淋巴細胞亞群檢測方案

1、目和相對比例都在一定的范圍內(nèi)。那么臨床常見的淋巴細胞亞群包括哪些項目?一、淋巴細胞亞群二、抗體組合方案聯(lián)合CD45的三色方案主要是有四種不同的試劑。1.CD45/CD3/CD4這個抗體組合主要用來檢測T3細胞和T4細胞。2.CD45/CD3/CD8用來檢測T3細胞和T8細胞。3.CD45/CD3/CD19用來檢測T3細胞和B細胞。4.CD45/CD3/CD16和/或CD56用來檢測T3細胞和NK細胞。(三雙色方案如果實驗室在邊遠的地區(qū),條件不足,只能做雙色方案,但是在雙色方案中建議要把CD3加進來,因為CD45能很好地將白細胞和其他的干擾細胞,尤其是紅細胞進行區(qū)分。如果不能用CD45,最好能用

2、到CD3,CD3可以特異的標記T淋巴細胞,T淋巴細胞和CD4做雙標可以克服單一的CD4抗體。為此,雙色方案中也分為四管,每管當中建議都包含有CD3。1.CD3/CD4用來檢測T3細胞和T4細胞。2.CD3/CD8用來檢測T3細胞和T8細胞。3.CD3/CD19用來檢測T3細胞和B細胞。4.CD3/CD16和/或CD56用來檢測T3細胞和NK細胞。盡管檢測條件不允許做四色或三色的分析,但也至少要用CD3和其他的直標抗體進行雙免疫熒光染色方案,不建議采用單色方案進行淋巴細胞亞群分析。(四7-氨基放線菌素D(7-AAD聯(lián)合CD45方案1.目的對于超過24小時的標本或肉眼觀察發(fā)現(xiàn)已經(jīng)變質(zhì)的標本,需使用

3、7-氨基放線菌素D(7-AAD結(jié)合CD45(評估淋巴細胞、單核細胞和粒細胞死亡復染評估細胞活力。2.判定7-AAD熒光染料主要染活細胞,主要用來鑒定細胞活性。(17-AAD陰性者是活細胞群。(27-AAD陽性者為細胞膜不完整的死細胞群。(37-AAD陰性細胞群陰性細胞群計數(shù)為75%時為最低細胞活力。(4對于細胞活力低于75%的標本,建議采用7-AAD結(jié)合CD45的方案,包括的組合方案。三、數(shù)據(jù)采集和分析(一聯(lián)合CD45和SSC設門確定淋巴細胞群方案1和方案2都存在CD45,首先建議采用聯(lián)合CD45和側(cè)向散射光SSC設門來確定淋巴細胞群。它是準確分析淋巴細胞亞群的第一步,可以用于來定位淋巴細胞群

4、,把淋巴細胞群找到,排除標本中非淋巴細胞或細胞碎片的干擾。首先在CD45/SSC散點圖中,調(diào)整SSC,使所有白細胞群均可見。第二步是根據(jù)CD45強陽性細胞群設門或者劃定區(qū)域。因為在CD45染色細胞中,淋巴細胞群呈現(xiàn)CD45強陽性和SSC弱表達。設門時盡可能包括所有淋巴細胞,儀器會給一個提示,一共是包括了多少淋巴細胞數(shù)。一般門內(nèi)淋巴細胞數(shù)不低于95%,而且要排除單核細胞和嗜堿細胞的感染,因為單核和嗜堿在周圍,很容易對淋巴細胞進行干擾。單核細胞的CD45呈弱表達,而SSC呈中等強度表達。嗜堿性粒細胞的CD45和SSC均為低表達。如果不能確定標記的淋巴細胞群是否被設門設的比較準確,里面是否含有其他細

5、胞的干擾,還有一個辦法就是將CD3/SSC、CD19/SSC以及 CD56或CD(16+56/SSC中T細胞、B細胞和NK細胞的分布特征篩選出來,并在CD45/SSC雙參數(shù)散點圖中顯示,以監(jiān)測設門的準確性。當設門準確了,準確的找到淋巴細胞后,才能采集細胞數(shù)。第三步,采集細胞數(shù)。非設門熒光散點圖中,每一熒光通道至少收集5000個淋巴細胞,以確保對數(shù)量較少的淋巴細胞亞群(如占總淋巴細胞數(shù)的10%提供足夠量的細胞。 從上面的圖片上可以看到,圖形中畫黑框、標記是紫色的細胞是淋巴細胞群,在它的上方是單核細胞,用紅顏色標記,嗜堿性細胞CD45和SSC的表達較低,用粉顏色標記的。(二淋巴細胞亞群分析和相對計

6、數(shù)首先在亞群分析時設置幾個散點圖:CD3/CD4散點圖、CD3/CD8散點圖、CD3/CD19散點圖、CD3/CD56或CD(16+56散點圖。散點圖設置完后,在每一個熒光散點圖中再設一個四象限門,將CD45/SSC散點圖中選定的淋巴細胞群中的表達該抗原的陰性細胞群和陽性細胞群區(qū)分開來。 第三步,進行淋巴細胞亞群計數(shù)。T4細胞的計數(shù),一般先得到一 個相對計數(shù),也稱為百分比,比如CD3/CD4散點圖中CD3+CD4+細胞群占CD45/SSC散點圖中選定淋巴細胞群的百分比,這叫做T4細胞的相對計數(shù)百分率。它占的是前一個散點圖,在第一次設門的散定圖中淋巴細胞的百分率。T8細胞相對計數(shù)是CD3/CD8

7、散點圖中CD3+CD8+細胞群占CD45/SSC散點圖中選定淋巴細胞群的百分比。B淋巴細胞計數(shù)是CD3/CD19散點圖中CD3-CD19+細胞群占CD45/SSC散點圖中選定淋巴細胞群的百分比。NK細胞相對計數(shù)是為CD3/CD56或CD(16+56散點圖中CD3-CD56+細胞群或CD3-CD(16+56 +占CD45/SSC散點圖中選定淋巴細胞群的百分比。T3細胞的百分率在四個散點圖中都可以計數(shù),因為每一個散點圖中都含有CD3的標記。在CD3/CD4散點圖中,計數(shù)為CD3+CD4-單陽性細胞群百分比和CD3+CD4+雙陽性細胞群百分比的總和。在CD3/CD8散點圖中也一樣,計數(shù)為CD3+CD

8、8-單陽性細胞群百分比和CD3+CD8+雙陽性細胞群百分比的總和。在CD3/CD19散點圖中,計數(shù)為CD3+CD19-細胞群百分比。在CD3/CD56或CD3/CD(16+56散點圖中,計數(shù)為CD3+CD56-或CD3-CD(16+56-百分比和CD3+CD56+或CD3+CD(16+56+百分比的總和。(三淋巴細胞亞群的絕對計數(shù)根據(jù)淋巴細胞亞群相對計數(shù)結(jié)果,對于絕對計數(shù)來講,通常有兩種絕對計數(shù)的方法,一個是單平臺法,一個是雙平臺法。單平臺方法是采用了一個內(nèi)部的計數(shù),計數(shù)的微球。所有的數(shù)據(jù)都可以從流式細胞儀這一臺儀器檢測到,由專用軟件直接計算生成,具體操作可以試劑操作說明書。雙平臺方法,白細胞

9、計數(shù)需要與亞群分析使用同一標本進行測試,并在6個小時內(nèi)完成。當白細胞計數(shù)不能準確獲得時,不能用DP方法進行淋巴細胞絕對計數(shù),只能采用SP方法。不能采用淋巴細胞計數(shù)來計算淋巴細胞亞群絕對計數(shù)。因為淋巴細胞計數(shù)在血細胞分析儀上表現(xiàn)出更大變異度,白細胞計數(shù)作為分母比淋巴細胞計數(shù)更為穩(wěn)定。(四數(shù)據(jù)分析可靠性的驗證1. CD45在有些驗證中要采用CD45,CD45在三色和四色抗體組合方案的每一標本管中均存在,這樣它既可以對淋巴細胞群進行設門,因為它在每一管中都存在,也可以根據(jù)CD45表達情況和圖形分布情況檢測和評估樣本管間的變異,所以這是一個很好的一個驗證方法。重復結(jié)果間的差異如果大于( 說明樣本管間的

10、變異較大四、對照對于淋巴細胞亞群來講，同型對照是不需要的，因為CD3、CD4和CD8的陽性細胞群和陰性細胞群都是 獨立成群，很容易區(qū)分，所以同型對照的意義不大。 （二）陽性對照 需要陽性對照，分為針對方法學的陽性對照，以及針對試劑的陽性對照。 1.針對方法學的陽性對照 （1）目的 主要是監(jiān)測流式細胞儀上機分析前的環(huán)節(jié)是否出現(xiàn)問題，包括裂解是不是完全、是不是染色效果很 差。當由于紅細胞裂解不完全或染色較差時，包括陽性對照在內(nèi)的所有的標本結(jié)果都會出現(xiàn)偏差，所以這 時陽性對照如果不好，就提示上機前的染色環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題。 （2）種類 陽性對照可以用全血標本來做，也可以用商品化熒光微球試劑。 （3）使用頻

11、率 每次上機前都需要做陽性對照。 2.評價試劑的陽性對照 （1） 目的 檢測新批號試劑和當前批號試劑的染色效率是否出現(xiàn)問題，當懷疑試劑出現(xiàn)問題時，采用該試劑與已 知可接受性能批號的試劑同時操作進行驗證。 （2）種類 陽性對照可以是全血標本，也可以是凍干淋巴細胞。 （3）使用頻率 一般是在更換試劑前后來做。 所謂“補償”就是除去某一熒光素誤入到其它熒光通道中的發(fā)射光信號， 那么為什么需要進行調(diào)整熒光補償？ 五、調(diào)整熒光補償 （一）目的 對于淋巴細胞亞群分析至少要采用雙色方案，最好采用四色方案，所以熒光補償是非常重要的，表達 一個檢測結(jié)果是否有準確，完全受到的干擾是熒光補償，是一個重要的因素。當光

12、學檢測通道的電壓及增 益發(fā)生變動，當儀器維修保養(yǎng)后，都要對補償進行驗證或重新調(diào)整。 （二）方法 6 調(diào)整的方式有手工的方式，還有軟件自動補償方式。 （三）補償試劑的選擇 1.一般選擇與最強熒光信號相匹配的補償試劑。 2. 三色抗體組合分析 三色抗體組合分析時要通過含有熒光微球或細胞補償顆粒的4個單標記樣本管來調(diào)整補償。第一管是 無直標抗體標本管，只有標本沒有抗體。第二管是僅含有FITC直標抗體的陽性標本管。第三管是僅含PE直 標抗體的陽性標本管。第四管是僅含第三種直標抗體的陽性標本管。 3.四色抗體組合分析 可以在三色抗體組合的基礎上再加上一管，也就是第五個管子，第五管是僅含有第四種直標抗體陽

13、性 標本管。 （四）熒光補償順序 1.三色組合方案 依次是FITC、PE和第三種熒光。先做FITC，然后PE，再做第三種熒光。補償達到一個理想狀態(tài)是將不 應該是兩種熒光抗體雙陽性的細胞群調(diào)整到相應的直角熒光象限中，使雙陽象限中無熒光重疊。要避免過 度補償，以防將雙陽性細胞錯誤地識別為單陽性細胞。 2.四色組合方案 一般試劑說明書有一個很好的說明，可以按照說明書進行執(zhí)行，要注意避免過度補償。 六、結(jié)果報告和審核 （一）臨床報告的內(nèi)容 對于淋巴細胞亞群所出的臨床報告，一般有以下幾個內(nèi)容：T3細胞相對計數(shù)(百分比/絕對計數(shù)(絕對 值、T4細胞相對計數(shù)(百分比/絕對計數(shù)(絕對值、T8細胞相對計數(shù)(百分

14、比/絕對計數(shù)(絕對值、B細胞 相對計數(shù)(百分比/絕對計數(shù)(絕對值、NK細胞相對計數(shù)(百分比/絕對計數(shù)(絕對值 、T4/T8比值、參考 范圍、必要的解釋和分析。 （二）審核內(nèi)容 審核的內(nèi)容包括有數(shù)據(jù)采集閾值的設定、采集細胞數(shù)和微粒數(shù)、散射光模式、抗體組合方案，與試劑 結(jié)果相關的所有設門。在發(fā)出報告之前，要把這些方面的內(nèi)容都進行一個審核，審核確認無誤后才能將結(jié) 果發(fā)放給臨床。 七、儲存 （一）采用列表模式儲存標本數(shù)據(jù) 數(shù)據(jù)在儲存方面也有一定的要求，要把所有的原始數(shù)據(jù)進行儲存，所以一般采用的是列表模式，儲存 標本數(shù)據(jù)，以確保對原始數(shù)據(jù)進行全面分析。 7 （二）采用紙質(zhì)文件或電子版 儲存的內(nèi)容包括：每

15、個樣本CD45和SSC淋巴細胞群設門圖，顯示淋巴細胞亞群的所有的熒光散點圖的 分析結(jié)果，針對淋巴細胞亞群的室內(nèi)質(zhì)控圖以及室間質(zhì)評數(shù)據(jù)，評估檢測系統(tǒng)性能的所有參數(shù)，包括分析 區(qū)域、分析結(jié)果，以備進行一個復核。 （三）儲存期限 一般建議保留兩年所有的數(shù)據(jù)。 八、質(zhì)量控制 （一）室內(nèi)質(zhì)量控制 要求每月進行室內(nèi)控制檢測，對于特殊實驗如艾滋病T4細胞計數(shù)建議每周進行一次。 （二）室間質(zhì)量評價 推薦使用衛(wèi)生部臨檢中心和美國病理學家協(xié)會（CAP）的室進質(zhì)評。 （三）人員培訓 流式細胞儀檢測由于技術要求含量較高，要完成流式細胞儀廠家的基本培訓，同時也要完成專業(yè)操作 培訓班的定期培訓。 淋巴細胞亞群最常見的有5個項目，包括T細胞、B細胞、NK細胞、CD4+T細 胞和CD8+T細胞。這5個項目具有明確的臨床意義，也是臨床應用最廣的檢測項 目，非常適合檢