達(dá)拉奉對血管性癡呆大鼠海馬線粒體COX活性及基因表達(dá)的影響

1、達(dá)拉奉對血管性癡呆大鼠海馬線粒體COX活性及基因表達(dá)的影響    【摘要】     目的 探討依達(dá)拉奉對血管性癡呆(VD)大鼠海馬組織的細(xì)胞色素C氧化酶(COX)活性及基因表達(dá)的影響。方法 采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎法制備慢性前腦缺血大鼠模型，分依達(dá)拉奉治療組(皮下注射，每日1次，3 mg/kg體重)，甲磺酸阿米三嗪(都可喜，灌胃，每日1次，20 mg/kg體重)組和模型組，另取正常大鼠為正常對照組。自手術(shù)7 d起給藥，共20 d后，各組分別取1及2個(gè)月為時(shí)間點(diǎn)，處死取腦，測定大鼠海馬組織COX活性及基因表

2、達(dá)并進(jìn)行基因突變分析。結(jié)果 提取各組大鼠海馬組織線粒體后，COX活性檢測結(jié)果顯示：術(shù)后1、2個(gè)月依達(dá)拉奉治療組COX活性明顯高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組(P<0.05)，并有高于都可喜組趨勢。依達(dá)拉奉治療組COX表達(dá)量高于模型組(P    【關(guān)鍵詞】  血管性癡呆;依達(dá)拉奉;細(xì)胞色素C氧化酶    The effect of edaravone on COX activity and gene expression of hippocampus mitochondria of vascular dement

3、ia ratsZHAO Qing，DU JianShi，XU ZhongXin,et al.Neurology Department, ChinaJapan Union Hospital of Jilin University, Changchun 130031,Jilin， China【Abstract】 Objective To explore the effect of the activity of cytochrome C oxidase (COX) and the expression of COX in the vascular dementia (VD) rats after

4、administrated with edaravone.Methods The VD rat model was established by permanent bilateral occlusion of both common carotid arteries.The rats were divided into 4 groups randomly as control，VD model (0.9% sodium chloride)，edaravone (3 mg/kg per day，for 20 d) and duxil groups (gastric perfusion，20 m

5、g/kg per day) after place navigation training.The treatment was from the 7th day after operation and lasted for 20 d.At the 1st and 2nd month the heads of rats were cut down for brain to measure the activity of COX and the change of genetic expression.Results The activity of COX in edaravone and dux

6、il group was higher significantly than that of model group(P【Key words】 Vascular dementia;Edaravone;Cytochrome C oxidase (COX)血管性癡呆(VD)是多種因素參與的復(fù)雜病理過程，而線粒體氧化損傷起重要作用1。細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase，COX)是線粒體電子傳遞鏈上的末端酶，也是電子傳遞鏈限速酶，在細(xì)胞能量代謝過程中起關(guān)鍵作用。神經(jīng)元功能活動(dòng)與COX活性密切相關(guān)。國內(nèi)外尚未見應(yīng)用自由基清除劑依達(dá)拉奉治療VD的研究。故本實(shí)驗(yàn)通過觀察依達(dá)拉奉對VD

7、大鼠COX的影響，探討其對VD大鼠的保護(hù)作用。1 材料與方法1.1 材料 雄性Wistar大鼠，體重300350 g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。RNA prep培養(yǎng)細(xì)胞總RNA提取試劑盒、組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。One Step RNA PCR Kit購自TaKaRa公司。其余試劑為國產(chǎn)分析純。1.2 動(dòng)物模型的制備及分組 采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎方法制備慢性前腦VD大鼠模型2。將VD模型鼠分為：依達(dá)拉奉(商品名必存，南京先生藥業(yè)公司)組(皮下注射，每日1次，3 mg/kg體重);甲磺酸阿米三嗪(都可喜)組(灌胃，每日1次，20 mg/kg體重)和模型組(

8、灌胃，每日1次，同容量生理鹽水)，各10只。另取10只鼠為正常對照組(灌胃，每日1次，同容量生理鹽水)，除不結(jié)扎、不剪斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，其余過程與模型大鼠相同，以減少手術(shù)損傷造成的誤差。各組大鼠手術(shù)7 d起給藥，共20 d后取1及2個(gè)月為時(shí)間點(diǎn)，處死取腦。1.3 大鼠海馬組織線粒體COX活性檢測 取1 h內(nèi)新鮮海馬組織約0.5 g提取線粒體。在冰浴中剪碎，加分離介質(zhì)約58 ml(成分為25 mmol/L 蔗糖，75 mmol/L 甘露糖，50 mol/L 乙二胺四乙酸鉀鹽(EDTAK)，10 mmol/L TrisHCl，0.1 mol/L KCl，并加入肝素50 U/ml，pH調(diào)至7.2)，

9、在冰浴中勻漿。制備好的肌勻漿在0下4 500 r/min離心5 min，留取上清。在0下10 000 r/min離心20 min，得到棕灰色沉淀少量，再用洗液(成分為25 mmol/L蔗糖，75 mmol/L甘露糖，50 mol/L EDTAK，0.1 mol/L KCl，pH調(diào)至7.4)洗2遍，離心后懸浮于0.3% 0.4 ml的分離介質(zhì)中備用。按文獻(xiàn)3的方法進(jìn)行COX活性檢測。取pH7.4的200 nmol/L的KH2PO4 0.5 ml，加入雙蒸水0.375 ml，2%(V/V)TritonX100 25 l，線粒體蛋白67 l(約2030 g)和細(xì)胞色素C 33 l(20 mg/ml，

10、用前以過量Vit C還原A550/A565>12)，用紫外分光光度計(jì)測定550 nm處細(xì)胞色素吸收值A(chǔ)的變化。1.4 RTPCR檢測線粒體COX的表達(dá)情況 按說明書操作。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)液(510 l)進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。用TAE(40 mmol/L TrisHAc，1 mmol/L EDTA)熱溶解0.8%1.2%瓊脂糖凝膠，稍冷后加入EB，鋪膠。DNA溶液中加凝膠加樣緩沖液(61)上樣電泳，電泳緩沖液也用1×TAE，電壓為15 V/cm。電泳結(jié)束后，凝膠內(nèi)DNA于紫外燈下觀察并拍照。1.5 大鼠海馬組織線粒體COX基因突變分析 提取組織基因組

11、DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)。根據(jù)GenBank登陸的大鼠mtDNA基因組(登陸號(hào)：X14848)全序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物。COX在mtDNA基因組的位置是nt6 9917 674，設(shè)計(jì)3對引物;COX在mtDNA基因組的位置是nt8 5849 367，設(shè)計(jì)3對引物(表1)。PCR反應(yīng)結(jié)束，取5 l PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測目的基因擴(kuò)增結(jié)果。瓊脂糖凝膠回收目的基因片段。切膠時(shí)請注意不要將DNA長時(shí)間暴露于紫外燈下，以防止DNA損傷。膠塊一定要充分融化，否則將會(huì)嚴(yán)重影響DNA回收率。測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。對所測得的序列在GenBank上進(jìn)行BLAST，分析突變位

12、點(diǎn)。表1 PCR擴(kuò)增引物1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。2 結(jié) 果2.1 各組大鼠海馬線粒體COX活性的影響 對各組大鼠海馬組織線粒體后COX活性檢測結(jié)果顯示：術(shù)后1、2個(gè)月依達(dá)拉奉治療組COX活性顯著高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組(P<0.05;與治療前比較：2)P<0.012.2 各組大鼠海馬線粒體COX基因表達(dá)的影響A.正常對照組;B.模型組;C.都可喜組;D.依達(dá)拉奉組;E：DNA marker(DL2000)圖1 各組大鼠海馬線粒體COX的表達(dá)正常對照組COX COX模型組COX COX都可喜組COX COX依達(dá)拉奉組

13、COX COX7 026 GCTGCC無義突變9 171 ATTCTT無義突變7 026 GCTGCC無義突變8 640 ACAACG無義突變7 026 GCTGCC無義突變8610 TATGATGluTyr7 018 CAAGAA8 616 AACAGCAsnSer7 132 ACAGCAThrAla9 182 AGCAGASerArg7 082 GTAGGAValGly8 641 GGACGAGlyArg7 082GTAGGAValGly9171 ATTCTTIleLeu7 026 GCTGCC無義突變8 846 GTCGCCValAla7 149 ACAACG無義突變9 396 CTTG

14、TTLeuVal7 132 ACAGCAThrAla9 182 AGCAGASerArg7 132 ACAGCAThrAla9 182 AGCAGASerArg7 040 ATAAAAIlelY7 180 CAACATGlnHis7 144 CACGACHisAsp7 144 CACGACHisAsp9396 CTTGTTLeuVal7 082 GTAGGAValGly7 189 CAACATGlnHis7 149 ACAACG無義突變7 149 ACAACG無義突變9397 CTTGGTLeuGly7 149 ACAACG無義突變7 199 CTGTTG無義突變7 385 TGAGTTSTO

15、PVal7 151 ACACCAThrPro7 339 TAGTAA無義突變7 386 ACTGCTThrAla7 429 AGAACAArgThrA：正常對照組COX1，B：模型組COX1，C：都可喜組COX1，D：依達(dá)拉奉COX1，E：正常對照組COX2，F(xiàn)：模型組COX2，G：都可喜組COX2，H：依達(dá)拉奉COX2，Mk：DNA Marker(DL2000)，I：正常對照組COX3，J：模型組COX3，K：都可喜組COX3，L：依達(dá)拉奉COX3，M：正常對照組COX4，N：模型組COX4，O：都可喜組COX4，P：依達(dá)拉奉COX4，Q：正常對照組COX5，R：模型組COX5，S：都可喜組

16、COX5，T：依達(dá)拉奉COX5，U：正常對照組COX6，V：模型組COX6，W：都可喜組COX6，X：依達(dá)拉奉COX6，Mk：DNA Marker(DL2000)圖2 PCR擴(kuò)增COX、COX基因片段結(jié)果3 討 論腦組織富含線粒體(mitochondria)，既是細(xì)胞呼吸和能量代謝的重要場所，又是氧自由基產(chǎn)生的主要部位。由于腦組織有較多的不飽和脂肪酸，耗氧量大，而抗氧化酶活性相對較低，因此易遭受自由基的氧化損傷。大量自由基一方面可引起線粒體結(jié)構(gòu)和功能受損，影響丙酮酸脫氫酶的活性，使葡萄糖的氧化分解發(fā)生障礙，乙酰膽堿合成不足4，導(dǎo)致癡呆患者學(xué)習(xí)記憶呈漸進(jìn)性減退;另一方面，大量自由基還可損傷線粒體

17、DNA(mtDNA)，導(dǎo)致其編碼的呼吸鏈復(fù)合物酶蛋白亞基表達(dá)下降，酶活性降低，進(jìn)一步危害能量代謝機(jī)制5。而線粒體又是細(xì)胞的能量代謝中心，已有許多研究報(bào)道，缺血時(shí)線粒體發(fā)生腫脹、變性、空洞化、數(shù)量減少等一系列退行性改變，因而線粒體被認(rèn)為在細(xì)胞缺血中具有重要的作用6，7。COX是細(xì)胞色素類物質(zhì)，是線粒體的標(biāo)志酶之一，定位于線粒體內(nèi)膜，是呼吸鏈集合體中電子傳遞鏈的末端酶及關(guān)鍵酶。與有氧代謝及內(nèi)呼吸密切相關(guān)，其活力直接影響線粒體氧化磷酸化過程，能真實(shí)地反映腦的能量代謝，是一個(gè)具有高敏感性、可信性和可重復(fù)性的內(nèi)源性代謝標(biāo)記物。有研究表明，其活力下降會(huì)造成神經(jīng)細(xì)胞氧化磷酸化功能障礙和ATP合成減少8。缺氧

18、時(shí)，COX等有氧代謝酶系活性下降9。其原因是由于線粒體損傷，海馬細(xì)胞中線粒體進(jìn)行氧化磷酸化、合成ATP的能力下降，其內(nèi)酶擴(kuò)散至胞液或進(jìn)一步擴(kuò)散到細(xì)胞外，從而導(dǎo)致活性下降;或由于細(xì)胞缺氧，電子傳遞鏈不能及時(shí)將電子傳給O2·，以及電子傳遞鏈上的COX等蛋白質(zhì)停滯于還原狀態(tài)所致10，11。本研究結(jié)果顯示：依達(dá)拉奉治療后COX活性及COX表達(dá)量較模型組顯著增加。模型組COX基因有5處突變，與正常對照組比，新出現(xiàn)2處突變，是堿基替換，7 082位的TG，氨基酸由ValGly，7 144位的CG，氨基酸由HisAsp，比正常對照組少了4個(gè)突變位點(diǎn);依達(dá)拉奉組新出現(xiàn)3處基因突變，比正常對照組少3個(gè)突變位點(diǎn)。與模型組比，依達(dá)拉奉組新出現(xiàn)3處基因突變，少3處突變位點(diǎn)。與正常對照組比，模型組COX基因新出現(xiàn)2個(gè)突變位點(diǎn)，是堿基替換，其中有1處是無義突變，另一處是8 641 GGACGA，氨基酸GlyArg，但比正常對照組少了1個(gè)突變位點(diǎn)。依達(dá)拉奉組新出現(xiàn)2個(gè)突變位點(diǎn)，突變頻率減少，沒有對照組的突變位點(diǎn)。