2022年醫(yī)用分子遺傳學(xué)

1、1. 探針：是分子雜交的必需工具，它是帶有某種標(biāo)記的一段堿基序列互補于待測基因序列的DNA或RNA或寡聚核苷酸2. 克隆的無性繁殖：DNA Cloning基因的無性繁殖，克隆是從一群細(xì)胞中別離單一細(xì)胞，然后讓其復(fù)制自己，產(chǎn)生許多完全一樣的細(xì)胞。DNA克隆過程就是基因無性繁殖的過程，是黑牛技術(shù)。包括：制備基因 選擇載體 基因與克隆載體重組 重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞 培養(yǎng)含有重組DNA的宿主細(xì)胞。3. PCR的概念及根本原理：聚合酶鏈反響，是一種體外擴增技術(shù)。以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5'端和3'端相互補的寡核苷酸分子為引物，在DNA-pol的作用下，按照半保存復(fù)制

2、的機制沿著模板鏈延伸至完成新的DNA合成，重復(fù)這一過程，即可使目的DNA得以擴增。4. PCR是一種體外特異性快速擴增DNA的技術(shù)。PCR的特異性取決于一對人工合成的寡核苷酸，稱引物。這一對寡核苷酸分別互補于待擴增DNA模版3端序列。待擴增DNA模版加熱94變性和退火后，一對引物分別與兩條單鏈模版的3端序列特異性復(fù)性60，在Taq DNA聚合酶催化下72，從引物的5端向3端延伸合成新的DNA鏈。從1個DNA分子產(chǎn)生2個DNA分子。這種變性-復(fù)性-延伸的過程稱一個PCR循環(huán)。30-40次循環(huán)，DNA模版擴增數(shù)百萬倍。5. 基因工程：基因工程是指某種生物細(xì)胞的基因或人工合成的基因經(jīng)重組后，引入另一

3、種生物細(xì)胞，在此種細(xì)胞內(nèi)大量合成該基因編碼的蛋白質(zhì)或多肽，改變此種細(xì)胞的基因表型?；蚬こ淌菍⒛康幕蚺c載體重組，通過轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，重組DNA在宿主細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制和表達(dá)目的基因，表達(dá)產(chǎn)物別離純化后形成基因工程產(chǎn)品。6. 基因工程的根本過程：一、目的基因的制備 二、載體DNA的選擇 三、目的基因和載體連接 四、重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞 五、克隆的別離和鑒定 六、基因表達(dá)7. 基因組基因庫染色體基因庫：首先制備核內(nèi)大分子DNA，然后用限制性內(nèi)切酶水解DNA，經(jīng)選擇后將需要的DNA片段與載體DNA重組，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，制成基因庫，稱為基因組基因庫。是代表一個物種全部基因組的重組DNA片段的集合。8.

4、 載體vector：是將外源目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞，使外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)的一類DNA分子。載體可分為基因克隆和基因表達(dá)兩類。9. 載體的特點：1具有自主復(fù)制能力 2有多個單切口核酸內(nèi)切酶位點 3有藥物選擇性遺傳標(biāo)志 4在細(xì)菌內(nèi)有較多的復(fù)制拷貝數(shù)1. Origin of replication 2. Selectable marker 3. Multiple cloning site (MCS)。10. 限制性內(nèi)切酶Restriction endonuclease：能識別DNA分子內(nèi)部特異性對稱序列通常為4-8個堿基對并能在特定部位將其切開的一類酶。11. 回文序列Palindrome

5、：又稱inverted repeat sequence。是指核苷酸序列從5到3在兩條鏈上一樣，又稱倒置重復(fù)序列。12. 基因工程中用到的酶：1限制性內(nèi)切酶2DNA聚合酶3反轉(zhuǎn)錄酶4DNA連接酶5堿性磷酸酶6末端轉(zhuǎn)移酶7Taq DNA聚合酶13. Charon噬菌體：噬菌體在其DNA的“非生活區(qū)存在一些EcoR 切口，用人工方法去除多數(shù)EcoR 切口，留下單一EcoR切口，由此形成人工載體，稱為Charon噬菌體。14. 考斯質(zhì)粒cosmid：是噬菌體cos部位的序列和質(zhì)粒的重組體。15. 基因克隆載體：主要用于擴增目的基因，即進(jìn)展基因的無性繁殖，并不需要目的基因的表達(dá)。16. 基因表達(dá)載體ex

6、pression vector：能表達(dá)外源目的基因并合成蛋白質(zhì)的載體稱表達(dá)載體。17. 穿梭質(zhì)粒載體：外源性基因插入混合型載體后既可在原核宿主細(xì)胞復(fù)制，也可在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)。18. 單核苷酸多態(tài)性SNP：所謂SNP就是在某一人群中的正常個體間的基因組DNA的某些位點的單個堿基對存在差異。有兩種或兩種以上的差異，我們可以把該位點用等位基因表示，即存在兩種或兩種以上的等位基因，最少的一種等位基因的出現(xiàn)頻率不少于1%，這就稱SNP。19. 基因：是生物體遺傳信息的根本單位，其本質(zhì)是DNA，但有的生物基因組是RNA。編碼一種有生物學(xué)功能的產(chǎn)物-蛋白質(zhì)多肽或RNA所需信息的一段DNA稱為基因。按照這

7、一概念，一個基因包括不僅是編碼蛋白質(zhì)肽鏈或RNA所必需的核苷酸序列，也包括為保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列、5和3非翻譯序列、內(nèi)含子等所有的核苷酸序列。20. 開放閱讀框架ORF：在DNA鏈上，由蛋白質(zhì)合成的起始密碼子ATG開場到終止密碼子為止的一個連續(xù)編碼序列稱為一個開放閱讀框。21. 細(xì)胞基因組：一個細(xì)胞所有染色體中包含的全部DNA稱為細(xì)胞基因組22. 基因的功能：儲存遺傳信息；能忠實地復(fù)制自己；指導(dǎo)RNA和蛋白質(zhì)合成；突變，使物種進(jìn)化23. 操縱子operon：功能上相關(guān)的基因串聯(lián)在一起組成操縱子構(gòu)造，受同一個啟動子調(diào)控，幾個基因一起轉(zhuǎn)錄成一條mRNA。24. 原核生物中基因組合的特點：存在基

8、因重疊現(xiàn)象；基因中無內(nèi)含子；具有操縱子構(gòu)造；噬菌體基因組中有一些是單鏈環(huán)形DNA；基因按照功能分類和表達(dá)先后順序性排列。真核生物：1真核生物基因組很大，包括細(xì)胞核中的全部DNA和線粒體DNA；大局部為非編碼序列2真核生物的主要遺傳物質(zhì)與組蛋白構(gòu)成染色質(zhì)，被包裹在細(xì)胞核內(nèi)3真核生物為蛋白質(zhì)編碼的mRNA是單順反子，一條mRNA一般只翻譯出一條多肽鏈。4真核生物的基因組中有大量的重復(fù)序列5真核生物的基因是不連續(xù)排列的6存在端粒構(gòu)造7先轉(zhuǎn)錄后翻譯25. DNA多態(tài)性：在人群中同時和經(jīng)常存在兩種或兩種以上不連續(xù)的基因型，較少一種基因型出現(xiàn)的頻率不低于1%，即DNA多態(tài)性。26. 限制性片段長度多態(tài)性R

9、FLP：由于個體DNA上的一個點上堿基的變異造成限制性核酸內(nèi)切酶位點的產(chǎn)生或消失，用限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA時就會出現(xiàn)能切和不能切的兩種狀況，從而可以產(chǎn)生不同的DNA水解片段或在兩個酶位點之間有片段的插入或缺失，也能造成RFLP。27. 割裂基因：人基因組中有約1/3為多拷貝，這類基因大多數(shù)是不連續(xù)的基因，即基因內(nèi)部含有非編碼序列，把編碼序列隔離開來，稱為基因割裂現(xiàn)象，此類基因又稱為割裂基因。28. 簡單真核轉(zhuǎn)錄單位：大多數(shù)真核生物不存在操縱子構(gòu)造，每個基因都單獨構(gòu)成一個轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單順反子mRNA，僅編碼一種蛋白質(zhì)。這種僅轉(zhuǎn)錄一種單順反子mRNA，翻譯出單個蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄單位，稱為簡單

10、真核轉(zhuǎn)錄單位29. 復(fù)雜轉(zhuǎn)錄單位：雖然真核生物不存在操縱子樣構(gòu)造，但也存在另一種轉(zhuǎn)錄單位，轉(zhuǎn)錄出的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以通過不同的拼接方式產(chǎn)生一種以上的蛋白質(zhì)，即一段DNA序列可編碼多種mRNA或蛋白質(zhì)。這種轉(zhuǎn)錄單位稱復(fù)雜轉(zhuǎn)錄單位。30. 基因家族：從一個祖先基因，在進(jìn)化過程中通過“加倍產(chǎn)生多個基因，這些基因構(gòu)成的一簇構(gòu)造和功能相關(guān)的基因群常聚集在一起，或分散在基因組中，這樣的一簇基因稱為加倍基因。把這種來自一個祖先基因，通過加倍方式形成的編碼具有相似而不完全一樣氨基酸序列的一組基因歸屬于基因家族，被其編碼的同源蛋白質(zhì)稱蛋白質(zhì)家族。31. 假基因pseudogene：在基因加倍過程中，可能發(fā)生片段的

11、喪失或去除了某些調(diào)控信號，不再具有轉(zhuǎn)錄功能，或去除了拼接加工信號。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不能正確拼接，或在編碼區(qū)產(chǎn)生終止信號，產(chǎn)生不完整的肽鏈，因此都不能產(chǎn)生有功能的mRNA。但這種喪失功能的加倍基因仍留在基因組中，這種基因稱為假基因32. DNA半保存復(fù)制：即親代DNA雙螺旋解開，每一條鏈均作為模版，按堿基互補配對原那么合成一條新的互補鏈，從而產(chǎn)生兩個與原來DNA構(gòu)造一樣的子代DNA分子。每一條DNA分子含有親代DNA的一條舊鏈和一條新生鏈。33. DNA復(fù)制的半不連續(xù)性：前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制，隨后鏈不連續(xù)復(fù)制的方式稱為DNA復(fù)制的半不連續(xù)性。34. DNA復(fù)制的一般特征：半保存復(fù)制；半不連續(xù)性復(fù)制；雙向性35

12、. 復(fù)制子Replicon： 基因組中能獨立進(jìn)展復(fù)制的構(gòu)造單位稱復(fù)制子, 或者說單個復(fù)制起始點控制的DNA,包含從起始位點到終止位點的全部DNA。36. TALEN技術(shù)：轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶Transcription Activator-Like effector Nucleases)利用TAL序列模塊，構(gòu)建針對任意核酸靶序列的重組核酸酶，可以實現(xiàn)在特異的位點打斷目標(biāo)基因，從而敲除該基因。TALEN蛋白分子包含DNA結(jié)合域和Fok核酸酶，33-35個氨基酸重復(fù)序列構(gòu)成了TALE的核心區(qū)域，第12-13位點氨基酸不同，可以特異性地識別DNA序列，兩個TALEN分子結(jié)合到靶點兩側(cè)，F(xiàn)ok形成

13、二聚體并發(fā)揮切割作用，生成雙鏈斷端，細(xì)胞內(nèi)的非同源末端接合修復(fù)機制啟動，斷口被修復(fù)同時隨機的刪除或插入一定數(shù)量的堿基，造成移碼導(dǎo)致基因失活。原理：33-35個氨基酸重復(fù)序列構(gòu)成了TALE的核心區(qū)域，可以特異性地識別DNA序列。未識別某一特定DNA序列，只需設(shè)計相應(yīng)TALE單元串聯(lián)克隆即可。然后識別特異靶DNA序列的TALE與核酸內(nèi)切酶Fok偶聯(lián)，構(gòu)成TALEN質(zhì)粒。TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，表達(dá)的融合蛋白特異地與與靶DNA結(jié)合。而兩個TALEN融合蛋白中的Fok核酸內(nèi)切酶形成二聚體，發(fā)揮剪切活性，在兩個靶位點之間打斷目標(biāo)基因，形成DSB，誘發(fā)DNA損傷修復(fù)機制。細(xì)胞可通過非同源重組NHEJ

14、方式修復(fù)DNA，由于缺乏修復(fù)模板，在此過程中或多或少會刪除或插入一定數(shù)目的堿基，造成移碼，使得目的基因失活或敲除。37. CRISP:規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是一類獨特的DNA直接重復(fù)序列家族，它的構(gòu)造非常穩(wěn)定，長度約25-35bp的重復(fù)序列被單一序列約26-72個堿基間隔。CRISPR就是通過這些間隔序列與靶基因進(jìn)展識別。CAS9內(nèi)切酶是一種DNA內(nèi)切酶，crRNA通過堿基配對與tracrRNA結(jié)合形成雙鏈RNA，此tracrRNA crRNA二元復(fù)合體指導(dǎo)Cas9蛋白在c

15、rRNA引導(dǎo)序列靶定位點剪切雙鏈DNA。38. 信號肽：某些蛋白質(zhì)的氨基端有15-30bp的氨基酸序列，直到蛋白質(zhì)傳送到特定的位置。隨后被水解。信號肽是決定蛋白質(zhì)靶向輸送特性的最重要元件，提示指導(dǎo)蛋白質(zhì)靶向輸送的信息存在于蛋白質(zhì)自身的一級構(gòu)造中。39. 包裝細(xì)胞：通過基因工程技術(shù)對細(xì)胞進(jìn)展修飾，是指含有編碼構(gòu)造蛋白的構(gòu)造基因，所編碼的構(gòu)造蛋白可以在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體所攜帶的包裝信號指導(dǎo)下將該逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝成具有一次感染性的復(fù)制缺陷型顆粒，該包裝細(xì)胞不含編碼完整病毒的基因組，本身不會合成病毒顆粒。40. Kozak序列：真核細(xì)胞5端可能有多個AUG密碼子，但起始密碼子位于kozakACCAUGG

16、，該序列突變可降低核糖體的翻譯活性，在真核細(xì)胞表達(dá)目的蛋白時需考慮此問題。41. 原核和真核轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控的區(qū)別 原核生物聚合酶只有一種，有多個亞基。真核生物有三種DNA依賴性RNA聚合酶，有兩個不同的大亞基和十幾個不同的小亞基 原核生物RNA聚合酶可以直接結(jié)合DNA模板，而真核生物RNA聚合酶需與輔助因子結(jié)合后才結(jié)合模板。 轉(zhuǎn)錄起始需注意的問題 原核生物 真核生物RNA聚合酶要結(jié)合到DNA模板上轉(zhuǎn)錄起始前的上游區(qū)段具有啟動子核心序列DNA雙鏈局部翻開，使其中一條鏈作為模板RNA-pol不能直接結(jié)合模板RNA聚合酶啟動轉(zhuǎn)錄時需要轉(zhuǎn)錄因子才能形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體 原核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)特點：因子決定RNA聚合

17、酶識別特異性操縱調(diào)控模式在原核基因轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)中具有普遍性原核操縱子受到阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)真核基因調(diào)控的特點：真核基因內(nèi)含有多種RNA聚合酶處于轉(zhuǎn)錄激活狀態(tài)的染色質(zhì)構(gòu)造發(fā)生明顯變化在真核基因表達(dá)調(diào)控中以正性調(diào)節(jié)占主導(dǎo)在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯分隔進(jìn)展轉(zhuǎn)錄后修飾、加工更為復(fù)雜RNA編輯：在mRNA水平上改變遺傳信息的過程。具體是指基因轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的mRNA分子中，由于核苷酸的缺失插入或置換，基因轉(zhuǎn)錄物的序列不與基因編碼序列互補，使翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)和氨基酸組成不同于基因序列中的編碼信息現(xiàn)象miRNA：真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約20-25個核苷酸。成熟的miRNAs是由較長的初級轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據(jù)互補程度不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。siRNA：是指在進(jìn)化過程中高度保守的由雙鏈RNA誘發(fā)的同源mRNA高效特異性