限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上寡核苷酸近末端位點(diǎn)的酶切(Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides) 為什么要添加保護(hù)堿基？在分子克隆實(shí)驗(yàn)中，有時(shí)我們會(huì)在待擴(kuò)增的目的基因片段兩端加上特定的酶切位點(diǎn)，用于后續(xù)的酶切和連接反應(yīng)。由于直接暴露在末端的酶切位點(diǎn)不容易直接被限制性核酸內(nèi)切酶切開，因此在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，人為的在酶切位點(diǎn)序列的5端外側(cè)添加額外的堿基序列，即保護(hù)堿基，用來提高將來酶切時(shí)的活性。其次，在分子克隆實(shí)驗(yàn)中選擇載體的酶切位點(diǎn)時(shí)，相臨的兩個(gè)酶切位點(diǎn)往往不能同時(shí)使用，因?yàn)橐粋€(gè)位點(diǎn)切割后留下的堿基過少以至于影響旁邊的

2、酶切位點(diǎn)切割。該如何添加保護(hù)堿基？添加保護(hù)堿基時(shí)，最關(guān)心的應(yīng)該是保護(hù)堿基的數(shù)目，而不是種類。什么樣的酶切位點(diǎn)，添加幾個(gè)保護(hù)堿基，是有數(shù)據(jù)可以參考的。添加什么保護(hù)堿基，如果嚴(yán)格點(diǎn)，是根據(jù)兩條引物的Tm值和各引物的堿基分布及GC含量。如果某條引物Tm值偏小，GC%較低，添加時(shí)多加G或C，反之亦反。為了解不同內(nèi)切酶對(duì)識(shí)別位點(diǎn)以外最少保護(hù)堿基數(shù)目的要求，NEB采用了一系列含識(shí)別序列的短雙鏈寡核苷酸作為酶切底物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于確定雙酶切順序?qū)?huì)有幫助（比如在多接頭上切割位點(diǎn)很接近時(shí)），或者當(dāng)切割位點(diǎn)靠近DNA末端時(shí)也很有用。在本表中沒有列出的酶，則通常需在識(shí)別位點(diǎn)兩端至少加上6個(gè)保護(hù)堿基，以確保酶

3、切反應(yīng)的進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)方法：用-32PATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下標(biāo)記0.1A260單位的寡核苷酸。取1 µg已標(biāo)記了的寡核苷酸與20單位的內(nèi)切酶，在20°C條件下分別反應(yīng)2小時(shí)和20小時(shí)。反應(yīng)緩沖液含70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT及適量的NaCl或KCl（視酶的具體要求而定）。20%的PAGE（7 M尿素）凝膠電泳分析，經(jīng)放射自顯影確定酶切百分率。本實(shí)驗(yàn)采用自連接的寡核苷酸作為對(duì)照。若底物有較長的回文結(jié)構(gòu)，切割效率則可能因?yàn)槌霈F(xiàn)發(fā)夾結(jié)構(gòu)而降低。酶寡核苷酸序列鏈長切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCG

4、ACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 120 0 00 0 0Afl IIICACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG8 10 120 >90 >900 >90 >90Asc IGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Ava ICCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA8 10 1250 >90 >90>90 >90 >90BamH ICGGATCCG

5、CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG8 10 1210 >90 >9025 >90 >90Bgl IICAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC8 10 120 75 250 >90 >90BssH IIGGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA8 10 120 0 500 0 >90BstE IIGGGT(A/T)ACCC9010BstX IAACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT22 24

6、 270 25 250 50 >90Cla ICATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG8 8 10 120 0 >90 500 0 >90 50EcoR IGGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Hae IIIGGGGCCCC AGCGGCCGCT TTGCGGCCGCAA8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Hind IIICAAGCTTG CCAAGCTTGG

7、 CCCAAGCTTGGG8 10 120 0 100 0 75Kpn IGGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG8 10 120 >90 >900 >90 >90Mlu IGACGCGTC CGACGCGTCG8 100 250 50Nco ICCCATGGG CATGCCATGGCATG8 140 500 75Nde ICCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG GGGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC8 10 12 18 20 220

8、0 0 0 75 750 0 0 0 >90 >90Nhe IGGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG8 10 120 10 100 25 50Not ITTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA12 16 20 24 280 10 10 25 250 10 10 90 >90Nsi ITGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT12 2210 >90>

9、;90 >90Pac ITTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG8 10 120 0 00 25 >90Pme IGTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG8 10 12 240 0 0 750 25 50 >90Pst IGCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT8 14 22 24 260 10 >90 >90 0

10、0 10 >90 >90 0Pvu ICCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA8 10 120 10 00 25 10Sac ICGAGCTCG81010Sac IIGCCGCGGC TCCCCGCGGGGA8 120 500 >90Sal IGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAA28 30 320 10 100 50 75Sca IGAGTACTC AAAAGTACTTTT8 1210 7525 75Sma

11、 ICCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA6 8 10 120 0 10 >9010 10 50 >90Spe IGACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG8 10 12 1410 10 0 0>90 >90 50 50Sph IGGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT8 12 140 0 100 25 50Stu IAAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT8 10 12>90 >90 >90>90 >90 >90Xba ICTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG8 10 12 140 >90 75 750 &g