血小板源生長因子可促進低氧的牛肺動脈平滑肌細胞核內(nèi)NF-κB表達

1、    血小板源生長因子可促進低氧的牛肺動脈平滑肌細胞核內(nèi)NF-B表達        摘要目的：為探討血小板源生長因子（platelet-derived growth factor,PDGF）受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的介質(zhì)分子之一過氧化氫（ H2O2 ）在低氧的肺動脈平滑肌細胞（pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC ）增殖中是否起作用。方法：應(yīng)用共聚焦顯微鏡、細胞免疫組織化學(xué)及Western印跡雜交等方法，檢測了低氧的PASMC PDGF

2、受體途徑中的H2O2的變化及PDGF和H2O2對細胞核內(nèi)與增殖作用相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子NF-B表達量的影響。 結(jié)果：PDGF可使常氧的PASMC中H2O2濃度增高，但明顯降低低氧的PASMC中H2O2的量；同一濃度的H2O2，作用于常氧的PASMC，則引起核NF-B的表達量增加，但對低氧的PASMC核NF-B有明顯的抑制作用；同時加入PDGF和H2O2的低氧的PASMC較僅以H2O2作用的低氧的PASMC，核NF-B的量顯著增加。結(jié)論：PDGF受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在低氧的PASMC同常氧的PASMC相反，H2O2為抑制因子，對細胞可能產(chǎn)生損傷作用，PDGF可抑制低氧的PASMC產(chǎn)生H2O2并達到促進

3、NF-B表達增強的目的，從而使胞內(nèi)與增殖相關(guān)的基因表達增強，最終達到低氧條件下表達增強的PDGF對低氧性PASMC過度增殖的正反饋調(diào)節(jié)作用。主題詞血小板源生長因子； 過氧化氫；NF-B；肺動脈； 肌，平滑中分類號Q786文獻標識碼A文章編號1000-4718(2000)05-0428-04 Platelet-derived growth factor stimulate the increase of NF-B expression in the nuclei of hypoxic bovine pulmonary artery smooth muscle cellsHUANG Qun-hua

4、, SUN Ren-yu(Institute of Basic Medical Sciences, CAMS&PUMC, Beijing 100005, China)AbstractAIM: To reveal whether H2O2, a kind of platelet-derived growth factor (PDGF) signaling molecule, involved in the proliferation of hypoxic pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs) and expression of tra

5、nscription factor NF-B. METHODS: Laser confocal scanning microscopy, immunocytochemistry and Western blot analysis were used. RESULTS: PDGF (30 ng/mL) elevated the intracellular H2O2 in normoxic PASMCs, but decreased that of hypoxic PASMCs significantly. When 100mol/L H2O2 was added, NF-B expression

6、 were inhibited markedly in hypoxic PASMCs, while the same concentration H2O2 resulted in increase of NF-B expression in control cells. CONCLUSION: H2O2, a mediator molecule of PDGF signal transduction, act as an inhibitor in hypoxic PASMCs which is quiet different from that in normoxic PASMCs.It ma

7、y effect on the expression of transcription factor NF-B. NF-B induce various gene expression that involving in the proliferation of vascular smooth muscle cells. One mechanism by which PDGF-induced hypoxic PASMC proliferation might be through PDGF alleviating H2O2 inhibition.MeSHPlatelet-derived gro

8、wth factor; Hydrogen peroxide; NF-kappa B; Pulmonary artery; Muscle， smoothH2O2為血管平滑肌細胞血小板源生長因子（PDGF）受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的介質(zhì)之一，且特異性地增強血管平滑肌細胞DNA的合成，促進細胞增殖12。我們以往的實驗結(jié)果顯示，低氧性肺血管平滑肌細胞增殖作用與PDGF及其受體的表達增強有關(guān)3，未見報道H2O2是否參與此作用。本實驗通過觀察PDGF對低氧的肺動脈平滑肌細胞H2O2的影響以及PDGF和H2O2兩者對核轉(zhuǎn)錄因子NF-B表達的影響，進一步明確了受體途徑中的有關(guān)作用環(huán)節(jié)。材料和方法一、肺動脈平滑肌細胞

9、（PASMC）貼塊法培養(yǎng)及傳代新生乳牛（北郊農(nóng)場）開胸后，無菌取肺外肺動脈，洗凈，浸入D-Hanks 液中，冰浴帶回實驗室。在超凈工作臺內(nèi)，將肺動脈置于平皿中，剪開血管腔，輕刮去內(nèi)膜面的內(nèi)皮細胞，并平行劃開內(nèi)膜面淺層，用小手術(shù)鑷撕下內(nèi)膜平滑肌層，按貼塊法進行細胞原代培養(yǎng)。培養(yǎng)液為含10胎牛血清的DMEM。待810 d后，觀察到組織塊周緣滋長出的PASMC已鋪滿組織塊周圍，用0.25胰酶消化傳代。實驗用36代細胞。二、細胞低氧模型的復(fù)制采用自制的缺氧小室復(fù)制低氧模型。12 h低氧組細胞（H）置于缺氧小室中?？赏ㄟ^氣體流量控制閥將此小室內(nèi)的氣體氧分壓調(diào)置在一個恒定水平。向小室內(nèi)通入10倍容積的95

10、 N2-5CO2混合氣，3min后置換出小室內(nèi)的空氣，再以0.5L/min繼續(xù)通入混合氣，于密閉狀態(tài)下取培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，血液氣體分析儀的血氣分析結(jié)果表明3h后培養(yǎng)液中的氧分壓達6.67kPa，控制混合氣通入量，使培養(yǎng)液中的氧分壓維持在6.67kPa 左右。常氧對照組（N）仍置于5%CO2-95%空氣的細胞培養(yǎng)箱中。三、PASMC H2O2的檢測4分組：N30 ng/mL PDGF5，N100 U/mL過氧化氫酶130 ng/mL PDGF，H30 ng/mL PDGF，H100 U/mL過氧化氫酶30 ng/mL PDGF。注：N為常氧、H為低氧12 h處理，下同。將PASMC接種于3.5

11、mm的細胞培養(yǎng)皿中，待貼壁細胞長勢良好時，復(fù)制低氧細胞模型。傾去培養(yǎng)液，用HBSS液(不含酚紅，下同)稍加沖洗后，每皿加1 mmol/L二氯熒光素（DCF，一種可被H2O2氧化的熒光染料，用HBSS稀釋）1 mL，37，染色30 min。HBSS液洗去未結(jié)合的DCF染液，并每皿中加入1 mL HBSS，于共聚焦顯微鏡下，觀察N組和H組以及以100 U/mL過氧化氫酶預(yù)孵育的N組和H組共4組細胞分別加30 ng/mL PDGF后熒光強度的變化，以反應(yīng)PASMC H2O2的變化。四、NF-B的細胞免疫組化分析（分組：N、N100mol/L H2O24、H、H100mol/L H2O2）PASMC接

12、種于35mm培養(yǎng)皿中，10血清DMEM培養(yǎng)72 h，PBS過洗后用PBS配制的1%多聚甲醛（pH 7.0），室溫固定30 min。再以PBS配制的0.1% Triton-100(pH 7.0)，室溫固定5 min。PBS洗兩次后，加3H2O2 處理5 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。蒸餾水沖洗及PBS浸泡后，經(jīng)10%正常羊血清室溫封閉10 min，再用150稀釋的抗NF-B(P65)抗體(中山公司)，4過夜。一抗作用完成后，滴加生物素標記的二抗，37孵育30min。用PBS洗去未結(jié)合的二抗，加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素，37孵育30min。PBS 稍加沖洗后，DAB顯色劑顯色，封片，照

13、相。五、Western印跡法檢測PASMC核NF-B的表達（分組：N、N100mol/L H2O2、H、H100mol/L H2O2）(一)樣品收集（即PASMC核抽提物制備）6細胞培養(yǎng)至108個，分組低氧實驗結(jié)束后，室溫下用PBS清洗培養(yǎng)瓶中貼壁生長的PASMC以清除培養(yǎng)基。胰酶消化，1200 r/min離心5 min，再用PBS洗滌細胞兩次×5 min，均2000 r/min離心收集細胞。以下步驟在冰上進行。將細胞懸浮于5倍體積Buffer A中，冰浴中溶脹15 min，2000 r/min離心收集細胞，再將細胞懸浮于2倍體積Buffer A中，用玻璃勻漿器將細胞勻漿至90破裂，

14、隨時以臺盼蘭染細胞，鏡下觀察破膜效果。4，4000 r/min離心10 min，去上清。重復(fù)離心一次，去上清。重懸沉淀于1 mL Buffer C中，用玻璃勻漿器勻漿10次左右，于冰上輕柔攪拌30 min進行核抽提。4，15 500 r/min離心30 min后收集上清，于低溫條件下用Buffer D透析3 h。經(jīng)4，15 500 r/min離心20 min，收集上清并分裝，保存于-70備用。Buffer A：含mmol/L*HEPES(pH7.9) 10， KCl 10， EDTA(pH8.0) 0.2， *PMSF 0.5， *DTT 0.5和25%甘油（v/v）；Buffer C：含mm

15、ol/L *HEPES(pH7.9) 20，MgCl2 420，EDTA(pH8.0) 0.2， *PMSF 0.5，*DTT 0.5和25% 甘油（v/v）；Buffer D：含mmol/L *HEPES(pH7.9) 20，KCl 0.1， EDTA(pH8.0) 0.2， *PMSF 0.5，*DTT 0.5和20% 甘油（v/v）。注意帶*使用前加入。(二)SDS-PAGE電泳核抽提物經(jīng)蛋白定量，等體積的2×電泳加樣緩沖液混合后，煮沸5 min,于每泳道上樣20g。根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小，用于檢測核P65的聚丙烯酰胺分離膠的濃度為10。標準方法走電泳。電轉(zhuǎn)：按電轉(zhuǎn)儀使用說明將

16、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，為觀察蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移情況并對蛋白質(zhì)分子量標準參照物進行定位，對濾膜進行麗春紅染色，觀察完畢用去離子水漂洗凈染液再進行免疫染色。(三)免疫顯色反應(yīng)10 mL封閉液（用0.01 mol/L PBS配制5脫脂奶），室溫1 h。 抗NF-B(P65)抗體用封閉液按1100稀釋，孵育膜4過夜。PBS洗膜5min×2次，將膜移入生物素標記二抗工作液，37孵育30 min，PBS沖洗，5 min×3次。將膜移入辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37孵育1 h，TBS沖洗，5 min×3次，DAB顯色劑顯色，待顯色適度時，用水漂洗終止顯色反應(yīng)，拍攝濾膜照片，并通

17、過片掃描對顯示的蛋白電泳條帶進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。六、統(tǒng)計處理實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。用t檢驗判斷均數(shù)差異顯著性。結(jié)果一、PASMC H2O2的檢測（分組：N30 ng/mL PDGF，N100 U/mL過氧化氫酶30 ng/mL PDGF；H30 ng/mL PDGF，H100 U/mL過氧化氫酶+30 ng/mL PDGF）PDGF可促進常氧組的PASMC H2O2的增加（1A），但使低氧組的PASMC H2O2降低（1C）。常氧和低氧的PASMC且分別經(jīng)過氧化氫酶預(yù)孵育12 h的兩組細胞，在加入30 ng/mL PDGF后，未見H2O2量的改變（1B和1D）。

18、Fig 1The changes of intracellular H2O2 concentration stomulated by PDGFA:N+PDGF;B:N+Catalase+PDGF;C:H+PDGF;D:H+Catalase+PDGF.(N:normoxia;H:hupoxia)PDGF was added;hH2O2 of normoxic groupincreased,but that of hypoxic group decreased significantly.After incubating with catalase,no change in intracellul

19、ar H2O2 of both normoxicand hypoxic PASMCs was observed when PDGF was added1經(jīng)PDGF作用后,PASMC胞內(nèi)的H2O2變化二、PASMC核轉(zhuǎn)錄因子NF-B（p65）的免疫組化結(jié)果（分組：N、N100mol/L H2O2、H、H100mol/L H2O2）濃度為100mol/L的H2O2促進常氧條件下的PASMC核轉(zhuǎn)錄因子NF-B在細胞核內(nèi)的表達量增加，但對低氧的PASMC核NF-B有明顯的抑制作用，見2。Fig 2Immunohistochemical staining signal in the PASMC nucl

20、eus with anti-p65 antibodies(±s，n=20）* P0.01, vs normoxia group; P0.01, vshypoxic 12h group2PASMC核p65的免疫組化結(jié)果三、核抽提物的Western印跡雜交檢測PASMC核NF-B（p65）(一)分組(N、N100mol/L H2O2、H和H100mol/L H2O2 4組)Western印跡雜交結(jié)果與免疫細胞化學(xué)實驗結(jié)果基本一致。H2O2促進常氧條件下PASMC核p65的表達，但明顯抑制低氧的PASMC核p65的表達。 N100mol/L H2O2及H100mol/L H2O2兩組p65

21、的量較各自的對照組分別明顯的升高和降低， 見3A。Fig 3A Scanning analysis of Western blot for NF-B binding protein(p65) in nuclear extract from PASMCs3A PASMC核抽提物中p65的Western印跡雜交結(jié)果掃描(二)分組(N、H、H100mol/L H2O2和H100mol/L H2O230ng/ml PDGF)H組較N組有所增加。H100mol/L H2O2組較單純低氧組（H）有顯著降低，H+100mol/L H2O2+30 ng/mL PDGF組較H100mol/L H2O2組有明顯升

22、高，見3B。Fig 3BScanning analysis of Western blot for NF-B binding protein(p65) in nuclear extract from PASMCs3BPASMC核抽提物中p65的Western 印跡雜交結(jié)果掃描討論在心血管疾病的發(fā)病及防御機制的研究中，H2O2所參與的生長因子PDGF受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑日益受人注目。已有證據(jù)表明，H2O2行使第二信使的作用，介導(dǎo)PDGF誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞的增殖，參與動脈粥樣硬化過程。另外，H2O2還可作為核轉(zhuǎn)錄因子NF-B的活化劑，調(diào)節(jié)多種細胞因子的表達1。高濃度的H2O2作為彌散性的O2反應(yīng)中間

23、體，在免疫反應(yīng)中起作用。目前的許多研究結(jié)果表明內(nèi)源性、低濃度的H2O2則具有絲分裂劑作用1，4。與平滑肌細胞增殖相關(guān)的細胞因子、生長因子，如PDGF-BB、bFGF、EGF、IGF-1，對核轉(zhuǎn)錄因子NF-B有誘導(dǎo)作用，且PDGF-BB為誘導(dǎo)效應(yīng)最強的生長因子之一，但生長抑制因子TGF-和IFN-對NF-B無此作用；PDGF作為刺激物可直接促NF-B表達及活性增強79。H2O2作用于人內(nèi)皮細胞，能誘導(dǎo)NF-B(p65) 的移位。本實驗的結(jié)果提示，低氧可活化肺動脈平滑肌細胞NF-B，但H2O2對肺動脈平滑肌細胞NF-B(p65) 的向核內(nèi)移位有明顯的抑制，免疫細胞化學(xué)實驗和Western印跡雜交結(jié)

24、果均顯示低氧的肺動脈平滑肌細胞核內(nèi)的p65極少。我們已往的實驗已證明，在低氧的條件下，表達增加的PDGF促進肺血管平滑肌細胞增殖，參與低氧性肺血管重建。本實驗結(jié)果顯示PDGF可使常氧的肺動脈平滑肌細胞 中H2O2濃度增高，但明顯降低低氧的肺動脈平滑肌細胞中H2O2的量；同一濃度的H2O2，作用于常氧的肺動脈平滑肌細胞，則引起核NF-B的表達增強，但對低氧的肺動脈平滑肌細胞核NF-B的表達有明顯的抑制作用。此結(jié)果表明，在低氧的肺血管平滑肌細胞中， H2O2所參與的PDGF受體信號傳導(dǎo)機制較體循環(huán)系統(tǒng)明顯不同，H2O2不是核轉(zhuǎn)錄因子NF-B的活化劑，而是一種抑制劑，對細胞可能產(chǎn)生損傷作用，PDGF

25、則可以降低H2O2的濃度，間接活化NF-B，即PDGF可通過減輕低氧的肺動脈平滑肌細胞中H2O2對細胞造成的損傷而使核轉(zhuǎn)錄因子NF-B在細胞核內(nèi)達到足夠的有效濃度，從而使胞內(nèi)與增殖相關(guān)的基因表達增強，最終達到低氧條件下表達增強的PDGF對低氧性肺動脈平滑肌細胞過度增殖的正反饋調(diào)節(jié)作用。低氧的肺動脈平滑肌細胞在不僅加入H2O2而且同時加入PDGF時，緩解NF-B表達的抑制。進一步證實了，PDGF對H2O2的逆轉(zhuǎn)作用?；痦椖?國家自然科學(xué)基金資助(No.39470301)黃群華（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理研究室，北京 100005）孫仁宇（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基

26、礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理生理研究室，北京 100005）參考文獻1Sundaresan M，Yu ZX，F(xiàn)errans VJ，et al. Requirement for platelet-derived growth factor signal transductionJ. Science，1995，270：296299.2Rao GN，Berk BC. Active oxygen species stimulate vascular smooth muscle cell growth and proto-oncogen expression J. Circ Res，1

27、992，70：593599.3 黃群華，孫仁宇. 低氧大鼠肺組織中血小板源生長因子在低氧性肺動脈平滑肌細胞增殖中的作用 J. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，1998，18：113117.4Montisano DF，Mann T，Spragg RG. H2O2 increases expression of pulmonary artery endothelial cell platelet-derived growth factor mRNA J. J Appl Physiol,1992，73(6)：22552262.5Castellot JJ，Pukac LA，Caleb BL，et al. Heparin selectively inhibits a PKC-dependent mechnism of cell cycle progression in calf aortic smooth muscle cells J. J Cel