食品中腐敗菌的分離純化及生物學性狀觀察

1、微生物學大實驗食品中腐敗菌的分離純化及生物學性狀觀察（標題小四黑體，正文小四宋體，段前、段后0， 行距20磅）專 業(yè) 班 級 姓 名 同 組 人 日 期 0 前言食品腐敗變質(zhì)是指食品受到各種內(nèi)外因素（例如溫度，氣體等）的影響，造成其原有物理性質(zhì)或化學性質(zhì)發(fā)生變化，降低或失去其營養(yǎng)價值和商品價值的過程。食品腐敗變質(zhì)的過程實質(zhì)上是食品中碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪在污染微生物的作用下分界變化、產(chǎn)生有害物質(zhì)的過程。本次實驗以略微腐爛的蘋果、栗子、香蕉，飲料為材料，運用三區(qū)劃線、傾注、點植、涂布等方法從中分離出腐敗菌，觀察和分析其菌種及菌落形態(tài)。1 試驗材料和儀器設(shè)備11試驗材料食材：土豆、蘋果、栗子、香

2、蕉、飲料。試劑：營養(yǎng)瓊脂粉、麥芽粉、瓊脂粉、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、磷酸氫二鈉、溴麝香草酚蘭溶液、草酸結(jié)晶紫、碘液、95%酒精、沙黃、生理鹽水、0.1%呂氏堿性美藍染液、自來水等。12儀器設(shè)備 試驗儀器：顯微鏡、蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、試管、酒精燈、接種針（環(huán)）、針、培養(yǎng)皿、蓋玻片、載玻片、三角玻璃涂布棒等。2 試驗方法2.1培養(yǎng)基的制備營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基稱取4.5克營養(yǎng)瓊脂粉，加入100ml水加熱溶解，分裝，在121下蒸汽滅菌。20min后取出導(dǎo)入無菌平皿中冷卻凝固。土豆培養(yǎng)基將去皮土豆200g切成2cm左右小塊加入1000ml水煮沸10min，過濾補充水份，加入20g瓊脂粉，20g葡萄

3、糖，加熱溶化，分裝，121下蒸汽滅菌20min。麥芽汁培養(yǎng)基稱取5g麥芽粉加入100ml和2g瓊脂，在115下蒸汽滅菌20min。糖發(fā)酵培養(yǎng)基的制備.1葡萄糖發(fā)酵管取0.25g葡萄糖加入100ml的已配置好的糖溶液混合均勻即可.2葡萄糖發(fā)酵管取0.25g乳糖加入100ml已配置好的糖溶液混合均勻即可.3麥芽糖發(fā)酵管取0.25g麥芽糖加入100ml已配置好的糖溶液混合均勻即可.4蔗糖發(fā)酵管取0.25g蔗糖加入100ml已配置好的糖溶液混合均勻即可.5甘露醇發(fā)酵管取0.25g甘露醇加入100ml已配置好的糖溶液混合均勻即可注:糖溶液: 蛋白胨2g,0,04%溴甲酚紫水溶液2.5ml,蒸餾水100m

4、l,調(diào)pH為7.4 分別吸取上述五種糖溶液5ml放在試管中,并放入一個小倒管.每種取兩支試管.在培養(yǎng)箱中供糖發(fā)酵試驗使用.22 分離方法221三區(qū)劃線法使用接種環(huán)，將其燒灼，待冷卻后，取菌。然后在酒精燈附近，將已沾菌的接種環(huán)在瓊脂表面密集而不重疊的來回劃線，面積約占整個平板的1/3-1/2，此為第一區(qū)。 再將接種環(huán)上多余的細菌燒灼，待冷后，在第一區(qū)劃線末端，再劃下一區(qū)域，面積約占1/4面積，此為第二區(qū)。 用同樣方法劃第三區(qū)，劃滿整個平皿。 222點植法 使用接種針，將其燒灼，然后在培養(yǎng)皿上點一下以降溫，取菌。然后在酒精燈附近，將已沾菌的接種針在培養(yǎng)皿中點上一點。用相同的方法在培養(yǎng)基上

5、點第二個點，直至培養(yǎng)基上呈現(xiàn)均勻的六個點。223涂布法 使用三角玻璃涂布棒，在蒸汽滅菌鍋內(nèi)滅菌，待冷卻后，取菌，然后將菌均勻的涂在培養(yǎng)皿上。23 培養(yǎng)231細菌在37±1恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。232酵母菌在28恒溫培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。233霉菌在28恒溫培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。24 鑒定24.1形態(tài)鑒定.細菌：做革蘭氏染色試驗。a. 涂片 將培養(yǎng)的不同菌分別做涂片，干燥、固定。固定時通過火焰12次即 可， 不可過熱，以載玻片不燙手為宜。b. 染色 初染 加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗。 媒染 滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。 脫色 將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，

6、用95%酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，約2030s，立即用水沖凈酒精。 復(fù)染 用番紅液染12min，水洗。 鏡檢 干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。.酵母菌：a.在載玻片中央加一滴0.1%呂氏堿性美藍染液，按無菌操作法在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上取培養(yǎng)48小時的菌種少許，放在呂氏堿性美藍染液中，使菌體與染液均勻混合。b.蓋玻片，放置3min后鏡檢。先用低倍鏡觀察，然后換用高倍鏡觀察菌體形態(tài)和出芽情況，同時根據(jù)是否染上顏色來區(qū)別死、活細胞。.霉菌：制片觀察，霉菌的組織狀態(tài)及孢子形狀。在載玻片中央滴加一滴乳酸酚用針挑取菌落周邊放在乳酸酚中攪拌均勻,蓋上薄片至于顯微鏡觀察.

7、 生理鑒定細菌：糖發(fā)酵試驗。用接種環(huán)在酒精燈上經(jīng)滅菌后分別接種在五種糖溶液的試管中,在37±1恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后觀察其產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況3 結(jié)果與討論3.1細菌菌落的形態(tài)：培養(yǎng)結(jié)果：如下圖是香蕉培養(yǎng)菌落(圖一)和栗子培養(yǎng)菌落(圖二) 圖 一(涂布法) 圖 二(點植法)結(jié)果分析: 香蕉中分離的菌落為微小較為規(guī)則的圓形，顏色為近似乳白色。在37±1恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后可嗅到一種特殊的臭味。說明該細菌在溫暖，富含有機物質(zhì)的培養(yǎng)基中能夠正常的旺盛的生長。栗子中分離的菌落為不規(guī)則橢圓形，顏色為乳白色和少許黃色兩種,一部分表面干癟無光澤且多褶皺,為菌落變老,中心隆起較高呈突臍狀，

8、直徑在0.8-1.0cm之間。該菌在土豆瓊脂培養(yǎng)基中繁殖旺盛,有嗜糖的特性,而且該菌落特征符合細菌菌落特征,因此初步判定該菌種為細菌。不同菌落革蘭氏染色的結(jié)果1）栗子中菌落革蘭氏染色結(jié)果在顯微鏡下的觀察結(jié)果如下圖（圖三）： 圖 三結(jié)果分析：在顯微鏡（油鏡）下可清楚觀察到該細菌經(jīng)革蘭氏染色后呈現(xiàn)紅色，為革蘭氏陰性菌，且菌體均無芽孢，成短桿狀，所以為革蘭氏陰性無芽孢桿菌。 2)香蕉中菌落經(jīng)革蘭氏染色后在顯微鏡下的觀察結(jié)果如下圖（圖四）： 圖 四結(jié)果分析:革蘭氏染色可通過顯微鏡觀察到該菌也呈紅色，可判斷該菌種為革蘭氏陰性,且菌體較小無芽孢，成微小不規(guī)則桿狀形, 為短桿菌屬。3.2酵母菌菌落的形態(tài) 培

9、養(yǎng)的結(jié)果:從腐爛的蘋果中經(jīng)過麥芽培養(yǎng)基的培養(yǎng)分離得到的菌落形態(tài)如下圖(圖五)： 圖 五（三區(qū)劃線法）結(jié)果分析:從腐爛的蘋果中分離的菌落呈乳白色,較不透明整體顏色一致，菌落質(zhì)地均勻邊緣整齊，該菌落成圓形，表面濕潤光滑，富有光澤，直徑1cm左右。該菌種在麥芽培養(yǎng)基中生長,主要用于鑒定酵母菌，而且菌落形態(tài)與酵母菌菌落形態(tài)相似，所以，該菌最有可能是酵母菌。顯微鏡觀察結(jié)果 在載玻片上滴一滴生理鹽水,用接種環(huán)滅菌后取該菌落在載玻片上,再滴一滴伊紅美蘭,蓋片后在顯微鏡下可觀察的形態(tài)如下圖(圖六). 圖 六結(jié)果分析:通過顯微鏡低倍鏡可直接觀察到該菌體，說明該菌個體形態(tài)較大。且能被堿性美藍染液染色成淡藍色和藍色.再通過油鏡可明顯觀察到該菌具體形態(tài),該菌落為均勻球型，綜合上述特征可判斷其為酵母菌3.3霉菌 菌落的形態(tài)從腐爛的蘋果中分離得到的菌種經(jīng)土豆培養(yǎng)基的培養(yǎng)形成的菌落如圖(圖七)： 圖七結(jié)果分析:該菌落形態(tài)較大,質(zhì)地疏松,表面干燥且不透明呈棉絮狀交織,菌落與培養(yǎng)基間連接緊密,不易挑取,菌落的正面與反面的顏色、構(gòu)造，以及邊緣與中心