醫(yī)學(xué)專題—--細(xì)胞融合與單克隆抗體10.25課件VIP

1、1醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.25第五章第五章 細(xì)胞融合與單克隆抗體細(xì)胞融合與單克隆抗體(kngt)(kngt)第一頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.252本章主要內(nèi)容：本章主要內(nèi)容：細(xì)胞融合的基本概念細(xì)胞融合的基本概念人工人工(rngng)(rngng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)雜種細(xì)胞的篩選雜種細(xì)胞的篩選細(xì)胞雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體細(xì)胞雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體人源單克隆抗體人源單克隆抗體第二頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.253細(xì)胞融合（細(xì)胞融合（cell fusion)，是指在離體條件下將不同是指在離體條件下將不同(b tn)種生物或同種生

2、種生物或同種生物不同物不同(b tn)類型的單細(xì)胞通過(guò)無(wú)性方式融合成一個(gè)雜合細(xì)胞的技術(shù)。類型的單細(xì)胞通過(guò)無(wú)性方式融合成一個(gè)雜合細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞融合技術(shù)的出現(xiàn)標(biāo)志著細(xì)胞工程的誕生！一、細(xì)胞融合的定義一、細(xì)胞融合的定義(dngy)第三頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.254第四頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.255自發(fā)自發(fā)(zf)細(xì)胞融合細(xì)胞融合（一）細(xì)胞膜融合(rngh) 受精過(guò)程（二）體內(nèi)細(xì)胞的自發(fā)融合 1、肌管的形成 2、胚胎著床 3、巨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的形成 4、腫瘤細(xì)胞的融合第五頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.256顯微鏡下細(xì)胞融合

3、過(guò)程顯微鏡下細(xì)胞融合過(guò)程(guchng)第六頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.257二、人工(rngng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合 誘導(dǎo)細(xì)胞融合的主要方法有： 病毒誘導(dǎo)融合(rngh) 化學(xué)融合劑誘導(dǎo)融合 物理方法（電融合） 第七頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.258二、人工(rngng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合 （一）病毒(bngd)誘導(dǎo)的細(xì)胞融合 有許多種類的病毒能介導(dǎo)細(xì)胞融合，如皰疹病毒、副粘液病毒、雞新城疫病毒等。其中最常用的是滅活的仙臺(tái)病毒（HVJ）,為RNA病毒。 第八頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.259滅活的病毒顆粒黏附于細(xì)胞表面滅活的病毒顆粒

4、黏附于細(xì)胞表面細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜被病毒顆粒穿通細(xì)胞膜連接細(xì)胞膜連接細(xì)胞融合，形成雜種細(xì)胞細(xì)胞融合，形成雜種細(xì)胞（細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性）（細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性）生物生物(shngw)法：法：滅活的病毒滅活的病毒(bngd)（喪失感染性、保留（喪失感染性、保留(boli)抗原結(jié)構(gòu)）抗原結(jié)構(gòu)）第九頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2510病毒促使病毒促使(csh)細(xì)胞融合的主要步驟：細(xì)胞融合的主要步驟：兩個(gè)原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近；通過(guò)病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透；兩個(gè)原生質(zhì)體的細(xì)胞核互相融合，兩個(gè)細(xì)胞融為一體；進(jìn)入正常

5、的細(xì)胞分裂途徑，分裂成含有(hn yu)兩種染色體的雜種細(xì)胞。第十頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2511化學(xué)融合劑主要有高級(jí)脂肪酸衍生物（如甘油-醋酸酯、油酸、油胺等）、脂質(zhì)體（如磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸等）、鈣離子、水溶性高分子化合物（如聚乙二醇）、水溶性蛋白質(zhì)和多肽（如牛血清白蛋白、多聚L-賴氨酸等），其中最常用的是聚乙二醇（PEG）。 1、聚乙二醇(PEG)法 2、 Ca2+法 3、溶血(rn xu)卵磷脂 優(yōu)點(diǎn)是易得，用法簡(jiǎn)單，融合效果穩(wěn)定。( (二二) ) 化學(xué)方法化學(xué)方法(fngf)誘導(dǎo)細(xì)胞融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合第十一頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體1

6、0.2512PEG的作用機(jī)理的作用機(jī)理： 由于由于PEG分子分子(fnz)具有輕微的負(fù)極性，具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成故可以與具有正極性基團(tuán)的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子(fnz)橋，其結(jié)果是使細(xì)胞橋，其結(jié)果是使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合；另外，質(zhì)膜發(fā)生粘連進(jìn)而促使質(zhì)膜的融合；另外，PEG能增加類脂能增加類脂膜的流動(dòng)性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。膜的流動(dòng)性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。 PEG誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)誘導(dǎo)融合的特點(diǎn)：其優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)

7、其優(yōu)點(diǎn)是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過(guò)程不受物種限制。其缺點(diǎn)生的異核率較高；融合過(guò)程不受物種限制。其缺點(diǎn)(qudin)是融合過(guò)程繁瑣，是融合過(guò)程繁瑣，PEG可能對(duì)細(xì)胞有毒害?？赡軐?duì)細(xì)胞有毒害。第十二頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2513聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法）法細(xì)胞融合步驟細(xì)胞融合步驟（1）將兩種不同(b tn)親本細(xì)胞各5l06混勻；（2）離心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之與細(xì)胞接觸1分鐘；（4）加9ml 培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml 培養(yǎng)液，分別接種5個(gè)直徑60mm平皿，每個(gè)平皿加培

8、養(yǎng) 液至 5ml，37的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（6）624小時(shí)后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細(xì)胞。第十三頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2514（三）物理方法（三）物理方法(fngf)誘導(dǎo)細(xì)胞融合誘導(dǎo)細(xì)胞融合 電融合法是電融合法是80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而質(zhì)膜開(kāi)始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。進(jìn)而質(zhì)膜開(kāi)始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點(diǎn)：電融合法

9、的優(yōu)點(diǎn)：u融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)細(xì)胞傷害??；融合率高、重復(fù)性強(qiáng)、對(duì)細(xì)胞傷害??；u裝置裝置(zhungzh)精巧、方法簡(jiǎn)單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過(guò)程；精巧、方法簡(jiǎn)單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過(guò)程；u免去免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過(guò)程、誘導(dǎo)過(guò)程可控性強(qiáng)。誘導(dǎo)后的洗滌過(guò)程、誘導(dǎo)過(guò)程可控性強(qiáng)。第十四頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2515電融合的基本過(guò)程：電融合的基本過(guò)程：細(xì)胞膜的接觸：細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場(chǎng)通于電導(dǎo)率很低的溶液中時(shí)，電場(chǎng)通電后，電流即通過(guò)原生質(zhì)體而不是電后，電流即通過(guò)原生質(zhì)體而不是通過(guò)溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在

10、電通過(guò)溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場(chǎng)作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而場(chǎng)作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿膜的擊穿(j chun)(j chun)：原生質(zhì)原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一導(dǎo)致兩個(gè)緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。起。 電融合誘導(dǎo)法原理電融合誘導(dǎo)法原理(yunl)示意圖示意圖第十五頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2516三、雜種細(xì)胞三、雜種細(xì)胞(xbo)(xbo)的篩選的篩選根據(jù)已經(jīng)發(fā)生融合的細(xì)胞

11、中所含有核的類型，可將其根據(jù)已經(jīng)發(fā)生融合的細(xì)胞中所含有核的類型，可將其分為以下分為以下(yxi)幾種類型：幾種類型：u異核細(xì)胞：非同源細(xì)胞的融合體。u同核細(xì)胞：兩個(gè)相同細(xì)胞的融合體。u多核細(xì)胞：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。第十六頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2517u基于酶缺陷型細(xì)胞(xbo)和藥物抗性所建立的雜種篩選u基于營(yíng)養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所建立的雜種篩選u由溫度敏感型細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞的篩選u具有所需性狀雜種細(xì)胞的篩選常用的雜種常用的雜種(zzhng)細(xì)胞篩選方法細(xì)胞篩選方法第十七頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2518細(xì)胞融合的意義細(xì)胞融合的意義

12、(yy)u理論上說(shuō)任何細(xì)胞，都有可能通過(guò)體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這理論上說(shuō)任何細(xì)胞，都有可能通過(guò)體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這 對(duì)于對(duì)于(duy)(duy)種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。u融合過(guò)程不存在有性雜交過(guò)程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間融合過(guò)程不存在有性雜交過(guò)程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間 的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。u體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來(lái)自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來(lái)自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分 裂和增殖過(guò)程中雙親的葉綠體、線粒體裂和增殖過(guò)程中

13、雙親的葉綠體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新 的核外遺傳系統(tǒng)。的核外遺傳系統(tǒng)。u淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。第十八頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2519四、細(xì)胞四、細(xì)胞(xbo)(xbo)雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體雜交瘤技術(shù)與單克隆抗體第十九頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2520第二十頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2521 免疫器官免疫器官：免疫細(xì)胞生成、成熟或集中分布的場(chǎng)所，包括骨髓、胸腺、脾、淋巴結(jié)等 免疫細(xì)胞免疫細(xì)胞（發(fā)揮免疫作用(zuyng)的細(xì)胞）： 1

14、吞噬細(xì)胞 2淋巴細(xì)胞（起源骨髓中的造血干細(xì)胞） T細(xì)胞（在胸腺中成熟） B細(xì)胞（在骨髓中成熟） 免疫活性物質(zhì)免疫活性物質(zhì)：由免疫細(xì)胞或其他細(xì)胞產(chǎn)生的發(fā)揮免疫作用的物質(zhì)，包括抗體、淋巴因子、溶菌酶等 第二十一頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2522第二十二頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2523基本概念v抗原(kngyun)v抗體v抗原決定簇（抗原表位）v細(xì)胞克隆v多克隆抗體v單克隆抗體第二十三頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2524抗原（抗原（antigenantigen，AgAg），），是指一種能刺激人或動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)是指一種能刺激人或

15、動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生生抗體抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并能與這些產(chǎn)物在體內(nèi)或體外發(fā)生特或致敏淋巴細(xì)胞，并能與這些產(chǎn)物在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。異性反應(yīng)的物質(zhì)。抗原的基本性質(zhì)具有抗原的基本性質(zhì)具有異物性、大分子性和特異性異物性、大分子性和特異性。異物性異物性是指進(jìn)入(jnr)機(jī)體組織內(nèi)的抗原物質(zhì)，必須與該機(jī)體組織細(xì)胞的成分不相同。 大分子性大分子性是指構(gòu)成抗原的物質(zhì)通常是相對(duì)分子質(zhì)量大于10000的大分子物質(zhì)，分子量越大，抗原性越強(qiáng)。 特異性特異性是指一種抗原只能與相應(yīng)的抗體或效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合。第二十四頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2525v抗體（抗體（antibody,A

16、b)antibody,Ab)是機(jī)體是機(jī)體免疫系統(tǒng)免疫系統(tǒng)在在抗原抗原刺激下，由刺激下，由B B細(xì)細(xì)胞或記憶胞或記憶(jy)(jy)細(xì)胞增殖分裂成漿細(xì)胞所產(chǎn)生的可與相應(yīng)抗原發(fā)細(xì)胞增殖分裂成漿細(xì)胞所產(chǎn)生的可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的生特異性結(jié)合的免疫球蛋白免疫球蛋白。 v主要存在于血清等體液中，能與相應(yīng)抗原特異性地結(jié)合，主要存在于血清等體液中，能與相應(yīng)抗原特異性地結(jié)合，具有免疫功能具有免疫功能。第二十五頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2526抗原(kngyun)決定簇（Antigenic determinant）是指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱表位是指抗原分子中

17、決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)，又稱表位(epitope).(epitope).抗原以抗原決定簇與相應(yīng)抗原以抗原決定簇與相應(yīng)淋巴細(xì)胞的抗原受體結(jié)合淋巴細(xì)胞的抗原受體結(jié)合(jih)(jih)而激活淋巴細(xì)而激活淋巴細(xì)胞引起胞引起免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答。淋巴細(xì)胞表面淋巴細(xì)胞表面的的抗原識(shí)別受體抗原識(shí)別受體通過(guò)識(shí)別抗原決定簇而區(qū)分通過(guò)識(shí)別抗原決定簇而區(qū)分“自身自身”與與“異異己己”?？乖彩且钥乖瓫Q定簇與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合而發(fā)生反應(yīng)的?？乖彩且钥乖瓫Q定簇與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合而發(fā)生反應(yīng)的。第二十六頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2527v細(xì)胞克隆細(xì)胞克隆(k ln)：由一個(gè)細(xì)胞增殖而成的

18、細(xì)胞：由一個(gè)細(xì)胞增殖而成的細(xì)胞集團(tuán)集團(tuán)第二十七頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2528第二十八頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2529v多克隆抗體多克隆抗體（Polyclonal antibody,PcAb）：針對(duì)(zhndu)多種抗原決定簇的混合抗體第二十九頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2530 克隆選擇學(xué)說(shuō)：淋巴細(xì)胞在與抗原接觸前就已經(jīng)存在多種多樣的與抗原專一性結(jié)合(jih)的受體，一種細(xì)胞帶一種受體，進(jìn)入機(jī)體的抗原選擇性的結(jié)合(jih)其中的個(gè)別淋巴細(xì)胞，使之活化，增殖產(chǎn)生大量帶有同樣受體的細(xì)胞群，分泌同樣的抗體。當(dāng)抗原進(jìn)入體

19、內(nèi)，在機(jī)體中就會(huì)誘導(dǎo)出針對(duì)不同抗原決定簇的多種抗體，如果要把這些抗體一一分開(kāi)，用現(xiàn)有的生物化學(xué)或物理化學(xué)方法是根本辦不到的。 第三十頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2531 第三十一頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.25321975年科勒(Kohler)和米爾斯坦(Milstein)將小鼠免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合，培養(yǎng)出既能迅速(xn s)生長(zhǎng)無(wú)限繁殖又可分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。從而獲得針對(duì)某一特殊抗原決定簇的單克隆抗體。第三十二頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2533一個(gè)一個(gè)B B淋巴細(xì)胞只分泌一種淋巴細(xì)胞只分泌一種(y zhn)(

20、y zhn)特異性抗體特異性抗體骨髓瘤細(xì)胞（癌細(xì)胞）能無(wú)限增殖骨髓瘤細(xì)胞（癌細(xì)胞）能無(wú)限增殖雜種雜種(zzhng)細(xì)胞細(xì)胞動(dòng)物動(dòng)物(dngw)細(xì)胞培養(yǎng)技細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)術(shù)設(shè)計(jì)方案：設(shè)計(jì)方案：動(dòng)物細(xì)胞融合動(dòng)物細(xì)胞融合單克隆抗單克隆抗體體既能產(chǎn)生特異性抗既能產(chǎn)生特異性抗體，又能大量繁殖體，又能大量繁殖第三十三頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2534v單克隆抗體單克隆抗體（Monoclonal antibody,McAb） 由單個(gè)B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對(duì)單一(dny)抗原決定簇的同源抗體第三十四頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2535 第三十五頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題

21、-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2536 單克隆和多克隆抗體的比較單克隆和多克隆抗體的比較(bjio)和用途和用途特異性敏感性均一性McAbPcAb低差無(wú)高強(qiáng)有1、用于免疫學(xué)檢測(cè)，輔助、用于免疫學(xué)檢測(cè)，輔助(fzh)臨床診斷臨床診斷2、McAb用于親和層析，分離用于親和層析，分離(fnl)微量可溶性抗原微量可溶性抗原3、標(biāo)記的、標(biāo)記的McAb用于基礎(chǔ)研究，用于基礎(chǔ)研究，了解細(xì)胞分化等了解細(xì)胞分化等4、制備生物導(dǎo)彈用于腫瘤、移植、制備生物導(dǎo)彈用于腫瘤、移植等的臨床治療。等的臨床治療。第三十六頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2537單克隆抗體單克隆抗體(kngt)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用在醫(yī)

22、學(xué)中的應(yīng)用v檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)診斷試劑 （1）病原微生物抗原抗體的檢測(cè)）病原微生物抗原抗體的檢測(cè)(jin c) （2）腫瘤抗原的檢測(cè)）腫瘤抗原的檢測(cè) （3）免疫細(xì)胞及其亞群的檢測(cè)）免疫細(xì)胞及其亞群的檢測(cè) （4）激素測(cè)定）激素測(cè)定 （5）細(xì)胞因子的測(cè)定）細(xì)胞因子的測(cè)定v蛋白質(zhì)的提純蛋白質(zhì)的提純v腫瘤的導(dǎo)向治療和放射免疫顯像技術(shù)腫瘤的導(dǎo)向治療和放射免疫顯像技術(shù)第三十七頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2538動(dòng)物動(dòng)物(dngw)細(xì)細(xì)胞融合技胞融合技術(shù)術(shù)B 、BB 、B瘤瘤 、瘤瘤、瘤瘤 、瘤、瘤只有只有(zhyu)雜雜種細(xì)胞才能活種細(xì)胞才能活動(dòng)物動(dòng)物(dngw)細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)

23、培養(yǎng)單克隆抗體制備過(guò)單克隆抗體制備過(guò)程程獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體獲得產(chǎn)生相應(yīng)抗體的的B淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞第三十八頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2539動(dòng)物動(dòng)物(dngw)細(xì)胞融合技細(xì)胞融合技術(shù)術(shù)B 、BB 、B瘤瘤 、瘤瘤、瘤瘤 、瘤、瘤只有目的雜種只有目的雜種細(xì)胞細(xì)胞(xbo)才能才能活活單克隆抗體制備單克隆抗體制備(zhbi)(zhbi)過(guò)程過(guò)程第三十九頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2540HAT選擇(xunz)培養(yǎng)基vHAT選擇培養(yǎng)基組分選擇培養(yǎng)基組分(zfn) 次黃嘌呤核苷酸（次黃嘌呤核苷酸（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（氨甲喋呤（amin

24、opterin,A)（二氫葉酸還原酶抑制劑）（二氫葉酸還原酶抑制劑） 胸腺嘧啶核苷酸（胸腺嘧啶核苷酸（thymidine,T)第四十頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2541細(xì)胞(xbo)DNA合成途徑1.主要途徑：主要途徑： 氨氨 基基 酸酸 谷谷 氨氨 酰酰 胺胺 尿核苷單磷酸尿核苷單磷酸 葉酸及其衍生物葉酸及其衍生物（必不可少的媒介（必不可少的媒介(miji)）2.補(bǔ)救途徑：補(bǔ)救途徑：次黃嘌呤次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 （HGPRT） 胸腺嘧啶核苷酸激酶（胸腺嘧啶核苷酸激酶（ TK）第四十一頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.25

25、42第四十二頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2543第四十三頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2544第四十四頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2545第四十五頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2546第四十六頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2547第四十七頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2548第四十八頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2549第四十九頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2550第五十頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體

26、10.2551視頻(shpn)：?jiǎn)慰寺】贵w的制備第五十一頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2552第五十二頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2553免疫標(biāo)記技術(shù)放射物標(biāo)記技術(shù)酶標(biāo)技術(shù)免疫熒光技術(shù)其他標(biāo)記技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)酶免疫組化技術(shù)雙抗體夾心法雙抗體夾心法競(jìng) 爭(zhēng) 法雙抗原夾心法間 接 法雙位一點(diǎn)法第五十三頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2554第五十四頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2555ELISA原理原理(yunl)v使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性 v使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗

27、體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性v結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物(chnw)，產(chǎn)物(chnw)的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān) 第五十五頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2556第五十六頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2557ELISA基本基本(jbn)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程的實(shí)驗(yàn)過(guò)程v包被：將已知抗原或抗體通過(guò)物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化v抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標(biāo)本(biobn)和酶結(jié)合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定v酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中

28、加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色第五十七頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2558第五十八頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2559第五十九頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2560第六十頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2561第六十一頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2562第六十二頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2563第六十三頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2564第六十四頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2565第六十五頁(yè)，共八十七

29、頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2566第六十六頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2567第六十七頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2568第六十八頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2569第六十九頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2570單抗純化單抗純化(chn hu)方法：方法：v鹽析v凝膠過(guò)濾v離子交換(l z jio hun)層析v親和層析法第七十頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2571v用中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的方法為鹽析。大量的鹽加入到蛋白用中性鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的方法為鹽析。大量的

30、鹽加入到蛋白溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)的水化溶液中，高濃度的鹽離子有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)的水化層，使蛋白質(zhì)膠粒失水發(fā)生層，使蛋白質(zhì)膠粒失水發(fā)生(fshng)凝聚而沉淀析出。凝聚而沉淀析出。 血清血清 50%飽和度硫酸胺飽和度硫酸胺 上清上清 （清蛋白）（清蛋白） 沉淀（球蛋白）沉淀（球蛋白） 33%飽和度硫酸胺飽和度硫酸胺 上清上清 沉淀沉淀 擬球蛋白擬球蛋白 r球蛋白球蛋白鹽鹽 析析 法法第七十一頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2572凝膠過(guò)濾法凝膠過(guò)濾法v干燥的凝膠顆粒吸水后形成了多孔膠粒，將蛋白質(zhì)溶液加在凝干燥的凝膠顆粒吸水后形成了多孔膠

31、粒，將蛋白質(zhì)溶液加在凝膠柱上進(jìn)行洗脫膠柱上進(jìn)行洗脫(x tu)時(shí)，大分子蛋白不能穿過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠時(shí)，大分子蛋白不能穿過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，留在膠粒間隙的溶液中，隨洗脫粒內(nèi)，留在膠粒間隙的溶液中，隨洗脫(x tu)液最先流出，小分液最先流出，小分子蛋白可穿過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，受到凝膠的阻留，向下移子蛋白可穿過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入膠粒內(nèi)，受到凝膠的阻留，向下移動(dòng)較慢洗脫動(dòng)較慢洗脫(x tu)出來(lái)較慢，據(jù)此將不同大小的蛋白質(zhì)分離出來(lái)。出來(lái)較慢，據(jù)此將不同大小的蛋白質(zhì)分離出來(lái)。v交聯(lián)葡聚糖凝膠交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)v瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠(Sepharose)第七十二頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)

32、胞融合與單克隆抗體10.2573離子交換離子交換(l z jio hun)層析法層析法vDEAE纖維素：結(jié)合溶液纖維素：結(jié)合溶液(rngy)中帶負(fù)電荷的蛋中帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，又稱陰離子交換劑白質(zhì)，又稱陰離子交換劑vCM纖維素：結(jié)合溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)，纖維素：結(jié)合溶液中帶正電荷的蛋白質(zhì)，又稱陽(yáng)離子交換劑又稱陽(yáng)離子交換劑第七十三頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2574親和層析法親和層析法v將抗原（或抗體）連接到固相載體上，特異將抗原（或抗體）連接到固相載體上，特異性吸附液相中的抗體（或抗原），形成性吸附液相中的抗體（或抗原），形成(xngchng)抗原抗體復(fù)合物，然后改變條

33、件，使抗原抗抗原抗體復(fù)合物，然后改變條件，使抗原抗體復(fù)合物解離洗脫出純化的抗體（或抗原）體復(fù)合物解離洗脫出純化的抗體（或抗原）第七十四頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2575v單克隆抗體特性單克隆抗體特性v理化性狀高度均一，生物活性專一，只與一理化性狀高度均一，生物活性專一，只與一種抗原種抗原(kngyun)表位發(fā)生反應(yīng)，特異性強(qiáng)，純度表位發(fā)生反應(yīng)，特異性強(qiáng)，純度高，易于實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化和大量制備高，易于實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化和大量制備第七十五頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2576單抗單抗鑒定鑒定(jindng)方法：方法：v效價(jià)效價(jià) （凝集反應(yīng)、（凝集反應(yīng)、Elisa

34、、放免）、放免）v特異性特異性（免疫熒光、（免疫熒光、 Elisa 、間接血凝、間接血凝、免疫免疫(miny)印跡）印跡）第七十六頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2577原理：原理：Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素膜NC膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式(xngsh)吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。第七十七頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2578第七十八頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2579聚丙烯酰胺凝膠電泳第七十九頁(yè)，共八十七頁(yè)。醫(yī)學(xué)專題-細(xì)胞融合與單克隆抗體10.2580考馬斯亮藍(lán)染色(rns)蛋白電泳結(jié)果第八十頁(yè)，共八十七頁(yè)