微生物限度檢查作業(yè)指導(dǎo)書樣本

1、資料內(nèi)容僅供您學(xué)習(xí)參考，如有不當(dāng)或者侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系改正或者刪除。目的 : 建立微生物限度檢查的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 , 為微生物檢驗(yàn)人員提供正確的操作方法。范圍 : 適用于輔料、 內(nèi)包材料和所有產(chǎn)品的微生物限度檢查。職責(zé) : 檢驗(yàn)人員對(duì)本規(guī)程的實(shí)施負(fù)責(zé)。參照標(biāo)準(zhǔn) : GB/T4789.3- ,GB/T4789.15- ,GB/T4789.2-內(nèi)容:1 概述微生物限度檢查法系指非規(guī)定滅菌制劑及其原、 輔料受到微生 物污染程度的一種檢查方法 , 包括染菌量及控制菌的檢查。供試品一般按批號(hào)隨機(jī)抽樣 ; 抽樣量應(yīng)為檢驗(yàn)用量 （ 2 個(gè)以上 最小包裝單位 ） 的 3 倍量 （ 以備復(fù)檢 ） 。檢驗(yàn)的全過程 , 均

2、應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作 , 嚴(yán)防再污染。2 儀器與用具恒溫恒濕培養(yǎng)箱、 生化培養(yǎng)箱、 恒溫水浴、 高壓蒸汽消毒鍋、 電熱恒溫干燥箱；試管、錐形瓶、量筒、培養(yǎng)皿（90mm）、刻 度吸管、 研缽 ; 托盤天平或電子天平、 鑷子、 剪刀、 酒精燈、 打火機(jī)、 編號(hào)筆、 75%酒精棉球 ； 拖鞋、 無(wú)菌衣、 褲、 帽、 口 罩。以上玻璃器皿、鑷子、 剪刀等洗凈、 晾干，160170 C干烤2h, 備用。所有滅菌物品存放于第一緩沖間 ， 不應(yīng)超過 2 周即用畢。否則 ，應(yīng)重新滅菌。3 培養(yǎng)基、 試液配制營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 （ 細(xì)菌用 ） 、 孟加拉紅培養(yǎng)基 （ 虎紅瓊脂培 養(yǎng)基 , 霉菌用 ） ,膽鹽乳糖培養(yǎng)基

3、 （ 即 BL, 用于大腸桿菌增菌培養(yǎng) ） 、 4 甲基傘 形酮葡糖苷酸 （ MUG） 培養(yǎng)基 （ 用于大腸桿菌快速檢查 ） 、 麥康凱 瓊脂培養(yǎng)基 （ 即 MacC, 用于腸道菌分離培養(yǎng) ） 、 蛋白胨水培養(yǎng)基 （ 供靛基質(zhì)試驗(yàn)用 ） 、 磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基 （ 供甲基紅及 VP 試驗(yàn)用 ） 、 枸櫞酸鹽培養(yǎng)基 （ 供枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)用 ） ; 營(yíng)養(yǎng)肉 湯培養(yǎng)基、 四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基 （ TTB, 沙門菌增菌用 ） 、 膽 鹽硫乳瓊脂 （ DHL） 或沙門、 志賀菌屬瓊脂 （ SS） 培養(yǎng)基 （ 用于沙 門菌分離培養(yǎng) ） 、 麥康凱瓊脂或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基 （ 大腸桿 菌及沙門菌分離

4、培養(yǎng)用 ） 、 三糖鐵瓊脂 （ TSI） 斜面培養(yǎng)基 （ 腸道 菌初步鑒別用）的配制及滅菌方法參見中國(guó)藥典 一部附錄X皿C。0.1%2,3,5- 氯化三苯基四氮唑 （ TTC） 溶液 （ 供制備培養(yǎng)基用）、氫氧化鉀試液（供作V- P反應(yīng)試劑）、a-萘酚乙醇溶 液（供作V P試劑）、靛基質(zhì)試液。的配制及滅菌方法參見中國(guó) 藥典一部附錄X皿C。稀釋劑 : 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液、 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液 （ PH7.2） 。4 操作過程4.1 試驗(yàn)前的準(zhǔn)備4.1.1 將所有已滅菌的培養(yǎng)皿、 錐形瓶、 研缽、 試管、 吸管、 量 筒、 稀釋劑及供試品等經(jīng)過傳遞窗進(jìn)入無(wú)菌室內(nèi) , 每次試驗(yàn) 所用物品必須事先計(jì)

5、劃 , 準(zhǔn)備足夠用量 , 避免操作中出入。 將全部包裝去掉 , 編號(hào)。4.1.2 開啟紫外燈 30 分鐘 （ 或臭氧發(fā)生器 1h） 和空氣過濾裝置 30 分鐘 , 進(jìn)行空間滅菌處理。4.1.3 操作人員用肥皂洗手 , 關(guān)閉紫外線殺菌燈 （ 或臭氧發(fā)生器 ） , 進(jìn)入緩沖間 , 換工作鞋。再用 0.1%苯扎溴銨 （ 新潔爾滅 ） 消 毒液洗手或乙醇棉球擦手 , 穿戴無(wú)菌衣、 帽、 口罩、 手套。4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手 , 再用乙醇棉球 （ 或碘伏棉球 ） 擦 拭供試品瓶、 盒、 袋等的開口處周圍 , 待干后用滅菌的手 術(shù)剪刀將供試品瓶、 盒、 袋啟封。啟封后先檢查包裝內(nèi)側(cè) 及周圍有無(wú)

6、生霉、 長(zhǎng)螨跡象 , 若經(jīng)證實(shí)為生霉、 長(zhǎng)螨即可 判為不合格 , 無(wú)須繼續(xù)檢驗(yàn)。4.1.5 定期檢查無(wú)菌環(huán)境的空氣是否符合規(guī)定。4.2 操作4.2.1 細(xì)菌、 霉菌與酵母菌4.2.1.1 以無(wú)菌操作 , 稱取檢樣 25g（ml）, 加入含 225ml 滅菌水 的具玻塞錐形瓶中 , 振搖 30min, 即為 1: 10 稀釋液。4.2.1.2 用滅菌吸管吸取 1: 10 稀釋液 10ml, 注入滅菌試管中 , 另用 1ml 滅菌吸管重復(fù)吹吸 50 次, 使霉菌孢子充分散開。4.2.1.3 取 1 支 1ml 滅菌吸管吸取 1: 10 均勻供試液 1ml, 沿管 壁加入裝有 9ml 滅菌稀釋劑的試

7、管中 , 混勻即 1: 100 供 試液。以此類推 , 根據(jù)供試品污染程度 , 可稀釋至 1: 103 或 1: 104, 細(xì)菌選擇兩至三個(gè)稀釋度 , 霉菌選擇三個(gè)稀釋 度。4.2.1.4 在進(jìn)行 10 倍遞增稀釋的同時(shí) , 以該稀釋級(jí)吸管吸取每 級(jí)稀釋液各 1ml 置每個(gè)滅菌平皿中 , 每稀釋級(jí)注 2個(gè)平皿。 另取 1 支 1ml 吸管吸取稀釋劑各 1ml 注入 2 個(gè)平皿中 , 作 為陰性對(duì)照。421.5 將融化并冷至約 45 C的培養(yǎng)基注入上述各個(gè)平皿約15ml, 以順時(shí)針或反時(shí)針方向快速轉(zhuǎn)動(dòng)平皿 （ 勿使培養(yǎng)基溢 出） 使供試液與培養(yǎng)基混勻 , 放置 , 待凝。4.2.1.6 將已凝固

8、的平板倒置于適宜溫度的培養(yǎng)箱中 , 培養(yǎng)。細(xì)菌于36C 士 1C培養(yǎng)48± 2小時(shí)，霉菌、 酵母菌于 2528 C培養(yǎng)，3天后開始觀察，共培養(yǎng)觀察5天。4.2.1.7 將平板置菌落計(jì)數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼用標(biāo)記筆點(diǎn)計(jì) , 以透視光襯以暗色背景 , 仔細(xì)觀察 , 計(jì)數(shù)。4.2.2 大腸桿菌取膽鹽乳糖培養(yǎng)基 3 份, 每份 100ml, 2 份分別加入規(guī)定量的 供試液 , 其中 1 份加入對(duì)照菌 50100個(gè)作陽(yáng)性對(duì)照 , 第 3 份加入 與供試液等量的稀釋液作陰性對(duì)照。培養(yǎng)18 24 小時(shí)（ 必要可延至 48 小時(shí) ） 。陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。 取上述 3 份的培養(yǎng)物各 0.2m

9、l, 分別接種至5ml MUG培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，分別于5小時(shí)與24小時(shí)時(shí)， 取未接種的MU（培養(yǎng)基管作本底對(duì)照，將各管置365nm紫外光下觀 察。陽(yáng)性對(duì)照管呈現(xiàn)熒光，MUCTO性。供試液的MUGf呈現(xiàn)熒光，MUG陽(yáng)性：無(wú)熒光，MUG陰性。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于MU（管內(nèi)，液面呈玫瑰紅色為陽(yáng)性，呈試劑本色為陰性。當(dāng)陰性對(duì)照呈陰性，陽(yáng)性對(duì)照正常生長(zhǎng)，供試液膽鹽乳糖培養(yǎng) 基培養(yǎng)液澄明，并證明無(wú)菌生長(zhǎng)，判未檢出大腸桿菌。供試液 MUG 陽(yáng)性，靛基質(zhì)陽(yáng)性，判檢出大腸桿菌；MUG陰性，靛基質(zhì)陰性，判 未檢出大腸桿菌。如MUG日性、靛基質(zhì)陰性，或MUG!性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，均應(yīng) 取供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)物劃線于

10、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板或麥 康凱瓊脂平板，培養(yǎng)1824小時(shí)，如上述供試液培養(yǎng)物的分離平 板無(wú)菌落生長(zhǎng)，判未檢出大腸桿菌?；蛴芯渖L(zhǎng)，應(yīng)挑選23可 疑菌落作靛基質(zhì)試驗(yàn)（I ）、甲基紅試驗(yàn)（M）、乙酰甲基甲醇 生成試驗(yàn)（V-P）、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C）及革蘭染色、鏡檢，按F表判斷結(jié)果MUG I曙紅亞甲藍(lán)瓊脂IMVic結(jié)果+ +檢出大腸桿菌一 一未檢出大腸桿菌+ 無(wú)菌生長(zhǎng)未檢出大腸桿菌+ 有菌生長(zhǎng)+ 檢出大腸桿菌 +有菌生長(zhǎng)+ + 檢出大腸桿菌注：如出現(xiàn)+或出現(xiàn)一+-,均應(yīng)重新分離菌株，再作MUG-I和IMVic試驗(yàn)。 革蘭氏陰性桿菌。4.2.3 沙門菌：取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 3份，每份100ml, 2份

11、分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對(duì)照菌液作陽(yáng)性對(duì)照，第3份加入與供試液 等量的稀釋液作陰性對(duì)照。培養(yǎng)1824小時(shí)，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。取其余2份培養(yǎng)物各1 ml,分別接種于四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng) 基10 ml中，培養(yǎng)1824小時(shí)。分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂 （或 沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞甲藍(lán)瓊脂） 培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時(shí)或延至4048小時(shí)。當(dāng)陽(yáng)性對(duì) 照的平板呈現(xiàn)陽(yáng)性菌落時(shí)，供試品的平板無(wú)菌落生長(zhǎng)，或有菌落但不同于下表所列特征時(shí)，可判為未檢出沙門菌鋰傘甘 培養(yǎng)基菌落形態(tài)膽鹽硫乳瓊脂無(wú)色至淺橙色，半透明，菌落中心帶黑色或全黑色或無(wú)色沙門、志賀困屬瓊脂無(wú)色至淡紅色，

12、半透明或不透明，菌落中心有時(shí)帶黑褐色曙紅亞甲藍(lán)瓊脂無(wú)色至淺橙色，透明或半透明，光滑濕潤(rùn)的圓形菌落麥康凱瓊脂無(wú)色至淺橙色，透明或半透明，菌落中心有時(shí)為暗色如供試品平板生長(zhǎng)的菌落特征有與上表所列形態(tài)特征相符或疑似者，均應(yīng)挑選23個(gè)菌落分別接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面 上,陽(yáng)性對(duì)照同時(shí)接種該培養(yǎng)基，培養(yǎng)1824小時(shí)后，陽(yáng)性對(duì)照 的斜面應(yīng)為紅色，底層為黃色，硫化氫陽(yáng)性，而供試品的疑似菌 斜面未見紅色、底層未見黃色，可判為未檢出沙門菌。否則，應(yīng)繼續(xù)做靛基質(zhì)試驗(yàn)、 脲酶試驗(yàn)、 賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、動(dòng)力檢查、血清凝集試驗(yàn)。5注意事項(xiàng)5.1供試品在檢驗(yàn)之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍 以防供試品內(nèi)污染菌因保

13、存條件不妥引起致死 , 損傷或繁殖。 供試品在檢驗(yàn)之前 , 應(yīng)保持原包裝狀態(tài) , 嚴(yán)禁開啟。包裝已開 啟的樣品不得作為供試品。5.2 除另有規(guī)定外 , 供試品制備成供試液后 , 應(yīng)在均勻狀態(tài)取樣。 制成供試液后 , 應(yīng)在 60 分鐘內(nèi)注皿操作完畢。5.3 配制后的培養(yǎng)基應(yīng)及時(shí)滅菌 , 避免細(xì)菌繁殖。 培養(yǎng)基不應(yīng)有沉 淀 , 如發(fā)生沉淀 , 應(yīng)趁熱過濾。5.4 制備妥的培養(yǎng)基應(yīng)在冷暗處保存 , 放置時(shí)間不能過長(zhǎng) , 錐形 瓶的瓊脂培養(yǎng)基保存時(shí)間最長(zhǎng)不能超過一個(gè)月 , 以免水分散 失染菌。5.5 勿用電爐直接融化瓊脂培養(yǎng)基 , 以免營(yíng)養(yǎng)成分過度受熱而破 壞。5.6注皿時(shí)培養(yǎng)基應(yīng)在 45 士 1 C ,咼于45 C時(shí)易造成細(xì)菌受損或致 死，低于45C時(shí)易凝固，因此使用