間充質(zhì)干細(xì)胞在拉力作用下的大鼠皮下成骨能力研究.docx

1、間充質(zhì)干細(xì)胞在拉力作用下的大鼠皮下成骨能力研究II馬念曾德良3趙寧2黃家亮】錢玉芬】（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔正畸科：2.上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;3.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔修復(fù)科，上海200011）【摘要】目的構(gòu)建一個(gè)簡易、有效的體內(nèi)加力動(dòng)物模型，研究大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rBMSC)在大鼠皮下受拉力作用下的成骨能力。方法將成骨誘導(dǎo)后的rBMSC與聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)支架材料復(fù)合構(gòu)建骨移植材料，再運(yùn)用澳絲彎制成加力裝置與該移植材料復(fù)合，實(shí)驗(yàn)分為細(xì)胞-材料-加力裝置復(fù)合物(A組)和細(xì)胞-材料復(fù)合物(B組，對(duì)照組)2組，分別植入12只SD雄性大鼠皮

2、下，術(shù)后4w、8w取材，分別行micro-CT掃描、苦味酸品紅染色、骨鈣素免疫組化染色，采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。堵果micro-CT掃描可見與低密度的支架材料形成明顯對(duì)比的高密度影像，且成骨鼠A組B紐，2組間存在明顯差異。組織學(xué)評(píng)分表明A組與B組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PV0.05)。結(jié)論相比較不受力條件，受到拉力作用的rBMSC在體內(nèi)的成骨最更多，本研究建立的大鼠皮下加力動(dòng)物模型有效、可靠。【關(guān)鍵詞】骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞拉力PLGA成骨DOI：10.11752/j.kqcl.2016.03.05Aninvivostudyofratsubcutaneousosteogenesisof

3、mesenchymalstemcellsundertensileforceMaNian1ZenDeliang2ZhaoNing1HuangJialiang1QianYufen1(I.DepartmentofOrthodontics,NinthPeople，sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine.Shanghai200011;2.DepartmentofProsthodontics,NinthPeoplesHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200

4、011)Abstract】ObjectiveTobuildasimpleandeffectiveexperimentalanimalmodelundertensileforceandexploretheosteogeniccapabilityofratmesenchymalstemcellsundermechanicalstrainsubcutaneously.MethodsMesenchymalstemcellswereisolatedfromSDrats,andseededintoPLGAafterosteogenicinductioninvitro.Thecell-scafTbld-fb

5、rce-devicccomplex(Agroup)astheexperimentalgroupwasgeneratedundermechanicalloadinginthePLGAscaffoldwithAustralianwireinserted,andthecell-scafibldcomplex(Bgroup)withoutmechanicalloadingasthecontrolgroup,andbothcomplexweresubcutaneouslyimplantedtorats,respectively(=12).Microcomputertomography(Micro-CT)

6、,immunohistochemicalstainingandVan-Gicson*sstainingwereperformedrespectivelyafter4,8weekspost-surgery.ResultsMicro-CTshowedthathighdensityshadowsamongthePLGAundertensileforcewasmorethanthosewithouttensileforce.HistologicalevaluationshowedthatnewboneformationandmineralizationofthePLGAundertensileforc

7、eweremarkedlyacceleratedthanthoseundernostrain(P0.05).ConclusionMesenchymalstemcellsundertensileforceshowedmoreboneformationcomparedto基金資助：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)：81170989）通信作者：錢玉芬，E-mail：qianyfl960thoseundernoundertensileforce.Thisexperimentalanimalmodelundertensileforcestudyinvivoiseflectiveandeasytorealize

8、.KeyWordsMesenchymalStemCellsTensileforcePLGABoneformation傳統(tǒng)的自體骨修復(fù)牙槽突裂方法存在如創(chuàng)傷、出血等弊端，而組織工程的發(fā)展為修復(fù)牙槽突裂提供了新的選擇。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）H有來源充足，取材方便，有成骨潛能等優(yōu)點(diǎn)。之前已有體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了BMSC在拉力作用下向成骨細(xì)胞分化叫然而由于體內(nèi)存在細(xì)胞因子等可以調(diào)控成骨的因素存在，所以BMSC在體內(nèi)受到拉力后的成骨變化并未能單獨(dú)監(jiān)測。本實(shí)驗(yàn)采用成骨誘導(dǎo)后的BMSC為種子細(xì)胞，以聚乳酸羥基乙酸共聚物（PLGA）支架材料構(gòu)建組織工程骨作為骨移植材料，并運(yùn)用澳幺幺彎制而成的加力裝置與上述骨移

9、植材料復(fù)合后植入SD大鼠皮下，構(gòu)建一個(gè)簡易、有效的體內(nèi)加力動(dòng)物模型，為研究細(xì)胞體內(nèi)加力的變化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和方法。1材料和方法1.1材料PLGA原料購自濟(jì)南岱罡生物工程有限公司，分子量50000,mpLA：mpGA=50:50。支架成型模具為聚四窺乙烯（PTFE）,購自上海道冠橡塑制品廠。溶劑三氯甲烷（CHC13）及制孔劑氯化鈉（NaCI）購于上海建秋化工，級(jí)別為分析純。1.2支架制備將PLGA原料溶于CHC，配制成濃度為10%（w/v）的溶液。按照PLGA/NaCl=1/9的質(zhì)量比將NaCI顆粒加入PLGA溶液中，攪拌均勻后，倒入尺寸為巾4mmX15mm的模具中。室溫干燥48h,脫模后用蒸饞水

10、濾去多孔模中的NaCI室溫干燥48h,再放入40C烘箱干燥24h,使CHC,揮發(fā)。1.3支架表面結(jié)構(gòu)觀察采用3400-N（HITACHI）掃描電子顯微鏡觀察材料表面孔結(jié)構(gòu)（孔隙率和孔徑大?。?.4支架拉伸強(qiáng)度檢測使用萬能力學(xué)測試機(jī)（EZ20-LLORD,英國勞埃德）進(jìn)行拉伸強(qiáng)度測試，預(yù)載速度設(shè)為15mm/min,拉伸速度設(shè)為30mm/min,樣品數(shù)為3個(gè)。1.5加力裝置制作和拉力測量使用直徑為0.018英寸的澳絲l5;6,（TP.托博正畸器械有限公司）彎制成帶圈垂直開大曲（圈內(nèi)徑3mm,兩臂長25mm,兩臂角度30），使用HP.5數(shù)顯式推拉力計(jì)（艾德堡儀器有限公司）測量兩臂間距離變化所產(chǎn)生的

11、不同拉力值。1.6加力裝置體外拉力實(shí)驗(yàn)將加力裝置插入制備好的PLGA支架中，形成實(shí)驗(yàn)樣品（圖1）,加力裝置對(duì)PLGA支架有約1.5N拉力，末端回彎防止脫出。將實(shí)驗(yàn)樣品浸泡于pH=7.2的磷酸鹽緩沖溶液（phosphatebufferedsolution,PBS）中，樣品充分浸潤后，放入37C恒溫箱，分別于實(shí)驗(yàn)后0,1,2,3,4,6,8w取樣,測量加力裝置的兩臂間距離，得出實(shí)驗(yàn)樣品在各觀察點(diǎn)受到的拉力值。圖1實(shí)驗(yàn)樣品1.7BMSC培養(yǎng)取3只4周齡雄性SD大鼠的雙側(cè)股骨和脛骨骨髓原代培養(yǎng)含10%小牛血清（Hyclone,美國）的DMEM培養(yǎng)基（Gibco,美國）叫待細(xì)胞融合達(dá)80%后用0.25%

12、的胰酶（Gibco,美國）消化傳代，后更換培芥液為DX成骨誘導(dǎo)液（內(nèi)含抗壞血酸50mg/l,地塞米松20ul/l,B-甘油磷酸2.16g/l）,傳代培養(yǎng)至第3代（P3）。1.8細(xì)胞種植將PLGA支架置于12孔板孔底并插入澳絲，取P3細(xì)胞調(diào)整為2X10）1111,每個(gè)支架滴加30y1細(xì)胞懸液，在37C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h叫1.9細(xì)胞支架復(fù)合物掃描電鏡觀察細(xì)胞-支架復(fù)合物培養(yǎng)2天后，PBS清洗,放入2.5%戊二醛溶液固定，餓酸后固定，乙隔梯度脫水后，使用臨界點(diǎn)干燥，離子濺射儀噴金鍍膜后（3400-N掃描電鏡（HITACHI）下觀察。1.10動(dòng)物實(shí)驗(yàn)8周齡雄性SD大鼠12只，平均質(zhì)Jrf200g,由

13、上海九院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。水合敏酸0.3ml/lOOg腹腔注射麻醉，背部消嵌后，切開2個(gè)長約3cm切口，鈍性分離至皮下并分別植入細(xì)胞材料+加力裝置復(fù)合物（A組，實(shí)驗(yàn)組）和細(xì)胞-材料復(fù)合物（B組，對(duì)照組），縫合傷口.術(shù)后連續(xù)3d給予抗生素，于術(shù)后4、8w取材，分別行micro-CT掃描、VanGiesons苦味酸品紅染色和免疫組化觀察骨鈣素（OCN）表達(dá)情況。1.H統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,所有數(shù)據(jù)先行正態(tài)性分布分析，對(duì)2組均數(shù)間比較采用配對(duì)/檢驗(yàn)。PvO.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1PLGA支架PLGA支架材料的孔隙率為75.8%,孔徑在6.51-31.8um

14、之間，平均孔徑為14.39nm（圖2）。支架訶承受平均最大拉伸力值為7.037N。(a)(.b)圖2PLGA多孔支架的SE、1照片2.2加力裝置拉伸力值加力裝置產(chǎn)生的拉伸力隨兩臂間距離增大逐漸減小，兩臂間距離為6mm時(shí)產(chǎn)生的拉伸力為實(shí)驗(yàn)組所需1.5N（圖3）。體外實(shí)驗(yàn)中，加力裝置隨時(shí)間增加而拉伸力逐漸減小，0w力值為初始設(shè)定力值1.5N,到8w時(shí)力值衰減為0.4N（圖4）。2.3細(xì)胞支架復(fù)合物掃描電鏡觀察BMSC在支架上培養(yǎng)2天后，SEM照片可見復(fù)合材料表面較為粗糙，具有豐富的微孔.細(xì)胞牢固地黏附于材料上，鋪展生氏，呈多角形，并伸出多個(gè)偽足與村料相連（圖5）。2.4micro-CT分析4w后，

15、A、B組大鼠的支架組織均可見明顯放射顯影，新生骨呈散在高密度影：8w后，新生骨分布更加集中，影像密度增高（圖6）。骨體積（BV）顯示,4w時(shí)骨體積A組B組（P=0.001）；8w時(shí)骨體積A組日組（80.013）。以上結(jié)果說明拉伸力可以明顯促進(jìn)異位成骨的數(shù)妝，各組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（氏0.05）。在8w時(shí)的成骨/明顯高于4w時(shí)的成骨量（圖7）o4567891011121314151617距，(mm)3距離-拉力值示意圖0411I1111110123456789時(shí)間(week)圖4時(shí)間-拉力值示意圖(a)(b)圖5細(xì)胞支架復(fù)合物的SE、1照片(黑色箭頭處為細(xì)胞偽足)(a)4w實(shí)驗(yàn)組(b)4w

16、對(duì)照組(c)8w實(shí)驗(yàn)組(d)8w對(duì)照組圖6micro-CT三維照片2.5VanGieson苦味酸品紅染色硬組織切片觀察顯示A組4w時(shí)已形成大M幼稚血管，成骨細(xì)胞較為活躍，生成大杭類骨質(zhì)和少量成熟骨組織，8w時(shí)類骨質(zhì)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為成熟骨組織。B組雖然也有骨組織形成，但無論是成骨量還是骨成熟度都少于A組(圖8)o2.6免疫組化觀察OCN通常被認(rèn)為是晚期成骨的標(biāo)志l，,o通7時(shí)間骨體積示意圖(al)4w實(shí)稔組(a2)8w實(shí)驗(yàn)組(bl)4w對(duì)照組(b2)8w對(duì)照組圖8苦味酸品紅染色切片(10x10)(aD4w實(shí)臉級(jí)(a2)8w實(shí)驗(yàn)組(bl)4w對(duì)照組(b2)8w對(duì)照組圖9OCN免疫組化染色切片(10x4

17、0)過對(duì)免疫組化切片觀察可發(fā)現(xiàn).OCN的陽性表達(dá)出現(xiàn)在成骨細(xì)胞的胞漿和胞外基質(zhì)中，呈棕黃色,A組和B組中均可見OCN陽性表達(dá)(圖9)。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，4w時(shí)的平均光密度值：A組B組(P=0.004)：8w時(shí)的平均光密度伉：A組B組(P=0),組間比較差異具.有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義3V0.05)。B組OCN的陽性表達(dá)率4w時(shí)強(qiáng)于8w時(shí)，但A組則表現(xiàn)為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖10)o圖10OC、免疫組化染色平均光密度值示意圖SO二號(hào)U1S朝史*A3討論探究力的作用下BMSC在體內(nèi)所產(chǎn)生的變化,通常是將組織程支架材料與BMSC夏合后植入體內(nèi)計(jì)缺損處觀察其成骨情況，并在此基礎(chǔ)上借助牙齒與頜骨的力傳導(dǎo)作用,通

18、過螺旋擴(kuò)弓器四、種植支抗，31等裝置對(duì)牙及頜骨進(jìn)行加力，證明技力對(duì)新骨生成確有促進(jìn)作用，但是以上實(shí)豹中自體骨細(xì)胞和植入的BMSC混雜在一起，各自的成骨性能無法獨(dú)立.觀察。所以本實(shí)驍中將細(xì)胞支架材料岌合物及加力裝置植入大鼠皮下，采用異位成骨，從而摒除r自體骨細(xì)胞對(duì)成骨觀察的影響,為單獨(dú)研究某種特定細(xì)胞體內(nèi)加力后產(chǎn)生的變化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和方法。PLGA作為一種可降解的高分子有機(jī)化合物,具有良好的生物相容性和生物降解性，并可以通過調(diào)節(jié)分子結(jié)構(gòu)中乳酸和羥基乙酸片段的比例調(diào)節(jié)PLGA的力學(xué)性能和降解速率四，本實(shí)驗(yàn)正是利用了PLGA的這種可調(diào)控性，制備出具有一定韌性和力學(xué)強(qiáng)度，可滿足長期加力要求的支架。目

19、前國內(nèi)外也常用多孔性組織工程支架，因?yàn)榛ハ噙B通的多孔有助于細(xì)胞粘附生K進(jìn)入材料內(nèi)部，并有利于新骨的血管化網(wǎng)，PLGA可通過不同的制備方法得到不同的孔徑大小及孔隙率，以滿足不同的實(shí)驗(yàn)要求和目的。本實(shí)驗(yàn)中所用澳絲，為臨床常用醫(yī)療材料，有良好的生物安全性，不影響細(xì)胞生長、增殖明，同時(shí)具有良好的回彈性和剛度叫配合PLGA支架模擬生物力學(xué)環(huán)境，所使用初始力值(1.5N)符合臨床正畸力范圍(0-3N),力值的衰減與臨床正畸力衰減基本對(duì)應(yīng)。通過影像學(xué)和組織學(xué)分析結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組成骨量明顯大于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組骨成熟度明顯大于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組成骨細(xì)胞活性明顯強(qiáng)于對(duì)照組，骨更新率于對(duì)照組。產(chǎn)生以上變化的原因可能為：拉

20、力促進(jìn)了成骨細(xì)胞的增殖和分化，拉力促進(jìn)成骨細(xì)胞中骨鈣素的釋放，增強(qiáng)了成骨細(xì)胞的活性。以上結(jié)果均說明實(shí)驗(yàn)組具有明顯的成骨優(yōu)勢，旦該體內(nèi)加力裝置可以有效對(duì)PLGA支架內(nèi)細(xì)胞施加拉力，促進(jìn)成骨分化。4結(jié)論P(yáng)LGA支架具有良好的生物性能，配合澳稅可以簡單快捷地制備出一個(gè)不需要牙或骨支持式的體內(nèi)加力裝置。該裝置可有效對(duì)組織丁程支架內(nèi)的細(xì)胞施加拉力，拉力促進(jìn)了大鼠皮F異位成骨效應(yīng)。而日此裝置可根據(jù)需要:調(diào)節(jié).得到所需力值，對(duì)于進(jìn)一步研究細(xì)胞體內(nèi)加力后情況具有一定的參考意義和應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)MoreauJL,CaccamcscJF,ColcttiDP.etal.Tissueengineeringsolut

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