蜈蚣多糖對Hela細胞的增殖抑制作用研究

1、    蜈蚣多糖對Hela細胞的增殖抑制作用研究作者：李興暖韓雅莉余衛(wèi)國【摘要】  目的研究蜈蚣多糖對人宮頸癌細胞Hela細胞的抑制作用及作用機制。方法用MTT法檢測蜈蚣多糖對Hela細胞生長的抑制作用；流式細胞儀和Annexin V-FITC/PI雙熒光染色分別檢測蜈蚣多糖對Hela細胞周期及凋亡情況的影響。結果在一定濃度范圍內蜈蚣多糖可顯著抑制Hela細胞的增殖，改變Hela細胞的細胞周期，使細胞阻滯于G2/M期，并能誘導細胞凋亡。結論蜈蚣多糖可能通過改變Hela細胞的細胞周期，誘導細胞凋亡，從而對Hela細胞的增殖有一定的抑制作

2、用。 【關鍵詞】  蜈蚣多糖；細胞周期；細胞凋亡Abstract:ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of polysaccharide from Scolopendra subspinipes mutilans (PSSM) on Hela cells and its mechanism. MethodsMTT assay was used to test the effect of growth inhibition on Hela cells. Cell cycle and cell apopotsis wer

3、e detected by flow cytometry and AnnexinV-FITC/PI fluorescence staining.ResultsPSSM could obviously inhibit the proliferation of Hela cells at specific concentration range, change the cell cycle of Hela cells and block Hela cells at G2/M phase, and induce cell apoptosis.ConclusionPSSM can inhibit th

4、e growth of Hela cells by changing cell cycle and inducing apoptosis.Key words:Polysaccharide from Scolopendra subspinipes mutilans; Cell cycle; Cell apoptosis少棘蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch又名百足, 屬節(jié)肢動物門，多足綱，唇足目，螟蚣科動物，為 中國 藥典記載的正品藥材，為我國傳統(tǒng)的鎮(zhèn)痙、通絡類藥物。祖國醫(yī)學記載和臨床實踐均已證明其具有鎮(zhèn)靜熄風、通絡止痛、解毒散結等藥用功效1。

5、現(xiàn)代 藥理實驗也證明了蜈蚣具有抗腫瘤和抗動脈粥樣硬化等作用2,3，臨床用于 治療 腫瘤以及心腦血管病等癥。傳統(tǒng)中藥均以整蟲入藥，但蜈蚣體內成分復雜，且有效成分尚不明了，無法對其藥理作用做進一步研究。為了探討蜈蚣抗腫瘤作用，本文以少棘蜈蚣為原料，對其體內多糖進行了分離純化，并進一步對其進行了Hela細胞增殖的作用的研究，為進一步探索蜈蚣抑瘤作用機制奠定基礎。 1 材料 1.1 材料少棘蜈蚣Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch購自汕頭市恒青藥店，由廣東 工業(yè) 大學生藥研究室對其進行種類鑒定。人宮頸癌Hela細胞，由汕頭大學醫(yī)學院分子病理實驗室提供，微血管

6、內皮細胞MVEC，由汕頭大學多學科研究中心提供。1.2 試劑與儀器DEAE-52為 Whantman 公司產品；1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、噻唑蘭（MTT）、碘化丙啶（PI）均購自Sigma公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司；新生牛血清購自杭州四季青生物有限公司。Thermo Labsystems酶標儀（Thermo公司）；Shel Lab二氧化碳培養(yǎng)箱； EpicsXL 流式細胞儀（Backman Coulter公司）；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡（Olympus公司）；Nikon Coolpix 4500數(shù)碼相機。 2 方法 2.1 蜈蚣多糖(pol

7、ysaccharides from Scolopendra subspinipes mutilans L. Koch, SSP)的制備少棘蜈蚣87 g 研缽磨碎，加入1 000 ml蒸餾水90恒溫水浴攪拌4 h，過濾，殘渣加入500 ml蒸餾水，重復上述步驟，過濾，合并濾液，濃縮濾液。取上清液，加5倍體積95乙醇4靜置過夜，離心，去上清液，沉淀用少許蒸餾水溶解。Sevag法去蛋白數(shù)次4，將去蛋白溶液透析干燥，過DEAE-52離子交換纖維素色譜柱，以0.05，0.1，0.2，0.4和1 mol·L-1 NaCl 進行階段洗脫，共得到3個糖峰，其中濃度0.05 mol·L-1的

8、NaCl洗脫峰糖含量最高，收集此組分透析干燥，待用。2.2 Hela和人微血管內皮細胞 ( Human microvascular endothelial cell,MVEC) 的培養(yǎng)取對數(shù)生長期的Hela和MVEC細胞接種于含10小牛血清的1640培養(yǎng)基中，接種濃度為5×105 個/ml，置37，5CO2 濃度，飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。去原培養(yǎng)基，加入含有SSP濃度分別為0，0.5，1，1.5，2，4 g/ml的維持液（含1.5小牛血清的1640培養(yǎng)基），置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后進行實驗。2.3 蜈蚣多糖（SSP）對Hela細胞增殖的影響取對數(shù)生長期H

9、ela細胞按上述方法接種于96孔板中，貼壁培養(yǎng)24 h，去原培養(yǎng)基，加入含有0.5，1，1.5，2，4 g/ml SSP維持液，總體積為200 l，分別培養(yǎng)24，48 h后取出，每孔加入MTT 20 l繼續(xù)孵育4 h，吸去上清，加入200 l二甲基亞砜，振蕩15 min，酶標儀檢測570 nm波長下各孔吸光值（A），按下列公式 計算 細胞增殖抑制率。細胞增殖的抑制率（%）（1實驗組A值/對照組A值）×100取MVEC細胞作為正常細胞對照，實驗方法同上。2.4 蜈蚣多糖（SSP）對Hela細胞周期的影響取對數(shù)生長期Hela細胞，接種到50 ml培養(yǎng)瓶中，按上述方法培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)24 h后取出，加入含有SSP濃度分別為0.5，1，1.5 g/ml 維持液中，培養(yǎng)24，48 h后常規(guī)消化收集細胞，用PBS清洗3次，加入70預冷乙醇4固定過夜，離心去乙醇，用PBS清洗兩次， R NaseA（50 g/ml）37 消化30 min，PI染色后上機檢測細胞周期變化5。2.5 蜈蚣多糖對（SSP）Hela細胞凋亡的影響將蓋玻片切成4塊，加入12孔板中，取100 l 5×104個/ml的細胞懸液加到玻片上，4 h后待細胞貼壁后再加入900 l培養(yǎng)基，繼續(xù)貼壁培養(yǎng)20 h。去掉原培養(yǎng)液，用PBS清洗3次后，加入含0.5，1，1.