多肽類藥物制劑研究現(xiàn)狀 - 方宏清-

1、多肽類藥物制劑研究現(xiàn)狀方宏清(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所北京100071摘要多肽類藥物制劑研究面臨的主要問題是多肽的穩(wěn)定性不好、體內(nèi)半衰期短和生物膜透過性差。本文綜述了多肽類藥物不穩(wěn)定的原因;提高多肽穩(wěn)定性的方法;多肽類藥物制劑貨架時(shí)間的確定;多肽類藥物的分析手段;多肽類藥物的控釋研究;多肽的非注射途徑給藥研究。最后還提出了多肽類藥物制劑研究的展望。關(guān)鍵詞多肽藥物制劑穩(wěn)定性控制釋放非注射途徑給藥隨著生物技術(shù)的發(fā)展,多肽作為藥物在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛,相應(yīng)的制劑學(xué)研究也日益受到重視。與傳統(tǒng)的小分子有機(jī)藥物相比,多肽具有穩(wěn)定性差,體內(nèi)半衰期短和不易通過生物膜等特點(diǎn)。本文從穩(wěn)定性、緩釋系統(tǒng)、非注

2、射途徑給藥三方面對(duì)多肽類藥物制劑的研究概況進(jìn)行介紹。1多肽的穩(wěn)定性研究1.1引起多肽不穩(wěn)定的原因13(1脫酰胺反應(yīng)在脫酰胺反應(yīng)中, Asn/Gln殘基水解形成Asp/Glu。非酶催化的脫酰胺反應(yīng)與環(huán)境條件和多肽的結(jié)構(gòu)有關(guān)。提高pH值、升高溫度都將有利于脫酰胺反應(yīng)的進(jìn)行。在-Asn-Gly-結(jié)構(gòu)中的酰胺基團(tuán)更易水解,位于分子表面的酰胺基團(tuán)也比分子內(nèi)部的酰胺基團(tuán)易水解。(2氧化多肽溶液易氧化的主要原因有兩種,一是溶液中有過氧化物的污染,二是多肽的自發(fā)氧化。在所有的氨基酸殘基中, Met、Cys和H is、Trp、Ty r等最易氧化。氧分壓、溫度和緩沖溶液對(duì)氧化也都有影響。(3水解多肽中的肽鍵易水解

3、斷裂。由Asp參與形成的肽鍵比其它肽鍵更易斷裂,尤其是Asp-Pro和Asp-Gly肽鍵。(4形成錯(cuò)誤的二硫鍵二硫鍵之間或二硫鍵與巰基之間發(fā)生交換可形成錯(cuò)誤的二硫鍵,導(dǎo)致三級(jí)結(jié)構(gòu)改變和活性喪失。(5消旋除Gly外,所有氨基酸殘基的碳原子都是手性的,易在堿催化下發(fā)生消旋反應(yīng)。其中Asp殘基最易發(fā)生消旋反應(yīng)。(6-消除-消除是指氨基酸殘基中碳原子上基團(tuán)的消除。Cys、Ser、Th r、Phe、Ty r等殘基都可通過-消除降解。在堿性p H 下易發(fā)生-消除,溫度和金屬離子對(duì)其也有影響。(7變性、吸附、聚集或沉淀變性一般都與三級(jí)結(jié)構(gòu)以及二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞有關(guān)。在變性狀態(tài),多肽往往更易發(fā)生化學(xué)反應(yīng),活性難以

4、恢復(fù)。在多肽變性過程中,首先形成中間體。通常中間體的溶解度低,易于聚集,形成聚集體,進(jìn)而形成肉眼可見的沉淀。蛋白質(zhì)的表面吸附是其貯存、使用過程中遇到的另一個(gè)令人頭痛的問題,如r IL-2在進(jìn)行灌注時(shí)會(huì)吸附在管道表面,造成活性損失4。1.2提高多肽穩(wěn)定性的途徑1,3(1定點(diǎn)突變通過基因工程手段替換引起多肽不穩(wěn)定的殘基或引入能增加多肽穩(wěn)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院青年科研基金資助項(xiàng)目定性的殘基,可提高多肽的穩(wěn)定性。(2化學(xué)修飾多肽的化學(xué)修飾方法很多,研究最多的是PEG修飾。PEG是一種水溶性高分子化合物,在體內(nèi)可降解,無毒。PEG與多肽結(jié)合后能提高熱穩(wěn)定性,抵抗蛋白酶的降解,降低抗原性,延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期5。選擇合

5、適的修飾方法和控制修飾程度可保持或提高原生物活性。(3添加劑通過加入添加劑,如糖類、多元醇、明膠、氨基酸和某些鹽類,可以提高多肽的穩(wěn)定性6。糖和多元醇在低濃度下迫使更多的水分子圍繞在蛋白質(zhì)周圍,因而提高了多肽的穩(wěn)定性。在凍干過程中,上述物質(zhì)還可以取代水而與多肽形成氫鍵來穩(wěn)定多肽的天然構(gòu)象,而且還可以提高凍干制品的玻璃化溫度。此外表面活性劑如SDS、Tw een、Pluro-nic,能防止多肽表面吸附、聚集和沉淀。(4凍干多肽發(fā)生的一系列化學(xué)反應(yīng)如脫酰胺、-消除、水解等都需要水參與,水還可以作為其它反應(yīng)劑的流動(dòng)相。另外,水含量降低可使多肽的變性溫度升高7。因此,凍干可提高多肽的穩(wěn)定性。1.3多肽

6、類藥物制劑的存放時(shí)間測(cè)定對(duì)動(dòng)力學(xué)行為符合Arrhenius公式的藥劑,可利用加速實(shí)驗(yàn)確定存放時(shí)間,但要求反應(yīng)活化能是獨(dú)立于溫度的常數(shù)。通常認(rèn)為基于Arrhenius公式的穩(wěn)定性預(yù)測(cè)不適于多肽制劑,這是因?yàn)樵谶M(jìn)行蛋白質(zhì)藥物加速實(shí)驗(yàn)時(shí)有三個(gè)問題難以解決:(1多肽的降解途徑較多,各途徑活化能不同,升高溫度會(huì)改變多肽降解的主要方式;(2溫度會(huì)改變多肽的構(gòu)象,從而改變降解反應(yīng)的活化能;(3對(duì)凍干制品,若實(shí)驗(yàn)溫度高于玻璃化溫度(Tg,固體制劑將由玻璃態(tài)變?yōu)檎乘苄誀顟B(tài),化學(xué)反應(yīng)速率將急劇增加,從高于Tg獲得的數(shù)據(jù)就不能外推到低于Tg時(shí)的情況。但是,如果能解決上述問題,利用加速實(shí)驗(yàn)進(jìn)行穩(wěn)定性預(yù)測(cè)就可以成為評(píng)價(jià)

7、多肽藥物制劑的有效工具。Yo shio ka等人8通過加速實(shí)驗(yàn)確定了六種多肽制劑在25存放的有效時(shí)間,結(jié)果表明與實(shí)測(cè)結(jié)果基本接近。這說明在一定條件下可用加速實(shí)驗(yàn)估算多肽制劑的貨架時(shí)間,特別是在研究初期,用加速實(shí)驗(yàn)可節(jié)省大量時(shí)間和物力。但是,最終貨架時(shí)間的確定還是需要采用留樣觀察法。1.4多肽類藥物制劑的分析手段多肽類藥物制劑研究常用的分析手段有:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法、凝膠過濾層析法、反相液相層析法、紫外光譜法、熒光光譜法、紅外光譜法、圓二色性光譜法、量熱法以及生物活性測(cè)定法9。這里僅介紹藥物制劑研究中常用的一種方法量熱法(Calorimetry。量熱法是通過測(cè)定樣品在受

8、熱過程中的放熱和吸熱行為來研究樣品中各組份的相互作用及狀態(tài)變化的一種方法,常用的是差示掃描量熱法(Differentiat Sca nning Calo rim etry。該方法廣泛用于多肽的熱穩(wěn)定性分析、各種添加劑對(duì)多肽結(jié)構(gòu)的影響、多肽與配基之間的相互作用等研究,還用于測(cè)定凍干物品的玻璃化溫度和共熔點(diǎn)。例如, Chan等10用DSC研究了添加劑對(duì)rh DNase 溶液熱變性的影響。蛋白質(zhì)濃度為10mg/ ml,掃描速率為1.2/min。測(cè)得rh DNase 在純水中的Tm=67.4,Hm=18.0J/g。加入Ca2+有利于rh DNa se的熱穩(wěn)定,加入Mg2+、M n2+則不利于rhDNa

9、se的穩(wěn)定。當(dāng)Ca Cl2濃度為20100mmol/L時(shí),Tm=76. 4,Hm=2022J/g。Ca Cl2和乳糖對(duì)rh D-Nase的穩(wěn)定有復(fù)合作用。同時(shí)加50mmol/L Ca Cl2和100mg/ml乳糖,可使rh DNase的Tm值提高到76.4,Hm值到21.9J/g。Chang等11用DSC測(cè)定了rh IL-lra制劑的玻璃化溫度、反玻璃化溫度和共熔點(diǎn)。冷凍蛋白制劑的各種物理變化,如玻璃化、反玻璃化和共熔都會(huì)影響凍干過程。根據(jù)測(cè)定結(jié)果,作者確定了凍干溫度和升溫速度,僅用6個(gè)小時(shí)就完成凍干過程。2多肽類藥物的緩釋制劑研究多肽類藥物在血液中的半衰期一般很短,靜脈注射后很快就被清除或降

10、解,因此需要經(jīng)常給藥,給病人帶來較多不便。為了減少給藥次數(shù)可采用緩釋或控釋技術(shù):(1在注射液中加入高分子聚合物(如透明質(zhì)酸,提高粘度、延緩藥物擴(kuò)散速度;(2將多肽包裹在脂質(zhì)體中,使多肽從脂質(zhì)體中緩慢釋放出來;(3將多肽包裹在固體微粒中,使多肽從微粒中緩慢釋放出來。在上述方法中研究最多的是微粒遞釋系統(tǒng)。適于制備微粒的生物可降解材料有:聚乳酸、丙交酯和乙交酯共聚物(PLC A、聚己內(nèi)酯、聚氨基酸、聚原酸酯、聚酐、聚腈基丙烯酸烷基酯12。多肽的微囊大多采用聚酯材料,特別是用PLGA。PLGA微粒釋放蛋白質(zhì)的典型曲線分三相:起始爆釋相、擴(kuò)散控釋相和分解控釋相。起始爆釋是指位于微粒表面或近表面的蛋白質(zhì)在

11、幾小時(shí)內(nèi)的快速釋放。擴(kuò)散控釋是蛋白質(zhì)通過微粒中孔道擴(kuò)散釋放。為了獲得連續(xù)釋放,擴(kuò)散控釋相必須與分解控釋相重疊,聚合物分解形成的孔隙使包裹的蛋白質(zhì)連續(xù)釋放。而主要的困難是降低起始爆釋,增加藥物載量。已用該法制備了許多肽和多肽的微粒劑型,如LHRH、T RH、Insulin、GH、SOD、TN F、IFN、IL-2、EPO等。其中LHRH類似物leuprolide的微粒制劑可控制釋放藥物長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月,并于1988年首先在法國(guó)上市,隨后又在歐美40個(gè)國(guó)家上市,1993年起在我國(guó)銷售。美國(guó)Genetech公司的研究人員也成功地制備了連續(xù)釋放一個(gè)月的rh GH和IFN-微囊制劑13,14。3非注射給藥途徑

12、研究多肽類藥物分子量大,脂溶性差,難以透過生物膜,一般只能注射給藥。但注射給藥、尤其是那些需要頻繁給藥的藥物,對(duì)病人來說是極其不便的。因此有必要進(jìn)行多肽的非注射給藥途徑研究。文獻(xiàn)報(bào)道的多肽非注射給藥研究途徑有:鼻腔、肺部、眼、舌下、口服、直腸、陰道、皮膚等,其中研究最多的是鼻腔給藥、肺部給藥和口服給藥。3.1鼻腔給藥鼻腔部位存在豐富的毛細(xì)血管和淋巴管,鼻腔上皮與血管壁緊密相連,上皮細(xì)胞間間隙較大,具有較高的滲透性,能避免肝臟的首過效應(yīng),鼻腔部位蛋白酶含量也比胃腸中少。低分子量的藥物極易被吸收進(jìn)入血液循環(huán)。對(duì)分子量較大的多肽,如降鈣素、胰島素、G-CSF、EPO等,在合適的吸收促進(jìn)劑幫助下,也可

13、被吸收,但生物利用度較低15。鼻腔給藥的方式有滴鼻給藥法和噴霧給藥法,采用后一方法可獲得相對(duì)較高的生物利用度。目前降鈣素(32肽已有鼻腔遞釋制劑在歐洲、日本及美國(guó)上市,盡管其絕對(duì)生物利用度不足1%。1990年在美國(guó)上市的Nafa relin (十肽鼻腔噴霧劑,其生物利用度也僅2. 8%。3.2肺部給藥人肺的吸附表面積有140m2,血流量達(dá)5000m l/min,蛋白酶活性相對(duì)于胃腸道較低,不存在肝臟首過效應(yīng)。肺泡壁比毛細(xì)血管壁還要簿,通透性好。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明一些多肽藥物經(jīng)肺給藥后生物利用度相當(dāng)高,可達(dá)20%50%。但某些多肽易被肺中蛋白酶降解,還有一些多肽在形成氣溶膠微粒時(shí)會(huì)變性。哪一種多肽適合

14、于經(jīng)肺給藥需逐例分析研究。選用合適的給藥裝置將藥物輸送至肺泡組織是肺部釋藥的關(guān)鍵。粉霧劑將是肺部遞釋的主要?jiǎng)┬?6。理想的粉霧劑應(yīng)是:粉末處方組分在低流速和低壓力差時(shí),大部分藥物粒子能夠解聚,進(jìn)入粉霧氣流中;吸入裝置則易產(chǎn)生流速較高的湍流。目前多肽的肺部給藥還處在研究階段,除Pulm ozy me(作用于肺部外17,還沒有一種多肽藥物的肺部遞釋制劑上市。3.3口服給藥口服給藥是最受人們歡迎的給藥途徑,多肽類藥物也不例外。但是正常情況下,大多數(shù)肽類藥物很少或不能經(jīng)胃腸道吸收。其原因主要有:(1多肽分子量大,脂溶性差,難以通過生物膜屏障;(2胃腸道中存在著大量肽水解酶和蛋白水解酶可降解多肽;(3吸

15、收后易被肝臟消除(首過效應(yīng);(4存在化學(xué)和構(gòu)象不穩(wěn)定問題。目前人們研究的重點(diǎn)放在克服前兩個(gè)障礙上,即如何提高多肽的生物膜透過性和抵抗蛋白酶降解這兩個(gè)方面18。使用吸收促進(jìn)劑來提高生物膜通透性是目前研究中采用的主要方法。文獻(xiàn)報(bào)道的促進(jìn)劑包括水楊酸、膽酸鹽、脂肪酸、螯合劑、?；鈮A等。而Emisphere公司的研究人員在研究中發(fā)現(xiàn)某些氨基酸衍生物能夠促進(jìn)降鈣素、干擾素和生長(zhǎng)激素的口服吸收。大量研究還表明吸收促進(jìn)劑具有多肽特異性。提高生物膜通透性的其它方法還有:(1將多肽與V B12連接,通過受體介導(dǎo)吸收;(2用脂肪酸修飾多肽,提高脂溶性。文獻(xiàn)報(bào)道的克服多肽口服吸收酶障的途徑有:(1用PEG修飾多肽

16、,抵抗酶解;(2使用酶抑制劑;(3應(yīng)用微乳制劑;(4應(yīng)用納粒(na no particle.制劑;(5應(yīng)用生物粘附性顆粒。直徑為100nm的PLG納粒在腸道中能大部分被吸收19,突破酶障和膜障。美國(guó)藥物開發(fā)公司應(yīng)用Technosphere技術(shù)制備降鈣素的口服制劑,在狗體內(nèi)的絕對(duì)生物利用度達(dá)26%。除環(huán)孢菌(環(huán)肽外,至今還未見多肽口服制劑的臨床應(yīng)用報(bào)道。據(jù)稱Cortecs公司的降鈣素口服制劑已進(jìn)入期臨床研究,有望成為第一個(gè)真正的多肽口服制劑。此外,在多肽透皮給藥方面也有新進(jìn)展。利用超聲技術(shù)可使皮膚上形成小孔,促進(jìn)多肽透皮吸收20。結(jié)語多肽的不穩(wěn)定性是其制劑研究中存在的主要問題之一,其原因較多。但

17、對(duì)某一個(gè)多肽藥物來說引起不穩(wěn)定的主要原因并不多。詳細(xì)研究外界條件(如pH、溫度、光照、氧濃度等對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響有助于設(shè)計(jì)合理的制劑配方。盡管添加劑穩(wěn)定多肽的機(jī)制還不十分清楚,使用添加劑仍是目前提高多肽制劑穩(wěn)定性的主要手段之一。應(yīng)用CD、DSC等分析手段可幫助快速篩選到合適的添加劑。應(yīng)用微粒系統(tǒng)控制釋放多肽藥物是目前多肽緩釋研究中的方向之一。這方面研究的主要難點(diǎn)有:(1改善微粒制備方法,提高收率;(2解決微粒制備過程中多肽的穩(wěn)定性;(3提高藥物載量;(4降低起始爆釋率,獲得藥物連續(xù)釋放。目前國(guó)外一些生物技術(shù)制藥公司與藥物控釋研究公司利用各自的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行合作,研究開發(fā)進(jìn)展較快。國(guó)內(nèi)這方面研究也已開

18、始。近年來對(duì)多肽的非注射途徑給藥研究雖取得一些進(jìn)展,但面臨的困難仍然很多。幾乎所有多肽藥物的粘膜傳遞都需要滲透促進(jìn)劑,而其種類繁雜,存在的問題是如何降低其刺激作用以及長(zhǎng)期使用是否影響上皮完整性。用微粒代替滲透促進(jìn)劑也許是很有前景的口服給藥方法。目前,在克服滲透障和酶障方面雖取得了一些成績(jī),但尚無突破性進(jìn)展。另外,多肽的肝清除問題應(yīng)該受到重視,弄清肝清除機(jī)制、結(jié)構(gòu)與清除之間的關(guān)系將有助于實(shí)現(xiàn)多肽口服給藥的夢(mèng)想。本文承蒙黃培堂研究員、于公義研究員和朱厚礎(chǔ)研究員審閱,謹(jǐn)此致謝。參考文獻(xiàn)1M a nning M C,Pa tel K,Bo rchardt RT.Sta bility o f pro t

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30、e prospects of resea rch on the preparati ons of po lypeptide drug w ere present ed. Key Words Poly pepti eds Prepa ra tions of Drug St abilit y Co ntro lled release No npa -renteral admi nist ra tio n ( 收稿 : 1997-07-08 非肽類纖維蛋白原受體拮抗劑的研究進(jìn)展 許天林華維一倪沛洲 (中國(guó)藥科大學(xué)新藥研究中心 南京 210009 摘 要 纖維蛋白原受體 拮抗劑能阻止通過 各種途徑激活的血 小板聚集 ,因 而可以有效地抑 制血栓的形成 。 本文綜述非肽類纖維