12 h; 6: 24 h; 7: 72 h圖3 TaVHA-C基因在不同脅迫后的Northern雜交結(jié)果Fig.3 Northern blot of TaVHA-C under different stresses種適應(yīng)。低溫對TaVHA-C基因的表達有明顯的抑制作用（圖3-C）。3 討論本試驗利用cDNA-AFLP技術(shù)從小麥中克隆了一些與鹽脅迫反應(yīng)相關(guān)的cDNA片段，它們有可能在小麥的耐鹽中起重要或決定性作用。這些基因涉及范圍廣，幾乎涵蓋了與耐鹽性相關(guān)的各

26、類基因。筆者得到了幾個與信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)的基因片段，如GTP結(jié)合蛋白（22號）、鈣神經(jīng)元B亞基（58號）等。鈣神經(jīng)元信號傳導(dǎo)途徑是酵母中由離子脅迫引起的信號傳導(dǎo)途徑。鈣神經(jīng)元CaN由催化亞基CnA和調(diào)節(jié)亞基CnB組成，CnA的催化活性需要Ca2+-CnB和Ca2+-CaM的共同參與10。將CnA和CnB一起轉(zhuǎn)入煙草可提高煙草的耐鹽性11。CBL（calcineurin B-like）是擬南芥中鈣神經(jīng)原B亞基的同源基因，在CBL1過量表達的轉(zhuǎn)基因植株中，植物的耐鹽性和耐旱性均增強，而抗凍性下降。這些結(jié)果說明CBL1是植物鹽脅迫和干旱脅迫的正調(diào)節(jié)因子而對低溫脅迫進行負調(diào)控12。其次，筆者分離到7個

27、與蛋白-蛋白相互作用相關(guān)的基因片段，其中有3個與泛素降解途徑有關(guān)。SCFSkp1、Cdc53（cullin）、F-box復(fù)合體由4個亞基組成，參與了許多生長發(fā)育和激素的信號傳導(dǎo)過 程13。F-box蛋白是SCF復(fù)合體中的一個亞基，決定了底物蛋白的特異性，如金魚草中的AhSLF-2就是通過形成SCFAhSLF-2復(fù)合體特異識別并降解S-RNase來抑制自交親和現(xiàn)象的14。前面提到的受體激酶（92號）經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)與水稻的一個F-box基因有同源性，推測其可能與小麥耐鹽信號傳導(dǎo)中某個組分的降解有關(guān)。還有2個與泛素降解途徑密切相關(guān)的片段-泛素羧基末端水解酶（151號）和泛素相關(guān)蛋白（227號），在擬南芥

28、中，RUB是一個泛素相關(guān)蛋白，RUB對CUL1（SCF復(fù)合體中的另外一個亞基）的修飾對TIR1（生長素信號傳導(dǎo)途徑中的一個負調(diào)控因子）正常行使功能是必需的15。因此，推測TaUBA也可能與SCF復(fù)合體介導(dǎo)的蛋白降解途徑的調(diào)節(jié)有關(guān)。因此，泛素降解途徑很可能參與了小麥鹽脅迫的信號傳導(dǎo)，具體機制有待于進一步研究。第三，得到幾個與離子轉(zhuǎn)運有關(guān)的片段。58和94號片段編碼與離子轉(zhuǎn)運有關(guān)的蛋白，其中94號片段編碼液泡膜ATPase C亞基。液泡對于Na+和Cl在鹽脅迫下的區(qū)隔化作用十分明顯。在428 mmol·L-1 NaCl中生長的煙草懸浮細胞，其液泡中可以積累780 mmol·L-

29、1的Na+和624 mmol·L-1的Cl，而在細胞中這兩種離子的濃度卻都低于100 mmol·L-116。當(dāng)土壤中存在高鹽、干旱和重金屬等脅迫時，細胞的存活主要依賴V型H+-ATPase活性的維持和調(diào)整17。在鹽生植物鹽地堿蓬中，其抗鹽的主要策略是增強V-ATPase的表達活性，從而為通過液泡膜進行離子轉(zhuǎn)運提供必要的能量18。以一個cDNA-AFLP片段為基礎(chǔ)，通過電子延伸和RT-PCR，克隆了小麥V型H+-ATPase C亞基的全長cDNA，V-ATPase中的V-ATPases C亞基是親水性亞基，位于VHA柄部，與V-ATPases C亞基V1部分的裝配/解離關(guān)系密

30、切。V-ATPases C亞基在細胞中的作用可能是作為一種錨定蛋白調(diào)節(jié)V-ATPases與肌動蛋白的聯(lián)結(jié)19。在鹽和干旱脅迫的早期（02 h），TaVHA-C基因的表達基本不變，隨著脅迫時間的延長（612 h），TaVHA-C基因的表達逐漸減弱，以后（2472 h）又逐漸增強，說明這是植物對脅迫的一種適應(yīng)。因為在脅迫的早期，Na+主要集中在根部，對葉片中V型H+-ATPase的活性影響不大；隨著脅迫時間的延長，Na+向地上部分轉(zhuǎn)移并大量積累在葉片中，可能導(dǎo)致位于膜外周的V1部分亞基的解聚，到了鹽脅迫的后期，隨著V型H+-ATPase各亞基之間的分工合作和調(diào)整，又重新恢復(fù)V型H+-ATPase的

31、表達活性，因此TaVHA-C基因的表達也經(jīng)歷了一個平衡-降低-升高這樣一個動態(tài)變化的過程。這與高粱中觀察到的結(jié)果一致。NaCl脅迫的初期，Na+主要在根和葉鞘中積累。相應(yīng)地，根的液泡膜ATP酶和焦磷酸酶水解活性、依賴ATP和PPi的質(zhì)子泵活性及Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運活性均明顯增加，根的生長沒有受到抑制。NaCl脅迫后期，Na+開始向地上部分運輸并在葉片中積累，葉片液泡膜質(zhì)子泵和Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運活性開始增加，根和葉鞘的Na/K比增加，其液泡膜ATP酶和焦磷酸酶水解活性、質(zhì)子泵活性和Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運活性下降。相應(yīng)地，根和葉鞘的生長也下降20。低溫對TaVHA-C基因的表達有明顯的抑制作用。Y

32、ashida指出細胞質(zhì)酸化是冷對細胞傷害的決定因素，低溫下維持細胞質(zhì)環(huán)境穩(wěn)定的液泡膜質(zhì)子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)可能對細胞的冷適應(yīng)至關(guān)重要21，說明冷脅迫與鹽脅迫機理不同,因而它們對環(huán)境中TaVHA-C基因表達的影響也不同。有關(guān)脅迫對V型H+-ATPase各亞基表達的影響的報道并不多見。在甜菜中，V型H+-ATPase A和c亞基受發(fā)育和高鹽脅迫的誘導(dǎo)表達22。在冰葉日中花中，只有c亞基受鹽脅迫的誘導(dǎo)23。但有關(guān)各種脅迫對V型H+-ATPase亞基表達影響的報道尚未見到?？傊?，利用cDNA-AFLP可以較多地發(fā)現(xiàn)和分離差異表達的cDNA片段，研究其動態(tài)表達變化；將cDNA-AFLP技術(shù)與RACE、電子克隆以及

33、全長cDNA文庫等全長克隆技術(shù)結(jié)合起來可以得到目的片段的全長cDNA，從而說明cDNA-AFLP技術(shù)在基因克隆尤其在大基因組作物的基因克隆中的可行性。4結(jié)論4.1 以鹽脅迫后的98-160為材料，利用cDNA-AFLP技術(shù)分離得到了與鹽脅迫有關(guān)的500多條差異表達片段。4.2 112個片段被克隆測序，Blast-x比對結(jié)果表明，與已知基因有同源性的片段有73條，約占測序數(shù)的65.2%，編碼未知功能蛋白的基因有25條，約占22.3%。4.3 以94號片段為基礎(chǔ)，克隆了小麥液泡膜ATPase亞基，該基因的表達受鹽、干旱和低溫脅迫的影響，說明該基因在植物的非生物脅迫反應(yīng)中可能發(fā)揮重要作用。Refer

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