東南大學1265 分子生物學

1、基因是DNA 或 RNA 分子中有特定遺傳功能的一段序列。 是能夠表達和產生基因產物（蛋白質或RNA）的核苷酸序列。其內容可擴展至包括兩側對基因表達的起始和終止所必需的調控序列。順式作用元件:(cis-acting element)是能影響基因表達，但不編碼RNA和 蛋白質的DNA序列。包括啟動子和上游啟動子元件、反應元件、增強子Poly(A)、加尾信號 反式作用因子 (trans-acting factor)指能直接或間接地識別或結合在各類順式作用元件核心序列上參與調控靶基因轉錄效率的蛋白質。啟動子（promoter）是RNA聚合酶特異性識別結合和啟動轉錄的DNA序列。有方向性，位于轉錄起始

2、位點上游。增強子（enhancer）能與反式作用因子結合，增強轉錄活性，在基因任意位置都有效、無方向性。C 值是一種生物單倍體基因組 DNA 的總量。 真核細胞基因組的最大特點是它含有大量的重復序列，而且功能 DNA 序列大多被不編碼蛋白的 DNA 所隔開。這就是 C 值反?，F(xiàn)象。DNA 的轉座是由可移位因子介導的遺傳物質重排現(xiàn)象。根據轉座作用機制的不同，可分為復制性轉座和非復制性轉座。 端粒酶是一種核糖核酸蛋白酶，由 RNA 和蛋白質構成，具逆轉錄活性，能夠以自身的RNA 為模版，通過多次互補配對，延長染色體端粒 3末端。轉座成分（transposable elements）又稱移動基因（m

3、ovable genes），或稱為跳躍基因（jumping genes）。指一些可以在染色體基因組上從一個位置轉移到另一個位置，甚至在不同染色體之間躍遷的 DNA 成分。轉座是在轉座酶的作用下，轉座因子或是直接從原來位置上切離下來，然后插入新的位置，或是染色體上的 DNA 序列轉錄成 RNA，隨后反轉錄為 cDNA，再插入染色體上新的位置。 端粒的功能人體細胞端粒長度約為 515 Kb，其功能在于保護染色體免受核酶降解，防止斷端、融合、重排或降解。 如果端粒長度縮短到極限如4 Kb以下時，細胞則會喪失分裂增殖能力而發(fā)生凋亡。端?？s短被認為是正常細胞分裂與老化的分子信號，端粒被稱為細胞壽命的“分

4、裂鐘”。端粒酶是依賴RNA的 DNA聚合酶，實質是一種逆轉錄酶。 能識別特定的端粒重復序列，以自身 RNA的部分序列(5-CUAACCCUAAC-3)為模板，合成新的端粒重復序列，使端粒延長，保持染色體的完整。 原核生物基因表達調控主要在轉錄水平，其次是翻譯水平。原核生物基因表達調控主要在轉錄水平，即對RNA合成的調控。通常有兩種方式： (1) 起始調控，即啟動子調控，(2) 終止調控(衰減子調控) 轉錄的選擇性：在細胞周期的某個階段，或不同類型的細胞中，某些特定的基因被轉錄，而多數(shù)其它基因處于封閉狀態(tài)，即轉錄有時間和空間上的嚴格調控。 核酸的凝膠電泳指按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術，分

5、為瓊脂糖(agarose)凝膠和聚丙烯酰胺(polyacrylamide) 凝膠，是分析鑒定重組DNA分子及蛋白質與核酸相互作用的重要實驗手段。 印跡技術是 利用各種物理方法使電泳中的生物大分子轉移到硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane, NC)等各種膜上，使之成為固相化分子。Southern 印跡雜交 (Southern blotting) 是將電泳分離的待測 DNA片段結合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標記的核酸探針進行雜交的過程。用于DNA定性、定量分析。 PCR 技術是體外快速擴增特定基因或 DNA 序列最常用的方法。 整個反應包括 DN

6、A解鏈 （變性）、引物與模板結合（退火）、DNA合成（延伸）三步，此三步可以被不斷重復。經多次循環(huán)之后，反應混合物中所含有的雙鏈 DNA 分子數(shù)，理論上的最高值應是 2n。 SNP（單核苷酸多態(tài)性） 指基因組 DNA 序列中由于單個核苷酸（A，T，C 和 G）的突變而引起的多態(tài)性。 基因敲除（gene knock-out）又稱基因打靶，通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進行精確的定點修飾和基因改造，具有專一性強、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點。完全基因敲除 指通過同源重組法完全消除細胞或者動物個體中的靶基因活性。 條件型基因敲除 指通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基因

7、敲除?；蚯贸饬x 研究基因功能 轉基因動物的制備 用于藥物篩選的動物模型 轉基因動物可作為“生物反應器”生產藥物基因工程載體的選擇標準能自主復制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。在細胞內穩(wěn)定性高，以便確保重組體穩(wěn)定傳代?？寺≠|粒載體特點分子量相對較小，能在細菌內穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)。 具有一個以上的遺傳標志，便于對宿主細胞進行選擇，如抗生素抗性基因，-半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。 具有多個限制性內切酶的單一切點，便于外源基因的插入。穿梭質粒載體（ shuttle

8、 plasmid vector ）指一類由人工構建的具有兩種不同復制起點和選擇記號，因而可在兩種不同的寄主細胞存活和復制的質粒載體限制性內切酶是識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶。 限制性核酸內切酶的來源：細菌的限制修飾系統(tǒng)。 病毒DNA進入宿主細胞后會被降解，而宿主自身的DNA卻不發(fā)生改變，這就是限制-修飾現(xiàn)象。 主要原因是宿主體內存在甲基化酶，該酶可特異的修飾宿主自身的DNA，防止被降解；而病毒DNA則不被修飾。影響限制酶活性的因素1）“星”活性2）甲基化3）底物性狀4）試劑 同裂酶 又稱為異源同工酶。指來源不同，但識別和切割同樣的核苷酸序列的限制性酶。 限制性內切酶的識別序列

9、不完全相同，但切割DNA后產生相同的粘性末端，稱同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatible end)?；蚨鄳B(tài)性可表現(xiàn)為藥物代謝酶的多態(tài)性，藥物轉運體(影響藥物的吸收、分布和排泄)的多態(tài)性以及藥物作用受體或靶點(如-腎上腺素能受體)的多態(tài)性。這些多態(tài)性導致了許多藥物療效和不良反應的個體間差異。細胞色素P450酶系(cytochrome p450, CYP450)由一群基因超家族編碼的酶蛋白組成。它參與臨床上90%以上的藥物代謝，P450基因多態(tài)性是造成不同個體藥物代謝差異的基礎。涉及體內大多數(shù)藥物代謝的CYP主要有3個基因家族CYP1、CYP2、CYP3。 影響目的基因與載

10、體之間連接效率的因素DNA片段間的連接方式目的基因與載體DNA的濃度比例連接溫度與時間其他因素：連接酶純度、反應緩沖體系等 影響細菌轉化頻率的因素 轉化DNA的濃度、純度和構型轉化細胞的生理狀態(tài)經CaCl2 處理后的成活率轉化環(huán)境：溫度MgCl2轉化：Mg+對于維持DNA穩(wěn)定性方面，可能起到重要的作用。提高外源基因表達水平的措施1提高翻譯水平調整SD序列與ATG之間的距離 用點突變的方法改變某些堿基增加mRNA的穩(wěn)定性 2 使細菌的生長與外源基因的表達分開 將宿主菌的生長和外源基因的表達分成兩個階段，是減輕宿主細胞代謝負荷最常用的一個方法。一般采用溫度誘導或藥物誘導。 3 提高表達蛋白的穩(wěn)定性

11、 表達融合蛋白 采用某種突變菌株 表達分泌蛋白 真核基因組的結構特點1每一種真核生物都有一定的染色體數(shù)目；2. 遠大于原核基因組，結構復雜，基因數(shù)龐大；3. 真核生物基因轉錄產物為單順反子；4. 有大量重復序列;5. 真核基因為斷裂基因;6. 非編碼序列多于編碼序列;7. 功能相關基因構成各種基因家族。運用藥物基因組學和遺傳藥理學發(fā)現(xiàn)和開發(fā)創(chuàng)新藥物的優(yōu)勢。 識別疾病和途徑基因的遺傳藥理學標識物，針對性地選擇作用靶點 選擇更好的藥物候選物（早期確定候選物是否高度受基因多態(tài)性的影響，因而可減少因效應差異而帶來的風險） 避免高多態(tài)性藥物靶點 確定藥物在人體內的代謝途徑 開發(fā)藥代動力學最穩(wěn)定的化合物

12、識別由遺傳變異引起的代謝和反應異常 避免開發(fā)安全范圍小而又與遺傳變異密切相關的藥物 開發(fā)對遺傳變異人群有針對性作用的藥物 最大限度減少藥物相互作用（藥代酶相同底物、誘導和抑制）簡述真核與原核細胞中翻譯起始的主要區(qū)別。 原核細胞與真核細胞翻譯起始的主要區(qū)別是來自 mRNA 的本質差異以及小亞基與 mRNA 起始密碼子上游區(qū)結合的能力。原核細胞 mRNA 較不穩(wěn)定，而且是多順反子，在 IF-3 介導下。通過16S rRNA 的3末端在核糖體結合位點與小亞基直接結合后，原核細胞翻譯起始復合物就裝配起來了。 而在真核細胞中， 需要幾種起始因子（eIF-4，4A，4B）幫助 mRNA 啟動，起始復合物（

13、SIC，40S 亞基，eIF-2，GTP，Met，tRNA）才能結合（在eIF-4 和eIF-3 因子的促使下）到 mRNA 帽上。一旦結合，SIC 開始向 mRNA 下游區(qū)搜索，直到找到第一個 AUG 密碼子。簡述端粒酶的作用機理和功能。 答：端粒酶是一種核糖核酸蛋白酶，由 RNA 和蛋白質構成，具逆轉錄活性，能夠以自身的結構 RNA 為模版，通過多次互補配對，延長端粒 3末端。之后合成引物，使 5端也得到延長。 功能：由于在復制過程中存在末端丟失，通過端粒酶的作用保護了染色體末端，同時使得端粒的得到延伸，防止端粒過短影響復制。DNA 修復的主要機制有哪些 答：DNA 修復主要機制有 7種：

14、 正讀碼機制，依靠 DNA聚合酶切除錯誤核苷酸，替換正確核苷酸； 錯配修復系統(tǒng)，依靠 mut 基因編碼的蛋白，特異性識別切除包含錯誤核苷酸的一段多核苷酸鏈，再由 DNA 聚合酶重新合成； 光復活作用，通過修復酶（光裂化酶）直接逆轉紫外輻射造成的嘧啶二聚體結構； 堿基切補修復，糖基化酶將堿基移除，而后由核苷酸內切酶進行補切修復； 核苷酸切補修復，將受損傷的一段核苷酸切除，合成新的核苷酸替換錯誤片段； 重組修復，通過從受損 DNA找回序列信息來修復 DNA斷裂，當 DNA兩條鏈都受損時采用這種方式； SOS 應答，當 DNA 受到放射損傷或其它較大損傷時，形成特化的 DNA 聚合酶催化，此酶越過損傷部位直接合成 DNA闡述乳糖操縱子的組成及其調控機制。 乳糖操縱子由調控基因 lacI 、操縱基因和三個結構基因 lac Z、lacY、lacA組成。lacZ 編碼-半乳糖苷酶，它可以切斷乳糖的半乳糖苷鍵，而產生半乳糖和葡萄糖。lacY編碼-半乳糖苷透性酶，它構成轉運系統(tǒng)，將半乳糖苷運入到細胞中。lacA 編碼-半乳糖苷乙酰轉移酶，其功能只將乙酰-輔酶 A上的乙?；D移到-半乳糖苷上。 Lac 操縱子的調控分為正調控和負調控兩種。lacZ、Y、A 基因的轉錄是由 lacI 基因指令合成的阻遏蛋白和 cAMP 與其結合蛋白 CAP 所控制的。機體內沒有乳糖時，l