微生物限度檢查辦法驗證方法

1、精心整理微生物限度檢查方法驗證方案1. 目的：為確認所采用的方法適合于該藥品的微生物限度檢查，包括細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)和控 制菌檢查，特制定本驗證方案，通過比較試驗菌的恢復生長結果，來評價整個檢驗方法的準確 性、有效性和重現(xiàn)性，以確認供試品在該實驗條件下無抑菌活性或其抑菌活性可忽略不計，所 采用的方法適用于該品種的微生物限度檢查。驗證過程應嚴格按照本方案規(guī)定的內容進行，若因特殊原因確需變更時，應填寫驗證方案 修改申請并報驗證領導小組批準2. 范圍：本驗證方案適用于微生物限度檢查方法的驗證。I、/Lx-j/ y £/3. 規(guī)范性引用文件：根據中國藥典2010年版二部附錄幻J微生物限度

2、檢查法的要求，由于某些供試品具有抗菌活性，在建立微生物檢查方法或產品的組分發(fā)生改變或原檢查法的檢驗條件發(fā)生改變 時，可能影響檢驗結果的準確性，必須對供試品的抑菌活性及測定方法的可靠性進行驗證。4. 驗證實施：441試驗前的準備：441.1 試驗用具的準備：將試驗需用的試管、刻度吸管、薄膜過濾器、濾膜(孔徑0.22um、直徑50mrh、平皿、空三角瓶、稱量紙等，用牛皮紙包扎好后，放于濕熱滅菌器中，在 121C，滅菌30 min,在3天內使用。4.4.1.2 試驗用培養(yǎng)基的制備：取適用性檢查合格的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(BL)、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、4-

3、甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基(MUG等脫水培養(yǎng)基，按照相應的配制說明，用純化水配制、分裝后，在2小時內，放于濕熱滅菌器中，在121C，滅菌15 min,在3周內使用。4.4.1.3試驗用稀釋劑/緩沖液、沖洗液的制備：取在有效期內的試劑，按照相應的配制方法， 配制pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、0.9%無菌氯化鈉溶液、0.05% (ml/ml )聚山梨酯80的 0.9%無菌氯化鈉溶液等，用純化水配制，加熱使溶，過濾，分裝，在121C，滅菌15 min,在3周內使用。442 試驗菌的制備和稀釋：442.1細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證用菌液：4.44.44.44.4.2.2控制菌檢查方法驗證用菌液

4、：4.44.4.2.2.2取上述均勻培養(yǎng)物（菌懸液），用0.9%無菌氯化鈉溶液對倍稀釋，制成每 1ml含菌10100cfu的試驗菌液。4.44.4.3供試液的制備：4.4.3.1 根據供試品的理化特性與生物學特性，采取適宜的方法制備供試液。4.4.3.2，取供試品養(yǎng)胃舒軟膠囊5g，加至含溶化的（溫度不超過 45C） 5g司盤80、3g單 硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80無菌混合物的燒杯中，用無菌玻璃攪拌成團后，慢慢加入 45C pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為 1： 20的供試 液。pI4.44.4.4.1 驗證試驗分4組，照微生物限度檢查法操

5、作，分別用 3個不同批號樣品進行3 次獨立的平行試驗，并分別計算供試品組和對照試驗組的菌回收率。4.4.4.2試驗組：4.4.4.2.1 平皿法：分1： 20的供試液1ml和試驗菌液（含菌50100CFU 1ml，注入同一 直徑90mm勺滅菌平皿中，每株試驗菌平行制備 2個平皿。4.44.444441平皿法：取1: 20供試液1ml,注入直徑90mnt勺滅菌平皿中，每種培養(yǎng)基平行制備2個平皿。4.4444.5稀釋劑對照組：若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心等特殊處理時，需增加 稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。4.44.44.4.4.6傾注培養(yǎng)基：在菌液組各平皿中分別

6、傾注1520ml溫度不超過45C的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，其中，金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、大腸埃希菌用營養(yǎng)瓊 脂培養(yǎng)基, 白色念珠菌、黑曲霉用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固。4.4.4.7培養(yǎng)觀察：用于細菌計數(shù)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板，倒置于3035C的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時；用于霉菌、酵母菌計數(shù)的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板，倒置于2328C的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72小時。逐日觀察菌落生長情況，點計菌落數(shù)。4.4.4.8菌落計數(shù)：將平板置菌落計數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼點計，以透射光襯以暗色背景，仔細觀察并記錄結果。4.4.4.9計算回收率"也如廠心# 試驗組平均菌落數(shù)-

7、供試品對照組平均菌落數(shù)X 100%、 X J稀釋劑對照組的平均菌落數(shù)稀釋劑對照組回收率=X10°%4.4.4.10結果判定：在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的回收率應均不低于70%。試i驗組的菌回收率均不低于70%，則照該供試液制備方法和計數(shù)法測定。若任一次試驗中試驗組的 菌回收率低于70%，則應采用薄膜過濾法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、中和法等方法或聯(lián) 合使用上述方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法學驗證。4.4.4.11細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證結果:第一次：樣品名稱試驗日期規(guī)格樣品批號生產商類別供試液的制備 及處理保溫振搖法 研缽法 勻漿儀檔min水溶性供試品：

8、供試品g（ml），加稀釋劑ml,制成1:供試液；取供試液ml,沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。非水溶性供試品：供試品g（ml），加乳化劑（名稱；批號）g（ml），加稀釋劑ml，制成1:供試液；取供試液ml,沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。其它：。技術方法細菌計數(shù)霉菌和酵母菌計數(shù)培養(yǎng)基名稱營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基配制批號培養(yǎng)溫度沢、V.;嚴培養(yǎng)起止時間菌種名稱菌大腸埃布 菌金黃色 葡萄球枯草芽 抱桿菌白色念珠菌黑曲霉菌種編號 z 1 ,菌懸液批號1一 - 菌液稀釋倍數(shù) / 1 ? .1 ,試驗組 （cfu）12平均菌液組（cfu）i二12平均稀釋劑對照組 （cfu）12平均供試品對照組（cfu）

9、12平均試驗組回收率（）稀釋劑對照組回收（）結論檢查人/日期復核人/日期精心整理第二次：樣品名稱試驗日期規(guī)格樣品批號生產商類別供試液的制備 及處理保溫振搖法 研缽法 勻漿儀檔min水溶性供試品：供試品g（ml），加稀釋劑ml,制成1:供試液；取供試液ml,沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。非水溶性供試品：供試品 g（ml），加乳化劑（名稱；批號 ）g（ml），加稀釋劑ml，制成1:供試液；取供試液ml，沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。其它：。技術方法細菌計數(shù)霉菌和酵母菌計數(shù)培養(yǎng)基名稱營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基配制批號培養(yǎng)溫度r1培養(yǎng)起止時間菌種名稱菌大腸埃布 菌金黃色 葡萄球枯草芽 抱桿菌白色念珠

10、菌黑曲霉菌種編號菌懸液批號菌液稀釋倍數(shù)試驗組（cfu12II-平均菌液組 （cfu）12平均稀釋劑對照組 （cfu）12平均供試品對照組（cfu）12平均試驗組回收率（）稀釋劑對照組回收（）結論檢查人/日期復核人/日期第三次:樣品名稱試驗日期規(guī)格樣品批號生產商類別供試液的制備 及處理保溫振搖法 研缽法 勻 水溶性供試品：供試品g（1：供試液；取供試液漿儀檔mninl，制成次，每膜;批供試ml），加稀釋劑mml，沖洗次數(shù)沖洗量ml。非水溶性供試品：供試品g（ml），加乳化劑（名稱 號）g（ml），加稀釋劑ml，制成1:液；取供試液ml，沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。其它：。技術方法細菌計數(shù)霉菌和酵

11、母菌計數(shù)培養(yǎng)基名稱營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基配制批號培養(yǎng)溫度培養(yǎng)起止時間菌種名稱菌大腸埃布 菌金黃色 葡萄球枯草芽 抱桿菌白色念珠菌黑曲霉菌種編號l_r；、*菌懸液批號i1菌液稀釋倍數(shù)試驗組 （cfu）12平均菌液組 （cfu）12平均稀釋劑對照組 （cfu）12精心整理平均供試品對照組 （cfu ）12平均試驗組回收率（）稀釋劑對照組回收（）結論檢查人/日期復核人/日期'T445控制菌檢查方法驗證方法：4.4.5.1 根據各品種項下微生物限度標準中規(guī)定檢查的控制菌，選擇相應驗證的菌株，驗證大腸菌群檢查法時，采用大腸埃希菌作為驗證菌株。驗證試驗分3組，分別用3個不同批號樣品或同一

12、批號樣品進行3次獨立的平行試驗。J I I-; I/445.2試驗組：4.4.5.2.1 平皿法：取1： 10的供試液10ml （相當于供試品1g、1ml、10cm2和1ml試驗 菌液（含菌10100CFU加入同一增菌培養(yǎng)基中，按相應控制菌的檢查方法進行檢查。4.44.4.5.3 陽性對照：取1ml試驗菌液（含菌10100CFU，加入增菌培養(yǎng)基中，按相應控 制菌的檢查方法進行檢查。4.4.5.4 陰性對照：取10ml稀釋劑或緩沖液替代供試液，加入增菌培養(yǎng)基中，按相應控制I I菌的檢查方法進行檢查。'i r4.4.5.5結果判定：在3次獨立的平行試驗中，陽性對照組應檢出試驗菌，陰性菌對照

13、組應 無菌生長。若試驗組檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查； 若試驗組未檢出試驗菌，應采用薄膜過濾法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、中和法等方法或 聯(lián)合使用上述方法消除供試品的抑菌活性，建立新的方法，并重新驗證。4.4.5.6控制菌檢查方法驗證結果：第一次：控制菌名稱樣品名稱試驗日期規(guī)格樣品批號生產商類別供試液的制備 及處理保溫振搖法研缽法 勻漿儀檔min水溶性供試品：供試品g(ml)，加稀釋劑ml,制成1:供試液；取供試液ml，沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。非水溶性供試品：供試品 g(ml)，加乳化劑(名稱；批號 )g(ml)，加稀釋劑ml，制成1：供試液；取供

14、試液ml，沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。其它：。培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)時間培養(yǎng)起止時間菌落生長情況' 叮-1試驗組陽性對照陰性對照：. L結論檢查人/日期復核人/日期第二次:控制菌名稱樣品名稱1試驗日期規(guī)格樣品批號生產商類別1 1供試液的制備 及處理保溫振搖法研缽法 勻漿儀檔min水溶性供試品：供試品g(ml)，加稀釋劑ml，制成1:供試液：取供試液ml，沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。非水溶性供試品：供試品 g(ml)，加乳化劑(名稱；批號 )g(ml)，加稀釋劑ml，制成1：供試液：取供試液ml，沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。其它：。培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)時間培養(yǎng)起止時間菌落生長情況試驗組陽性對照陰性對照

15、結論檢查人/日期復核人/日期第三次:控制菌名稱樣品名稱試驗日期規(guī)格樣品批號生產商類別供試液的制備 及處理保溫振搖法研缽法 勻漿儀檔min水溶性供試品：供試品g(ml)，加稀釋劑ml，制成1:供試液；取供試液ml，沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。非水溶性供試品：供試品 g(ml)，加乳化劑(名稱；批號 )g(ml)，加稀釋劑ml，制成1：供試液；取供試液ml，沖洗次數(shù)次，每膜沖洗量ml。其它：。培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)時間培養(yǎng)起止時間菌落生長情況試驗組陽性對照陰性對照結論匚F、J,-,r”檢查人/日期復核人/日期446驗證結論：根據上述驗證結果，總結出該品種的微生物限度檢查方法如下：5. 驗證結果評價與建議你5.1驗證結果評估與結論：按照驗證方案的要求實施驗證，并將驗證過程記錄在驗證報告中。對微生物限度檢查方法驗證的數(shù)據進行分析，對驗證的結果進行分析和評價，并建議日常監(jiān)控的項目和周期。5.2驗證會審 驗證領導小組對驗證實施的過程及結果進行