生物技術(shù)試驗(yàn)講義

1、生物工程專業(yè)實(shí)驗(yàn)講義適用于生物工程專業(yè) 曹飛制藥與生命科學(xué)學(xué)院二零零九年四月目錄實(shí)驗(yàn)一 發(fā)酵種子的制備1實(shí)驗(yàn)二 E.COli 和 Pseudomonas dacunhae 2021 發(fā)酵培養(yǎng)2實(shí)驗(yàn)三高速冷凍離心機(jī)的使用方法.3實(shí)驗(yàn)四固定化生物催化劑的制備4實(shí)驗(yàn)五游離細(xì)胞與固定化細(xì)胞酶活比擬 5實(shí)驗(yàn)六固定化生物催化劑的連續(xù)生產(chǎn)6實(shí)驗(yàn)七L- Asp的別離 7實(shí)驗(yàn)八L- Asp脫羧反響制備 L-Ala 6實(shí)驗(yàn)九離子交換樹脂別離L- Al a8實(shí)驗(yàn)原理:HOOCCOOH +實(shí)驗(yàn)流程:、實(shí)驗(yàn)原理與實(shí)驗(yàn)流程En zyme 1NH3-HOOCNH2XCOOHEn zyme 2NH2PS20217離子交換樹脂

2、預(yù)處理L 丙氨酸培養(yǎng)基配制滅菌實(shí)驗(yàn)一發(fā)酵種子的制備一、目的要求了解實(shí)驗(yàn)室種子制備過程。二、原理種子制備過程包括瓊脂斜面、固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)、搖瓶液體培養(yǎng)和種子罐 培養(yǎng)等多級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)室里，一般只進(jìn)行到搖瓶液體培養(yǎng)獲得發(fā)酵用種子。 不同菌種其具體制備方法不同，下列圖是菌種子制備過程示意圖。生產(chǎn)種子制備的一般流程三、試驗(yàn)及器材1. 菌種：斜面低溫保藏的大腸桿菌 E.coli 和Pseudomonasdacunhae202172. 培養(yǎng)基： E.coli種子培養(yǎng)基：牛肉膏 0.5%、NaCl 0.5%、 蛋白胨1%、 pH 7.67.8P.dacunhae 20217種子培養(yǎng)基：15g/L谷氨

3、酸鈉、蛋白胨8g/L、玉米漿5.5 g/L , KH 2PQ 0.5g/L ,MgSO 4 0.1g/L。3. 器材：天平、滅菌鍋、試管、三角瓶500mL四、操作方法1. 按種子培養(yǎng)基配方分別配制1000mL液體培養(yǎng)基，分裝于三角瓶中，每 瓶100mL，壓力1Kg/cm2滅菌30mins，結(jié)束后取出。2. 挑一環(huán)斜面低溫保藏的 E.coli和P.dacunhae 20217接于各自的種子培養(yǎng) 基中，37T培養(yǎng)24hs，轉(zhuǎn)速約150rpm。3. 種子瓶搖好后，及時(shí)接種到發(fā)酵罐。也可以在冰箱中短時(shí)間保藏。五、思考與討論1. 實(shí)驗(yàn)室種子制備的原那么是什么？2. 哪些參數(shù)對(duì)于實(shí)驗(yàn)室種子制備產(chǎn)生影響？實(shí)

4、驗(yàn)二 E.coli 和 Pseudomonas dacunhae2021 發(fā)酵培養(yǎng)一、目的要求1了解發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)，掌握發(fā)酵罐的根本操作技術(shù)。2了解發(fā)酵罐中微生物生長(zhǎng)的生長(zhǎng)特征。3. 掌握實(shí)驗(yàn)室中微生物從斜面f搖瓶f發(fā)酵罐的無菌操作培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)工 業(yè)化微生物生產(chǎn)過程作出初步了解。4. 掌握酶合成代謝調(diào)控機(jī)制。5. 掌握發(fā)酵工藝控制工藝。二、原理一定數(shù)量的微生物，接種于適宜的新鮮培養(yǎng)基中，在適宜的培養(yǎng)條件下，所 表現(xiàn)出的群體生長(zhǎng)特征可分為四個(gè)時(shí)期，即延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。 微生物在各個(gè)時(shí)期的生理特征各不相同。微生物的生長(zhǎng)過程是其總的代謝活動(dòng)的綜合表達(dá)， 每一種代謝途徑均由一些 特有的酶的

5、反響組成，同時(shí)微生物代謝具有高度的調(diào)節(jié)作用，通過本實(shí)驗(yàn)了解酶 合成的調(diào)節(jié)機(jī)制之一酶合成的誘導(dǎo)。三、試劑及器材1. 菌種：實(shí)驗(yàn)一液體培養(yǎng) 24h的E.coli和P.dacunhae 20217的實(shí)驗(yàn)室種子2. 發(fā)酵培養(yǎng)基：E.coli 發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿 4%、富馬酸 1%、K2HPO40.5%、MgSO40.25%、 NaCI0.1% (用氨水溶解富馬酸后再參加玉米漿和其他成分，用稀鹽酸調(diào)節(jié) pH為 7.5)，消泡劑 1-2mL，pH 7.5。P.dacunhae 20217發(fā)酵培養(yǎng)基：20g/L谷氨酸鈉、蛋白胨10 g/L、玉米漿 20 g/L , KHPO0.5g/L ,MgSO 0.1

6、g/L、消泡劑 1-2mL，用氨水調(diào) pH 至。121T，滅菌 20min。通氣，冷卻至 37C (E.coli)或 30C (P.dacunhae 20217)。4. 器材：發(fā)酵罐、滅菌鍋、721分光光度計(jì)、超凈工作臺(tái)、臺(tái)式高速離心機(jī)、 離心管、移液管。四、操作方法1. 按配方先后配制1000mL發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)pH7.5,裝入發(fā)酵罐中，包扎好各個(gè)進(jìn)氣口、出氣口和取樣口，保持121C下滅菌30mins,結(jié)束后取出放在發(fā)酵罐臺(tái)上冷卻。2. 待發(fā)酵點(diǎn)中的培養(yǎng)基冷卻至 37C( E.coli)或30C( P.dacunhae 20217) 左右時(shí)，用火環(huán)接種法將E.coli和P.dacunhae 2

7、0217種子液接發(fā)酵罐 中，接種量1015%控制溫度37C或30C，轉(zhuǎn)速約為300rpm,空氣流 速1L/min，發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間E.coli約12h、20217約18h，其中每間隔1-2hr 取樣測(cè)pH值和OD660值(樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋)紀(jì)錄發(fā)酵全過程中 pH值 和發(fā)酵液顏色變化，過程中鏡檢菌體生長(zhǎng)形態(tài)變化情況。3. 發(fā)酵結(jié)束后放罐、收集發(fā)酵液并測(cè)量其總體積(V)。吸取1 mL發(fā)酵液 于離心管中，放入臺(tái)式高速離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速 8000 rpm，時(shí)間10 min， 測(cè)濕菌體重(W 計(jì)算發(fā)酵產(chǎn)菌率。五、實(shí)驗(yàn)記錄E.coli 發(fā)酵：時(shí)間(h)0246789101112六、思考與討論1發(fā)酵培養(yǎng)基中碳、

8、氮源是什么？為什么采用富馬酸、L-谷氨酸為碳源?2 如何提高發(fā)酵效率。3.討論酶合成生產(chǎn)的調(diào)節(jié)方式。OD640pH顏色實(shí)驗(yàn)三高速冷凍離心機(jī)的使用方法一、目的要求1了解高速冰凍離心機(jī)的結(jié)構(gòu)、使用方法及考前須知。2. 掌握生物物質(zhì)、微生物菌體離心別離的原理。二、原理離心機(jī)是利用離心力對(duì)混合溶液進(jìn)行別離和沉淀的一種專用儀器，高速冰凍離心機(jī)在實(shí)驗(yàn)室別離和制備工作中是必不可少的工具，其最高速度可以到達(dá) 25000 rpm,最大離心力可達(dá)89000g。這類離心機(jī)通常帶有冷卻離心腔的制冷設(shè) 備，溫度控制是由裝在離心腔內(nèi)的熱電偶檢測(cè)離心腔的溫度。高速冰凍離心機(jī)有多個(gè)內(nèi)部可變換的角式或甩平式轉(zhuǎn)頭，它們大多用于收

9、集微生物菌種細(xì)胞碎片， 大的細(xì)胞器以及一些沉淀物等。三、試劑與器材E.coli發(fā)酵液、天平、高速冰凍離心機(jī)、離心管四、操作方法1. 使用前先檢查調(diào)速旋鈕、定時(shí)旋鈕等是否在“ 0處，離心管是否泄漏。2. 選擇適宜的轉(zhuǎn)頭安裝到離心腔內(nèi)承載轉(zhuǎn)頭的軸上。3. 接通電源，翻開電源開關(guān)。4. 將待離心的液體裝入適宜的離心管中，盛量不宜過多占管的2/3體積以免益處，蓋上離心管蓋，精密平衡離心管，并對(duì)稱的放入轉(zhuǎn)頭中。5. 調(diào)節(jié)速度旋鈕和定時(shí)旋鈕，至所需的速度和時(shí)間。6. 翻開起動(dòng)開關(guān)，并觀察離心機(jī)上的各個(gè)指示儀表是否正常工作。7. 離心結(jié)束后自動(dòng)關(guān)機(jī)、關(guān)閉冷凍開關(guān)、電源開關(guān)、切斷電源。8. 將轉(zhuǎn)頭取出，將離心

10、機(jī)的蓋子敞開放置。9. 收集離心物，洗凈離心管。五、實(shí)驗(yàn)記錄：發(fā)酵液體積，濕菌體重量 ，單位體積菌體得率，六、考前須知1. 高速離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭是鑲置在一個(gè)較細(xì)的軸上，因此精密的平衡離心管及內(nèi)含 物是十分重要的。2. 當(dāng)轉(zhuǎn)頭只是局部裝載時(shí)，管子必須相互對(duì)稱的放在轉(zhuǎn)頭上，以便使負(fù)載均勻 地分布在轉(zhuǎn)頭的周圍。3. 裝載溶液時(shí)，要根據(jù)離心管的具體操作說明進(jìn)行，要根據(jù)離心液體的性質(zhì)、 體積選擇適宜的離心管，液體不得裝的過多，以防離心時(shí)甩出，造成轉(zhuǎn)頭生銹或 者腐蝕。4. 每次使用時(shí)，要仔細(xì)檢查轉(zhuǎn)頭，及時(shí)清洗、擦干，轉(zhuǎn)頭是離心機(jī)中須重點(diǎn)保 護(hù)的部件，搬動(dòng)時(shí)不能碰撞，防止造成傷痕。轉(zhuǎn)頭長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)，要涂一層光蠟

11、 保護(hù)。5. 轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放置在冰箱或置于離心機(jī)的轉(zhuǎn)頭室內(nèi)預(yù)冷。6. 離心過程中不得隨意離開，應(yīng)隨時(shí)觀察李新機(jī)上儀表是否正常工作，并注意 聲音有無異常，以便及時(shí)排除故障。實(shí)驗(yàn)四固定化生物催化劑的制備一、目的要求1學(xué)會(huì)卡拉膠固定大腸桿菌的操作方法2了解工業(yè)化固定生物催化劑的工藝過程二、原理酶和細(xì)胞固定化方法主要有吸附法、包埋法、共價(jià)鍵結(jié)合法和交聯(lián)法等。本實(shí)驗(yàn)通過卡拉膠包埋法固定大腸桿菌細(xì)胞，掌握包埋法固定細(xì)胞的操作方法?？ɡz是由角叉菜提取的一種多糖，它含有許多硫酸根多糖，在存在下,它能立即發(fā)生凝膠作用，由此形成的固定化顆粒能在磷酸緩沖液和其他電解質(zhì)溶 液中使用，其穩(wěn)定性不受影響?？ɡz包埋法

12、即溫和又簡(jiǎn)單，可供多種酶和細(xì)胞 固定化使用。三、試劑及器材大腸桿菌細(xì)胞、卡拉膠、KCl、電爐、天平、恒溫水裕鍋、量筒、小刀、燒 杯四、操作方法1配制4%卡拉膠水溶液(A)，并冷卻至5560C。2配制菌懸液(B)，按濕細(xì)胞重與蒸餾水為1: 1 (g/mL)配制，并預(yù)熱至 5560C。3將A與B按4: 1 (mL/mL )混勻，冷至10C使凝膠強(qiáng)化，把所形成的 凝膠浸在0.3MKCI溶液中。4. 取出凝膠切成5X5mn大小的小塊。5測(cè)定固定化細(xì)胞顆粒的密度、床層空隙率、計(jì)算單位體積或重量固定化 顆粒中細(xì)胞包埋量。五、實(shí)驗(yàn)記錄：固定化細(xì)胞重量，六、思考與討論影響卡拉膠固定化細(xì)胞顆粒機(jī)械強(qiáng)度的因素有哪

13、些？實(shí)驗(yàn)五 游離細(xì)胞與固定化細(xì)胞酶活比擬一、目的要求掌握酶活測(cè)定和計(jì)算方法二、原理天門冬氨酸酶是催化富馬酸和氨轉(zhuǎn)化形成L-Asp的酶：NH2Ho。一 COOH + nHsHOOCCH測(cè)定發(fā)酵過程中游離細(xì)胞酶活和固定化E.coli細(xì)胞酶是評(píng)價(jià)發(fā)酵培養(yǎng)條件和固定化方法對(duì)大腸桿菌生產(chǎn) L-Asp能力影響的重要指標(biāo)之一。三、試劑與器材1試劑：富馬酸、氨水2器材：752分光光度計(jì)、離心機(jī)、電爐、三角瓶、燒杯四、操作方法1. 富馬酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作測(cè)定范圍 525/mL精確稱取0.5000g富馬酸，配制成0.5mg/mL母液，分別吸取母液0.1 ,0.2 , 0.3 , 0.4 和 0.5mL 母液，定容至

14、10mL 即成 5, 10, 15, 20, 25 卩g/mL富馬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)液 OD4o值，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。2. 1M富馬酸銨底物配制：內(nèi)含 1mM MgC2, pH為8.53. 游離細(xì)胞酶活力測(cè)定稱lg濕細(xì)胞，參加30mL底物溶液，于37C下振蕩反響1h,取出沸 水滅活，終止反響，離心，取上清液，進(jìn)行適當(dāng)稀釋，測(cè)OD4。4. 固定化細(xì)胞顆粒酶活力測(cè)定稱相當(dāng)于1g濕細(xì)胞的固定化細(xì)胞顆粒，加 30ML底物，于37E振蕩反響1h,取樣離心，適當(dāng)稀釋，測(cè) OD4。1 pg分子底物的酶量定5. 酶活定義：與上述反響條件下，每小時(shí)消耗 義為一個(gè)酶活單位。五、實(shí)驗(yàn)記錄：富馬酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：濃度ug

15、/mL051015202530OD240游離酶活力 固定化細(xì)胞活力 有效因子六、思考與討論1. 為什么采用紫外吸收能夠測(cè)定酶活力？2. 計(jì)算游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞酶活力，并進(jìn)行比擬，討論影響固定化細(xì)胞 的酶活力的因素。實(shí)驗(yàn)六固定化生物催化劑的連續(xù)生產(chǎn)一、目的要求了解固定化生物反響器的性能與反響器操作之間的關(guān)系二、原理添裝于固定床反響器中的具有天門冬氨酸酶活性的固定化大腸桿菌顆粒能連續(xù)的利用富馬酸和氨作為底物，使之轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)-Asp，其實(shí)驗(yàn)流程如下：底物貯槽一恒流泵一恒溫固定床反響器一產(chǎn)品液貯槽在其它反響條件不變的情況下，反應(yīng)器的性能隨反響器的操作流量即原料液在反響器中的停留時(shí)間而變化。三、試劑及器

16、材1 M富馬酸銨底物內(nèi)含1m MgC2 pH8.5 、固定床反響器、恒流泵、超級(jí) 恒溫水浴鍋、752分光光度計(jì)、燒杯、乳膠管。四、操作方法1. 將具有天冬氨酸酶活性的固定化大腸桿菌顆粒裝入固定床反響器中。 連續(xù)底物貯槽、循環(huán)水等，控制恒溫 37 C2. 調(diào)節(jié)恒流泵至一流量，待反響器流動(dòng)穩(wěn)定后測(cè)體積流量，并每隔0.5h取樣測(cè)0D4。值。3. 連續(xù)轉(zhuǎn)化4-6h生產(chǎn)L-Asp，測(cè)定最終ODk,計(jì)算富馬酸轉(zhuǎn)化率。五、實(shí)驗(yàn)記錄：反響器體積 固化細(xì)胞體積 床層空隙率時(shí)間h00.511.522.534OD240實(shí)驗(yàn)七 L-Asp的別離一、目的要求掌握發(fā)酵液轉(zhuǎn)化液預(yù)處理方法 掌握等電點(diǎn)沉淀法別離氨基酸的方法二

17、、原理富馬酸銨底物在天冬氨酸作用下轉(zhuǎn)化為 L-Asp，轉(zhuǎn)化液在低離子強(qiáng)度下，調(diào) pH值至等電點(diǎn)pl2.8使L-Asp所帶的靜電荷為零，可大大降低L-Asp溶解度， 使L-Asp沉淀出來。所得L-Asp結(jié)晶用水洗滌，不需進(jìn)行重結(jié)晶，即可制得純品。三、試劑及器材60% HSO、活性炭、布氏漏斗、電爐、烘箱、燒杯四、操作方法1. 過濾轉(zhuǎn)化液，除去其中顆粒狀雜質(zhì)，參加活性炭脫色，然后過濾，收集溶液、 測(cè)定其體積。2. 加熱濾液至90C,用60%2SQ調(diào)pH至2.8，然后在15C下保溫2h,即有L-Asp 結(jié)晶析出。3. 過濾收集L-Asp晶體，用蒸餾水淋洗，過濾得 L-Asp純晶體。4. 于烘箱中60

18、E烘干至恒重，稱重。五、實(shí)驗(yàn)記錄：L-Asp 質(zhì)量 ，單位時(shí)間生產(chǎn)能力，六、思考與討論1. 計(jì)算L-Asp理論得率和實(shí)際收率，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行討論。2. 計(jì)算固定化反響器生產(chǎn)L-Asp能力并討論之單位時(shí)間反響器生產(chǎn) L - ASP量固定化反響器中生產(chǎn)能力=反響器中顆粒床層總體積實(shí)驗(yàn)八 L- Asp脫羧反響制備L-Ala目的要求掌握L-Asp生物脫羧反響制備L-Ala的方法，以及反響-別離耦合方法制備 L-Ala的根本原理。二、原理NH2NH2HOOC COOHHOOC采用具有L-天冬氨酸脫羧酶的P.dacunhae 20217發(fā)酵液，在pH5-6的條件 下，不斷催化L-天冬氨酸脫羧產(chǎn)生L-丙氨酸。

19、L-天冬氨酸在水溶液中溶解度較 小，以固體形式存在，反響過程中伴隨著脫羧產(chǎn)生大量的CO氣泡，而產(chǎn)生的L-丙氨酸的溶解度較大，能夠局部溶解在發(fā)酵液中。但隨著L-丙氨酸的不斷生成，超過其飽和溶解度，就會(huì)在反響器內(nèi)析出。此后再添加L-天冬氨酸進(jìn)行脫羧反應(yīng)，就會(huì)形成邊底物溶解反響、邊產(chǎn)物生成析出的、連續(xù)的反響-別離耦合過程。三、試劑及器材P.dacunhae 20217發(fā)酵液、L-Asp、三角瓶、搖床。四、操作方法1. 取兩個(gè)三角瓶，各放置 P.dacunhae 20217發(fā)酵液100mL參加0.05gEDTA2. 各稱取5g L-Asp參加到發(fā)酵液中，控制pH5-6,放置在搖床上，控制37C,轉(zhuǎn)速低

20、于50rpm,進(jìn)行轉(zhuǎn)化；3. 待反響2h后，測(cè)定轉(zhuǎn)化液pH值，觀察搖瓶?jī)?nèi)底物是否溶解完全，是否產(chǎn)生氣泡。假設(shè)已經(jīng)完全溶解并產(chǎn)生大量氣泡，那么補(bǔ)加2g L-Asp，調(diào)節(jié)pH5-6。4. 此后，每隔1h觀察一次，并補(bǔ)加2g L-Asp ;5. 待反響10h后，將其中一瓶取下，準(zhǔn)備進(jìn)行離交別離，另外一瓶繼續(xù)進(jìn)行補(bǔ)加L-Asp至出現(xiàn)L-Ala晶體。五、實(shí)驗(yàn)記錄：1、 參加L-Asp量，2、取初始參加L-Asp、轉(zhuǎn)化6h和12h的轉(zhuǎn)化液進(jìn)行紙層析，觀察轉(zhuǎn)化 情況。六、思考與討論1. 反響-別離耦合反響過程有哪些類型？2. 參加EDTA勺目的是什么？實(shí)驗(yàn)九 離子交換法別離 L-Ala一、目的要求1. 學(xué)會(huì)

21、離子交換樹脂的預(yù)處理方法。2. 掌握離子交換樹脂的作用原理和操作技術(shù)。二、原理 離子交換樹脂是一種合成的高聚物， 不溶于水，能吸水膨脹。 高聚物分子由 能電離的性基團(tuán)及非極性的樹脂組成。 極性基團(tuán)上的離子能與溶液中的離子起交 換作用，而非極性的樹脂本身物性不變。 通常離子交換樹脂按所帶的基團(tuán)分為強(qiáng) 酸=R= S03H弱=COOH強(qiáng)堿=Nu R:和弱堿=NH舉 NH陰 NR2。離子交換樹脂別離小分子物質(zhì)如氨基酸、腺苷、腺苷酸等是比擬理想的。 但對(duì)生物大于物質(zhì)如蛋白質(zhì)是不適當(dāng)?shù)?，因?yàn)樗鼈儾荒軘U(kuò)散到樹脂的鏈狀結(jié)構(gòu) 中。故如別離生物大子、 可選用以多糖聚合物如纖維素、 葡聚糖為載體的離子交 換劑。本實(shí)驗(yàn)用磺酸陽(yáng)離子交換樹脂別離酸性氨基酸 天冬氨酸 、中性氨基酸 丙氨酸 的混合液。在特定的 pH 條件下，它們解離程度不同，通過改變脫液的 pH或離子強(qiáng)度可分別洗脫別離。三、試劑與器材 層析柱；磨口滴液漏斗；試管及試管架；紫外分光光度計(jì)、磺酸陽(yáng)離子交換樹脂 732樹脂，交換容量 4.5mmol/g 、 2molL HCl、2molL NaOH