人肺癌細胞株化療敏感性與基因表達的關(guān)系(一)

1、人肺癌細胞株化療敏感性與基因表達的關(guān)系(一)    作者：宋現(xiàn)讓，魏玲，王興武，劉賢錫 【摘要】 目的 探討人肺癌細胞株對化療藥物的敏感性與多藥耐藥相關(guān)基因和凋亡調(diào)控基因表達的關(guān)系。方法 采用MTT法檢測5株肺癌細胞SPCA1、NCIH446、 SH77、95C和95D對阿霉素（ADM）、順鉑(DDP)、絲裂霉素（MMC）、5氟尿嘧啶（5Fu）、卡氮芥（BCNU）的敏感性。流式細胞術(shù)檢測多藥耐藥基因P糖蛋白（Pgp）、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）、肺耐藥蛋白（LRP）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）和甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）等耐藥相關(guān)基因和Fas 、b

2、cl2、p53和p16等凋亡調(diào)控基因的表達。結(jié)果 不同肺癌細胞株對同一藥物敏感性有較大差異。相關(guān)分析顯示，肺癌細胞株對MMC的敏感性與GST和bcl2和bcl2的表達水平較高者，MMC的IC50較高，敏感性較低；對DDP的敏感性與p53蛋白表達水平呈負相關(guān)(P=0.036)；對其余藥物的敏感性與所檢基因的表達水平無關(guān)（P>0.05）。結(jié)論 人肺癌細胞株對不同化療藥物敏感與否有不同的機制，對MMC的敏感性與GST和bcl2的表達有關(guān)，對DDP的敏感性與p53的表達有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 肺癌細胞株流式細胞術(shù)化療敏感性多藥耐藥相關(guān)基因凋亡調(diào)控基因The Chemotherapy Sensitiv

3、ity and Gene Expression in Lung Cancer Cell LinesAbstract：Objective To explore the relationship of chemotherapy sensitivity and expression of multidrug resistance genes and apoptosis regulation genes in human lung cancer cell lines.Methods MTT method was used to detect the sensitivity on adriamycin(

4、ADM),cisplatinum(DDP), mitomycin C(MMC), fluorouracilum(5Fu),carmustine(BCNU) in five lung cancer cell lines including SPCA1、NCIH446、 SH77、95C and 95D. Multidrug resistance genes including Pglycoprotein(Pgp), Glutsthionestransferases (GST), Lung resistance protein (LRP), Multidrug resistance related

5、 protein (MRP)，MGMT and apoptosis regulation genes Fas,bcl2,p53 and p16 were examined by flow cytometry(FCM) .Results The chemotherapy sensitivity was obviously divergent in different lung cancer cell lines. The correlation analysis revealed that there were negative correlations between the sensitiv

6、ity on MMC in lung cancer cell lines and the expression of GST or bcl2, the P value were 0.040 or 0.030 respectively. The cell line with higher expression of GST or bcl2 had higher IC50 of MMC, the sensitivity on drug were poor; the sensitivity on DDP in cell lines had negative correlations with the

7、 expression of p53 protein, the P value was 0.036. There were no correlations among the sensitivity on other drugs and expression of other genes（P>0.05）.Conclusions The mechanism about the sensitivity on divergent drugs was different in human lung cancer cell lines.The sensitivity on MMC had corr

8、elation with the expression of GST and bcl2, The sensitivity on DDP related to the expression of p53.Key words：Lung cancer cell line; Flow cytometry; Chemotherapy sensitivity; Multidrug resistance genes; Apoptosis regulation genes0 引言肺癌目前的發(fā)病率和死亡率均居我國城市男性腫瘤的首位，約75%的肺癌患者確診時已屬中晚期，化療是其主要治療手段，耐藥性是影響化療效果的

9、主要因素。近年來，隨著腫瘤分子生物學(xué)和對基因功能的深入研究，人們逐漸認識到暴露于化療制劑后決定腫瘤細胞命運的主要是基因型而非制劑的基因毒性，腫瘤細胞相關(guān)基因的表達水平是造成對同一化療藥物敏感性不同的主要原因1。為深入探討肺癌化療耐藥機制，我們以體外培養(yǎng)的5株人肺癌細胞為研究對象，研究其對常用化療藥物的敏感性與耐藥相關(guān)基因和細胞周期及凋亡調(diào)控相關(guān)基因表達的相關(guān)性，以期為臨床用藥提供指導(dǎo)。1 材料與方法1.1 細胞株人肺腺癌細胞株SPCA1、人小細胞肺癌細胞株NCIH446和SH77，低和高轉(zhuǎn)移肺巨細胞癌細胞株95C和95D均購自中科院上海細胞生物學(xué)研究所。細胞在含10%FBS(Hyclone)的

10、DMEM(Gibco)培養(yǎng)液（含100U/ml青霉素和100g/ml鏈霉素）中于37、5% CO2培養(yǎng)，23天傳代一次。1.2 藥物敏感性實驗用MTT比色法檢測肺癌細胞對阿霉素（ADM）、5氟尿嘧啶(5Fu)、順鉑(DDP)、絲裂霉素C (MMC) 和卡氮芥（BCNU）的敏感性。調(diào)細胞密度為1×105/ml，每孔100l加入96孔板，每種藥物設(shè)5個濃度倍比稀釋等級，每濃度3個復(fù)孔。依據(jù)文獻報道血漿峰值藥物濃度（PPC）2和預(yù)實驗結(jié)果確定ADM、5Fu、DDP、MMC 和BCNU的基準(zhǔn)實驗濃度（BTC）分別為0.4g/ml、20.0g/ml、2.0g/ml、2.0g/ml和8.0g/m

11、l，5個倍比稀釋濃度分別為1/4、1/2、1、2、4倍BTC。37、5% CO2孵箱中培養(yǎng)48h后加MTT (Sigma,5mg/ml) 每孔10l，繼續(xù)培養(yǎng)4h，加10%SDSHCl每孔100l，24h后用Biorad 450型酶標(biāo)儀測各孔吸光度（A），檢測波長為570nm、參考波長為630nm。按下式計算各濃度條件下細胞存活率(VR)。VR(%)=實驗孔A值/對照孔A值×100%。Microsoft Excel 軟件作圖計算50抑制濃度（IC50）。1.3 基因表達的流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞懸液用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS洗滌2次（1000r/min,5min）后調(diào)

12、至1×106/ml。對Pgp和Fas，取100l細胞懸液直接加入PE 標(biāo)記的鼠抗人Pgp單抗或FITC標(biāo)記的鼠抗人Fas單抗及各自同型對照（BD Pharmogen）20l，室溫避光反應(yīng)30min即可檢測。余基因蛋白表達的樣品需用70乙醇4固定24h或先用1%多聚甲醛室溫固定5min，經(jīng)1% BSA的PBS洗滌（1000rpm,5min）2次后加110通透液2（BD Pharmogen）500l，室溫作用10min后用PBS洗滌并調(diào)濃度為1×106/ml。凋亡調(diào)控基因p53、p16、bcl2的免疫熒光染色為一步法，100l細胞懸液直接加入FITC標(biāo)記的鼠抗人p53、p16、

13、bcl2 單抗及各自同型對照（BD Pharmogen）20l，室溫避光反應(yīng)30min待檢；余耐藥基因染色為二步法，100l細胞懸液先加一抗10l，其中GST（250g/ml，110）和LRP（250g/ml，110）為BD Pharmogen產(chǎn)品，MRP（0.5mg/ml，120）和MGMT（1mg/ml，140）為Chemicon產(chǎn)品。室溫避光反應(yīng)30min后加二抗FITCIgG1（BD Pharmogen，110）5l，30min室溫避光反應(yīng)后檢測。流式細胞儀為FACS Calibur型（BD）。蛋白表達以相對熒光強度（RFI）表示。RFI=加單抗管細胞熒光強度/同型對照管細胞熒光強度。

14、1.4 統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)用SPSS(10.0)軟件處理。數(shù)據(jù)以±s表示，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。2 結(jié)果2.1 人肺癌細胞株的化療敏感性細胞株對5種化療藥物的敏感性見圖1，其IC50值見表1。2.2 細胞株化療敏感性與基因表達的關(guān)系各細胞株耐藥相關(guān)蛋白和凋亡調(diào)控蛋白表達分別見圖2、圖3。Pearson相關(guān)分析顯示，肺癌細胞株對MMC的敏感性與GST和bcl2的表達呈負相關(guān)(P0.05)，GST和bcl2表達水平較高者，MMC的IC50較高，敏感性較低；對DDP的敏感性與p53蛋白表達水平呈負相關(guān)(P0.05)；對其余藥物的敏感性與所檢基因的表達水平均無關(guān)（P0.05），見表

15、2。ABCDEA：ADM, B：DDP, C:5-Fu, D： MMC, E：BCNU圖1 細胞株對各化療藥物的敏感性（略）表1 肺癌細胞株對化療藥物的敏感性（略）表2 肺癌細胞株對化療藥物的敏感性與蛋白表達的相關(guān)性 （略）3 討論化療是肺癌綜合治療的重要措施之一，但不同患者對相同化療方案的治療效果和反應(yīng)有差別，特別是不同病理類型的肺癌之間對化療藥物的敏感性差異較大，這一點在本研究中也得到證實，5株人肺癌細胞對同一藥物的IC50值最多可以相差35倍。因此，為避免治療的盲目性，有必要探索細胞對化療敏感或耐藥的更深層的原因，為腫瘤的個體化療提供依據(jù)。近年來，隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的發(fā)展，人們逐步認

16、識到基因表達水平不但決定腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后，而且與化療敏感性存在某種相關(guān)性，為此我們選擇5個不同類型的人肺癌細胞株作為對象，排除細胞類型的因素，研究其對5種臨床常用化療藥物的敏感性與耐藥相關(guān)基因、細胞周期及凋亡調(diào)控基因的蛋白表達水平之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，肺癌細胞株對MMC的敏感性與GST和bcl2表達水平相關(guān)具有顯著性(P0.05)，對DDP的敏感性與p53蛋白水平相關(guān)具有顯著性(P0.05)，均呈負相關(guān)關(guān)系。文獻報道，肺癌耐藥性與多種耐藥基因的表達有關(guān)，其中某些基因的表達可能是化療藥物誘導(dǎo)的結(jié)果，是繼發(fā)耐藥的原因，如Pgp蛋白，在未暴露于化療藥物的腫瘤細胞表達水平較低。本文的研究結(jié)果表明

17、，肺癌細胞的原發(fā)耐藥性與Pgp、LRP、MRP和MGMT的表達水平相關(guān)不顯著。谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）是一組具有多種生理功能的蛋白質(zhì)超基因家族，它能催化GSH與親電性物質(zhì)結(jié)合，而許多抗腫瘤藥物如烷化劑、蒽環(huán)類、鉑類化合物等均具親電性，因此其表達增加能保護細胞免受抗癌藥物的攻擊而產(chǎn)生耐藥。目前認為，與腫瘤多藥耐藥關(guān)系最密切的是GST。臨床研究發(fā)現(xiàn)GST表達陽性腫瘤化療敏感性較差，如在非小細胞肺癌患者組織中GST表達與含DDP化療方案的療效顯示負相關(guān)3。本研究顯示Gst表達與MMC敏感性呈負相關(guān)性（P0.05），與ADM、DDP敏感性雖也呈負相關(guān)但無統(tǒng)計學(xué)意義，這與Suzuki 和Xu等的結(jié)果一

18、致4,5。圖2 肺癌細胞株耐藥相關(guān)蛋白表達（略）圖3 肺癌細胞株凋亡調(diào)控蛋白表達（略）許多化療藥物具有細胞周期特異性，p53突變使腫瘤細胞的周期調(diào)控機制受到影響，同時化療藥物通過p53在DNA損傷和修復(fù)過程中的誘導(dǎo)凋亡機制增加細胞毒性。因此，一般認為突變p53蛋白與DNA損傷抗癌劑的效果呈負相關(guān)。Lowe等6和Li等7證明wtp53可提高DDP、鬼臼乙叉甙（VP16）、5Fu和放射線的細胞毒性，wtp53轉(zhuǎn)染耐藥人肝癌細胞Bel7402/5Fu可顯著增加細胞對5Fu、VcR和ADM的敏感性。本文結(jié)果也證實了這一點，在5株肺癌細胞中，p53突變蛋白的表達水平與DDP的敏感性相關(guān)。腫瘤細胞的凋亡是

19、一個復(fù)雜的過程，受凋亡促進和凋亡抑制基因的調(diào)控。bcl2基因為凋亡抑制基因，可通過抑制細胞凋亡而參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程。bcl2高表達可以抑制細胞的凋亡，增加腫瘤細胞對抗癌劑的抗拒。Kim等8和Tanabe等9用bcl2反義寡核苷酸分別處理甲狀腺癌細胞系8305C和乳腺癌細胞系MDAMB231 and BT474時發(fā)現(xiàn)細胞對MMC的敏感性提高，本研究結(jié)果與之相似。 從本文結(jié)果看出，肺癌細胞對化療藥物的敏感性，不同的藥物有不同的相關(guān)因素，除本文檢測的9種基因外，已報道的化療敏感性相關(guān)的基因或蛋白還有TS、二氫葉酸還原酶（DHFR）、金屬硫蛋白（MT）、TopoII、Her2/neu等。隨著對腫瘤

20、分子生物學(xué)和基因功能的不斷深入研究，必將有一些敏感性和特異性高的表達基因用于預(yù)測腫瘤化療療效，更好地指導(dǎo)臨床化療。【參考文獻】1 Matsuhashi N, Saio M, Matsuo A, et al.p53 dependence and apoptosis in response to FP treatment with p53transfected colon cancer cell lines by use of thin layer collagen gelJ. Oncol Rep,2004,12(2):357361.2 劉敘儀.人新鮮癌組織藥敏試驗及其方法A.韓銳. 腫瘤的化學(xué)預(yù)

21、防及藥物治療M. 第1版.北京: 北京醫(yī)科大學(xué)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社出版, 1994. 417419.3 Arai T, Yasuda Y, Takaya T, et al. Immunohistochemical expression of glutathione transferasepi in untreated primary nonsmallcell lung cancerJ. Cancer Detect Prev,2000,24(3):252257.4 Suzuki K, Yamamoto W, Park JS,et al. Regulatory network of mitomycin C action in human colon cancer cellsJ.Jpn J Cancer Res,1999 ,90(5):571577. 5 Xu BH, Gupta V, Singh SV. Mitomycin C sensitivity in human bladder cancer cells: possible role of glutathione and glutathione transferase in resistanceJ.Arch Biochem