研究蛋白質(zhì)凝聚凝膠的技術(shù)進(jìn)展

1、爭(zhēng)辯蛋白質(zhì)分散凝膠的技術(shù)進(jìn)展摘要由于蛋白質(zhì)形成的凝膠會(huì)影響食品的質(zhì)構(gòu)和品質(zhì),所以爭(zhēng)辯蛋白質(zhì)凝膠對(duì)于食品科學(xué)有極其重要的意義。然而,蛋白質(zhì)形成凝膠的機(jī)理過(guò)于簡(jiǎn)單,需要更先進(jìn)的技術(shù)來(lái)爭(zhēng)辯。介紹了用于蛋白質(zhì)凝膠爭(zhēng)辯的最新技術(shù)進(jìn)展,如原子力顯微鏡(AFM),共聚焦激光顯微鏡(CSLM)和漫射波光譜(DWS)。與傳統(tǒng)爭(zhēng)辯凝膠的方法如動(dòng)態(tài)流變儀和掃描電子顯微鏡(SEM)相比,這些新方法簡(jiǎn)化了樣品的預(yù)處理,有實(shí)現(xiàn)在線測(cè)定的可能。由于樣品處于自然狀態(tài),所以反映的信息更具有真實(shí)性,加上高辨別率,可以實(shí)現(xiàn)蛋白形成凝膠過(guò)程分子水平的可視化。因此,接受以上的新技術(shù)可以為爭(zhēng)辯蛋白凝膠的形成供應(yīng)更多的信息。分散和凝膠過(guò)程

2、對(duì)食品加工起著重要的作用,它們能形成食品所需要的質(zhì)構(gòu),也會(huì)帶來(lái)不需要的沉淀或是分層現(xiàn)象。因此,爭(zhēng)辯膠體形成的特性對(duì)于穩(wěn)定和形成食品所需結(jié)構(gòu)格外重要,并且通過(guò)把握凝膠反應(yīng)優(yōu)化食品加工過(guò)程,提高食品品質(zhì)。對(duì)于食品體系的凝膠和分散已經(jīng)有了深化的爭(zhēng)辯,但分散凝膠現(xiàn)象還鮮有報(bào)道。由于爭(zhēng)辯凝膠過(guò)程有以下困難:首先,蛋白和多糖是大分子,三維結(jié)構(gòu)描述和定量困難。其次,凝膠過(guò)程是一個(gè)簡(jiǎn)單的反應(yīng)體系1。例如,球蛋白的凝膠過(guò)程,通常分為蛋白分子開(kāi)放,解聚和聚合,分散2的步驟。在熱變性的過(guò)程中,自然蛋白分子伸展,暴露出功能性基團(tuán)(如巰基和疏水基團(tuán))。隨后,為了降低體系的能量,蛋白通過(guò)形成二硫鍵或疏水相互作用發(fā)生分散3

3、-4。當(dāng)?shù)鞍诐舛雀哂谛纬赡z的臨界點(diǎn)時(shí),分散連續(xù)進(jìn)展形成凝膠結(jié)構(gòu)。在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中,最終的凝膠和分散體的結(jié)構(gòu)受環(huán)境因素影響(蛋白濃度、pH、離子強(qiáng)度、溫度等)很大。食品是個(gè)簡(jiǎn)單的體系,一些成分會(huì)影響蛋白分散凝膠的過(guò)程如蛋白蛋白的相互作用,通過(guò)轉(zhuǎn)變二硫鍵形成、疏水相互作用、氫鍵或是范德華力,轉(zhuǎn)變形成凝膠體的凝膠特性5。此外,接受傳統(tǒng)的分析手段難以獲得更加深化真實(shí)的凝膠形成信息。盡管接受動(dòng)態(tài)流變儀、顯微鏡和動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)可以分析凝膠形成過(guò)程,但是這些方法主要通過(guò)分析分散發(fā)生過(guò)程時(shí)粒子尺寸或是彈性模量G的變化來(lái)進(jìn)行爭(zhēng)辯6-9,通常需要簡(jiǎn)單繁瑣的樣品前處理過(guò)程,如稀釋、機(jī)械變形、干燥、凍干等,這些處理

4、睬破壞易裂開(kāi)的弱凝膠,影響亞穩(wěn)定體系。因此,保持體系接近原始自然狀態(tài)對(duì)于考察物理化學(xué)因素對(duì)于凝膠最終質(zhì)構(gòu)的影響格外重要。抱負(fù)的分析方法應(yīng)當(dāng)是非破壞性的、非干擾性的技術(shù),可以讓樣品處于自然狀態(tài)下測(cè)定,從而獲得處于軟凝膠狀態(tài)下,凝膠相互作用的信息10。伴隨科技的進(jìn)展,一些新的非破壞性的技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)凝膠和分散的爭(zhēng)辯中。文章論述了原子力顯微鏡(AFM),激光共聚焦顯微鏡(CSLM)和散射光波譜(DWS)用于食品蛋白質(zhì)分散凝膠的爭(zhēng)辯。在我國(guó),雖然原子力顯微鏡已經(jīng)廣泛用于多糖結(jié)構(gòu)的爭(zhēng)辯11-13,但是用于蛋白質(zhì)凝膠和分散的爭(zhēng)辯報(bào)道還很少。1AFM用于蛋白質(zhì)分散凝膠AFM起源于隧道掃描顯微鏡技術(shù),它廣泛

5、應(yīng)用于生物、物質(zhì)結(jié)構(gòu)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域。AFM用于食品科學(xué)中以下六個(gè)方面14:AFM可以定性描述食品大分子的結(jié)構(gòu);通過(guò)AFM成像供應(yīng)的結(jié)構(gòu)參數(shù)描述食品加工和儲(chǔ)存過(guò)程中定量分析分子結(jié)構(gòu)變化;顯示不同分子之間的相互作用;為操控食品大分子供應(yīng)條件;描述食品表面因物理特性變化而帶來(lái)的微小變化;加工納米食品的工具。1. 1AFM的原理AFM的成像是通過(guò)“感覺(jué)”而非“觀看”樣品。在AFM觀測(cè)樣品時(shí),一個(gè)安裝在懸臂上的尖端掃描樣品表面,通過(guò)記錄懸臂的偏斜,通過(guò)激光二極管發(fā)出的激光照射在懸臂的末端,經(jīng)過(guò)鏡面反射把激光放射到光電二極管檢測(cè)器上,得到懸臂偏斜的信號(hào)。當(dāng)掃描樣品時(shí),樣品表面的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)通過(guò)尖端和樣品力

6、的變化使懸臂發(fā)生偏斜。通過(guò)電腦處理懸臂偏斜變化形成樣品表面三維結(jié)構(gòu)15。AFM的觀測(cè)模式有三種:接觸、非接觸和小扣。在接觸模式中,尖端始終與樣品表面接觸,而非接觸模式中,懸于空氣中的尖端僅于樣品表面吸附水層接觸而不與樣品接觸。小扣模式中,尖端與樣品間歇接觸,通常每秒接觸300 000次,削減接觸模式中產(chǎn)生的剪切力對(duì)于樣品的破壞,這種模式通常適宜那些質(zhì)地偏軟的食品和生物樣品。1. 2AFM的特點(diǎn)與傳統(tǒng)的電子和一般光學(xué)顯微鏡相比,AFM具有以下優(yōu)點(diǎn)14, 16。具有高辨別率和大的放大倍數(shù)。AFM沒(méi)有透鏡,因此不受衍射極限或者球面像差的限制,對(duì)于某些樣品可以實(shí)現(xiàn)原子級(jí)別的辨別率。簡(jiǎn)化樣品處理的過(guò)程。

7、AFM是非破壞的分析方法,不需要染色或是覆膜處理,也不用高能量的粒子流,不需要導(dǎo)電襯底,不受樣品稠度的影響,觀測(cè)時(shí)樣品可以處于溶液中,基本達(dá)到在自然狀態(tài)下或是近似自然狀態(tài)下觀測(cè)樣品?？赏瑫r(shí)得到樣品的二維和三維成像。可以連續(xù)的觀測(cè)樣品變化,所以可以直接觀測(cè)正在進(jìn)行的反應(yīng)過(guò)程。如酶反應(yīng)的過(guò)程。為操控大分子和調(diào)查大分子之間的相互作用供應(yīng)了可能。然而,目前AFM也有以下缺點(diǎn):相對(duì)較小的掃描面積,較慢的掃描速度,對(duì)于過(guò)于軟的樣品成像困難等1. 3AFM在蛋白分散和凝膠上的應(yīng)用AFM能有效地供應(yīng)凝膠結(jié)構(gòu)信息,進(jìn)而補(bǔ)充流變儀或化學(xué)分析蛋白分散結(jié)構(gòu)信息。AFM可以成功的反映乳清蛋白熱分散現(xiàn)象,爭(zhēng)辯發(fā)覺(jué)乳清蛋白

8、分散體顯示了同-乳球蛋白分散體相像的微觀結(jié)構(gòu)17。在pH 7時(shí),無(wú)論NaCl濃度如何變化,乳清蛋白分散體主要由橢球形微粒構(gòu)成。以上爭(zhēng)辯結(jié)果對(duì)于理解不同條件下得到的熱導(dǎo)致乳清蛋白凝膠特性差異供應(yīng)了基礎(chǔ)。接受小扣模式AFM觀看到加熱后-乳球蛋白,發(fā)覺(jué)它形成一種有規(guī)律的纖維結(jié)構(gòu),長(zhǎng)度約25nm,厚度是1或2個(gè)蛋白單體14。這證明在低pH低離子強(qiáng)度下,形成的熱導(dǎo)致-乳球蛋白纖維體需要進(jìn)行兩步以上的反應(yīng)。Iwasaki等14接受AFM分析加熱對(duì)于肌漿球蛋白絲形態(tài)的影響,發(fā)覺(jué)在70時(shí)原來(lái)的串珠結(jié)構(gòu)變成繩子結(jié)構(gòu),但是少量蛋白絲的結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯變化。Yang等18使用AFM觀看鯰魚(yú)凝膠結(jié)構(gòu),發(fā)覺(jué)鯰魚(yú)凝膠中具有平

9、均直徑為118 nm的環(huán)形孔洞球形分散體的平均直徑為267 nm。他們認(rèn)為球狀分散體和環(huán)形孔洞的形成與水和離子滲透過(guò)正在水解膠原質(zhì)時(shí)的方式有關(guān)。AFM能從分子水平上解釋食品流變學(xué)特性的差異,從力學(xué)的角度揭示蛋白分散特性。Iwasaki等19報(bào)道了接受AFM分析由熱導(dǎo)致和壓力導(dǎo)致的細(xì)絲狀肌漿球蛋白凝膠中的串珠結(jié)構(gòu)和彈性之間的關(guān)系。近期消滅的階段成像,力調(diào)制模式等新技術(shù),使AFM能夠定量測(cè)定物質(zhì)彈性。AFM也應(yīng)用于分析蛋白分散動(dòng)力學(xué)。Yay等20使用AFM分析接受GDL導(dǎo)致不同大豆蛋白分散的過(guò)程。將11S、7S、2S在100加熱10 min后,加入GDL,接受AFM觀測(cè)它們形成不同的分散曲線。單位

10、時(shí)間內(nèi), 11S形成體積最大的分散團(tuán), 2S形成的分散團(tuán)其次, 7S的分散團(tuán)最小,所以可以推想11S的分散速度最快, 7S最小。雖然AFM已經(jīng)成功地運(yùn)用于食品蛋白凝膠領(lǐng)域,但是對(duì)于觀測(cè)高度簡(jiǎn)單的真實(shí)食品體系,還存在不足,有太多其他組分和組分間相互作用會(huì)干擾對(duì)調(diào)查對(duì)象的分析。但是隨著技術(shù)的進(jìn)展,AFM必定會(huì)廣泛的應(yīng)用于真實(shí)的食品體系。2CSLM用于蛋白分散凝膠與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡相比,由于接受自動(dòng)的顯微鏡技術(shù)、熒光探針技術(shù)、高容量和高強(qiáng)度的圖片處理軟件等先進(jìn)技術(shù),CSLM具有很高的放大倍數(shù)和高的辨別率。CSLM已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于分子生物學(xué)21、免疫學(xué)、藥劑學(xué)22、基因?qū)W、生理學(xué)23等領(lǐng)域。2. 1C

11、SLM的原理利用激光束通過(guò)光柵針孔形成點(diǎn)光源,在熒光標(biāo)記標(biāo)本的焦平面上逐點(diǎn)掃描,采集點(diǎn)的光信號(hào)通過(guò)探測(cè)針孔到達(dá)光電倍增管(PMT) ,再經(jīng)過(guò)信號(hào)處理,在計(jì)算機(jī)監(jiān)視屏上形成圖像。CLSM接受共聚焦技術(shù)在物鏡的焦平面上放置了1個(gè)帶有小孔的擋板,平面以外的雜散光被攔住,消退了球差,并進(jìn)一步消退了色差,且可將樣品分解成二維或三維空間上的很多點(diǎn),用格外細(xì)小的激光束(點(diǎn)光源)逐點(diǎn)逐行掃描成像,再通過(guò)微機(jī)組合成1個(gè)平面的或立體的圖像24-25。2. 2CSLM的特點(diǎn)CSLM已經(jīng)漸漸用于食品微結(jié)構(gòu)的爭(zhēng)辯,有如下特點(diǎn)26:避開(kāi)固定或者脫水操作,避開(kāi)破壞樣品,因此削減了樣品制備的時(shí)間和對(duì)樣品性質(zhì)的轉(zhuǎn)變;熒光探針的

12、使用可以特定觀看食品的某種成分,提高檢測(cè)的靈敏性和特異性;食品結(jié)構(gòu)的變化可以連續(xù)的監(jiān)測(cè);“光切片”技術(shù)可以確保不破壞微觀結(jié)構(gòu)的條件下,觀測(cè)表面以下不同深度切面的微觀結(jié)構(gòu)。雖然CSLM有諸多優(yōu)點(diǎn),但是CSLM還有以下缺點(diǎn):受衍射極限的限制, CSLM觀測(cè)某些蛋白和酪蛋白膠束的辨別率最高達(dá)到0. 2m以上;同時(shí)某些與樣品接受共價(jià)鍵結(jié)合的熒光探針會(huì)轉(zhuǎn)變樣品結(jié)構(gòu)的影響27。此外,熒光信號(hào)漸漸減弱,會(huì)影響測(cè)定結(jié)果;掃描速度慢,并且目前CSLM不能檢測(cè)靜止的食品體系。2. 3CSLM在蛋白分散凝膠中的應(yīng)用由于CSLM適宜觀看處于自然狀態(tài)下食品體系28,所以CSLM已經(jīng)用于分析食品膠體,如蛋白-多糖相分別,

13、蛋白凝膠結(jié)構(gòu),乳化和泡沫穩(wěn)定性29-34。CSLM可以用于測(cè)定膠體形成動(dòng)態(tài)過(guò)程26。CSLM已經(jīng)觀測(cè)了接受凝乳酶導(dǎo)致全脂牛奶和低脂牛奶形成凝膠的過(guò)程。起初,酪蛋白呈現(xiàn)出粒徑小于0. 5m微小分散的小顆粒, 15 min后,酪蛋白顆粒開(kāi)頭發(fā)生分散,最終凝膠形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。從CSLM分析發(fā)覺(jué),除了在低脂牛奶中脂肪球個(gè)數(shù)遠(yuǎn)少于全脂牛奶和凝膠速度低于全脂牛奶以外,低脂牛奶和全脂牛奶凝膠過(guò)程相像。接受CSLM觀測(cè)GDL導(dǎo)致的凝膠過(guò)程時(shí),發(fā)覺(jué)在加入GDL后1-20 min(pH 6. 515. 64),一些粒徑小于1m蛋白微粒在各個(gè)方向上隨機(jī)快速運(yùn)動(dòng), 30 min后, pH下降到5. 58時(shí),粒徑小于

14、2m牛奶蛋白的分散體成為體系的主體。開(kāi)頭發(fā)生凝膠化并形成可見(jiàn)的蛋白網(wǎng)絡(luò)是在pH 5. 4,而此時(shí)蛋白已經(jīng)完全靜止。CSLM能夠清楚的描述在分散凝膠過(guò)程中大分子之間的相互作用,如多糖蛋白、蛋白蛋白。Sittikijyothin等35使用CSLM爭(zhēng)辯由-乳球蛋白和他拉膠形成的混合膠。單純的-乳球蛋白凝膠呈現(xiàn)均質(zhì)性,而混合膠具有兩個(gè)相。-乳球蛋白發(fā)生分散后,形成富含蛋白的連續(xù)相,他拉膠構(gòu)成分散相。他拉膠濃度顯著影響混合膠的微觀結(jié)構(gòu),當(dāng)增加他拉膠濃度時(shí),會(huì)產(chǎn)生更具有開(kāi)放性和不均勻的混合膠結(jié)構(gòu)。GonCalves等36爭(zhēng)辯由-乳球蛋白和刺槐豆膠形成混合膠也具有相像的結(jié)構(gòu)36。Schmitt等37接受CS

15、LM爭(zhēng)辯發(fā)覺(jué):總濃度為1%的-乳球蛋白和阿拉伯膠,與總濃度1%的全溶-乳球蛋白和阿拉伯樹(shù)膠形成的凝膠完全不同。球狀混合聚集物的沉淀平衡系數(shù)受構(gòu)成聚集層的兩種物質(zhì)比例的影響。當(dāng)?shù)鞍诐舛壬仙龝r(shí),產(chǎn)生尺寸巨大、數(shù)量眾多沉淀,這些沉淀由阿拉伯樹(shù)膠包圍的蛋白質(zhì)分散團(tuán)組成。而分散團(tuán)由含有單個(gè)小泡顆粒(氣泡表觀直徑410m)和含有泡沫顆粒(氣泡大小相對(duì)均一,直徑在24m)構(gòu)成。在全溶-乳球蛋白和阿拉伯樹(shù)膠形成分散體系中主要是含有單個(gè)氣泡的顆粒團(tuán)。產(chǎn)生不同微粒的緣由是:-乳球蛋白和全溶-乳球蛋白的分散性不同造成的。CSLM供應(yīng)了加熱乳清蛋白和-乳球蛋白可以形成簡(jiǎn)單的凝膠網(wǎng)絡(luò)的證據(jù)。疏水相互作用和氫鍵誘導(dǎo)-乳球

16、蛋白分子吸附到乳清蛋白上39。這一點(diǎn)在CSLM的照片上可以清楚地看到二者的熒光信號(hào)重合在相同的區(qū)域。此外,CSLM還顯示-乳球蛋白對(duì)于乳清蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的影響,當(dāng)降低-乳球蛋白的含量時(shí),形成的混合凝膠網(wǎng)絡(luò)更均勻。動(dòng)態(tài)CSLM也成功地用于分析環(huán)境因素如離子強(qiáng)度、pH、時(shí)間等對(duì)于凝膠結(jié)構(gòu)的影響。接受動(dòng)態(tài)CSLM可以清楚地觀測(cè)到離子強(qiáng)度和pH對(duì)蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的影響。在低離子強(qiáng)度和高pH條件下, CSLM觀測(cè)到酪蛋白形成帶有大孔洞的粗糙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),而在高的離子強(qiáng)度和低的pH條件下,形成蛋白網(wǎng)絡(luò)比較均勻,孔洞尺寸較小39。這是由于酪蛋白在高離子強(qiáng)度下的去穩(wěn)定化要慢于低離子強(qiáng)度,并且需要更低的pH條件來(lái)削減膠束

17、表面的電荷,所以形成凝膠的速度較慢,簡(jiǎn)潔形成結(jié)構(gòu)精細(xì)的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。3DWS用于蛋白分散凝膠DWS起源于傳統(tǒng)的激光散射技術(shù)。由于多散射光子疊加,使傳統(tǒng)的靜態(tài)或是動(dòng)態(tài)激光散射技術(shù)都不能用于高濃度的膠體體系,只能分析稀釋的懸濁體系,其濃度大約0. 01%。而凝膠化、相分別和絮凝現(xiàn)象發(fā)生的濃度,都高于激光散射測(cè)量的濃度范圍40。但DWS卻可以用于混濁的膠體體系,因此,DWS可以用于爭(zhēng)辯乳化劑、膠體、化妝品等領(lǐng)域。3. 1DWS的原理當(dāng)激光照射到組成膠體的顆粒上時(shí),導(dǎo)致發(fā)生共振和散射,而且散射光受顆粒運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的影響41。DWS測(cè)定的是在顆粒間發(fā)生多次散射光子,這時(shí)間子的運(yùn)動(dòng)途徑可以看作隨機(jī)運(yùn)動(dòng)或是散布

18、運(yùn)動(dòng)。因此,隨時(shí)間變化的散射光強(qiáng)度直接與樣品中顆粒運(yùn)動(dòng)狀態(tài)有關(guān),測(cè)定散射光變化,即可推出顆粒運(yùn)動(dòng)狀態(tài),進(jìn)而得出分散的狀態(tài)。DWS有兩種構(gòu)造類型:同側(cè)型和穿透型,同側(cè)型,收集器和檢測(cè)器與激光放射源在同一側(cè);穿透型收集器和檢測(cè)器與激光放射源在異側(cè),所以散射激光必需穿過(guò)整個(gè)懸濁樣品,散射激光的強(qiáng)度較高。同側(cè)型的缺點(diǎn)是有時(shí)收集的散射光沒(méi)有發(fā)生足夠散射,但是它具有激光能量低并且易于安裝設(shè)備的優(yōu)點(diǎn),因此用于食品分散凝膠化的爭(zhēng)辯。3. 2DWS的特點(diǎn)DWS可以在線測(cè)定未稀釋或是未預(yù)處理過(guò)樣品,得到分散顆粒的尺寸、空間相關(guān)性的信息。但缺點(diǎn)是:DWS不能用于已經(jīng)完全形成的凝膠,由于此時(shí)顆粒已經(jīng)完全靜止,體系中沒(méi)

19、有微粒移動(dòng),就不能用簡(jiǎn)單的相關(guān)函數(shù)來(lái)推導(dǎo)凝膠的信息。目前沒(méi)有商業(yè)化DWS設(shè)備,只是一些試驗(yàn)室自制的DWS設(shè)備。因此,DWS的進(jìn)展受軟件和硬件的限制。3. 3DWS在蛋白質(zhì)凝膠分散中的應(yīng)用目前,DWS主要用于爭(zhēng)辯初始狀態(tài)下的食品分散凝膠化過(guò)程,如通過(guò)添加凝乳酶或酸化導(dǎo)致牛奶凝膠化過(guò)程,并測(cè)定凝膠網(wǎng)絡(luò)的黏彈性42-44。爭(zhēng)辯表明,DWS能夠精確測(cè)定分散時(shí)間,并且能找到散射光強(qiáng)度變化和形成結(jié)構(gòu)彈性之間的聯(lián)系。DWS通過(guò)測(cè)定光子運(yùn)動(dòng)平均自由行程(l*)的變化,發(fā)覺(jué)使用凝乳酶和酸凝固的酪蛋白凝膠差異明顯。參數(shù)l*是穿透性DWS特有的表征微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)展變化和不同類型凝膠形成機(jī)理的指標(biāo)。凝膠化過(guò)程中,l*的變化要早于顆粒分散尺寸變化和流變學(xué)變化。在酸化和凝乳酶誘導(dǎo)的凝膠體系中,隨時(shí)間變化,兩者的l*不同,所以證明在兩種凝膠化過(guò)程中蛋白質(zhì)間不同的相互作用類型45。即使在發(fā)生分散之前,DWS顯示在光子平均自由行程上加熱和未加熱的牛奶有明顯的差別