PCR反應中基本成分引物dNTP、等的作用

1、PCR 反應中基本成分（引物、dNTP 、模板等）的作用PCR(聚合酶鏈式反應 ) 反應包括三個基本步驟，即：模板 DNA的變性、模板 DNA 與引物的退火復性、引物的延伸。 PCR反應體系包括 5 種基本成分，依次為：引物、 DNA聚合酶、 dNTP、模板 DNA、 Mg2+。PCR(聚合酶鏈式反應 ) 反應包括三個基本步驟，即：模板 DNA的變性、模板 DNA 與引物的退火復性、引物的延伸。 PCR反應體系包括 5 種基本成分，依次為：引物、 DNA聚合酶、 dNTP、模板 DNA、 Mg2+。1、引物引物是 PCR特異性反應的關鍵， PCR 產物的特異性取決于引物與模板 DNA互補的程度

2、。理論上，只要知道任何一段模板 DNA序列，就能按其設計互補的 寡核苷酸鏈做引物，利用 PCR就可將模板 DNA在體外大量擴增。設計引物應遵循以下原則：引物長度： 15-30bp ，常用為 20bp 左右。引物擴增跨度：以 200-500bp 為宜，特定條件下可擴增長至10kb 的片段。引物堿基： G+C含量以 40-60%為宜， G+C太少擴增效果不佳， G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。 ATGC最好隨機分布，避免 5 個以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。避免引物內部出現(xiàn)二級結構，避免兩條引物間互補，特別是 3端的互補，否則會形成 引物二聚體 ，產生非特異的擴增條帶。引物 3端的堿基，特別是最

3、末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致 PCR失敗。引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子 克隆很有好處。引物的特異性： 引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。引物量： 每條引物的濃度 0.1 1umol 或 10100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增， 且可增加引物之間形成二聚體的機會。2、酶目前有兩種 Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。 催化一典型的 PCR反應約需酶量 2.5U( 指總反應體積為 1

4、00ul 時) ，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。3、dNTPdNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系， dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后，以1MNaOH或 1M Tris 。HCL的緩沖液將其 PH調節(jié)到 7.0 7.5 ，小量分裝， - 20冰凍保存。多次凍融會使 dNTP降解。在 PCR反應中， dNTP應為 50 200umol/L ，尤其是注意 4 種 dNTP的濃度要相等 ( 等摩爾配制 ) ，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時 ( 偏高或偏低 ) ，就會引起錯配。 濃度過低又會降低 PCR產物

5、的產量。 dNTP 能與 Mg2+結合，使游離的 Mg2+濃度降低。dNTP儲存液： dNTP溶于 pH 為 7.0 的 NaOH貯存液中，最初的貯存液可稀釋到 10mol/L ，分裝后存放在 - 20冰箱中。 dNTP使用濃度在 20200 mol/L 之間。 4 種 dNTP?必須等濃度配合以減少錯配誤差。dNTP使用濃度：在 PCR反應中 , 使用低 dNTP濃度 ,? 可減少非靶位置啟動和延伸時的核苷酸錯誤摻入。一般可根據(jù)靶序列的長度和組成來決定最低 dNTP濃度。例如在 100l 的反應體系中 ,4 種 dNTP的濃度為 20mol/L, 可基本滿足合成2.6 g DNA或?10pm

6、ol/L? 的 400bp 序列。使用低dNTP濃度 ( 每種 dNTP濃度為2mol/L), 能夠高度靈敏地 (1/107)? 擴增 ras 基因點突變的等位基因。4、模板模板核酸的量與純化程度， 是 PCR成敗與否的關鍵環(huán)節(jié)之一， 傳統(tǒng)的 DNA純化方法通常采用 SDS和蛋白酶 K 來消化處理標本。 SDS的主要功能是：溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜， 并解離細胞中的核蛋白， SDS 還能與蛋白質結合而沉淀 ; 蛋白酶 K 能水解消化蛋白質，特別是與 DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份， 用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板

7、用于 PCR反應。一般臨床檢測標本， 可采用快速簡便的方法溶解細胞， 裂解病原體， 消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離， 直接用于 PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，要防止 RNase 降解 RNA。5、Mg2+濃度Mg2+對 PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響， 在一般的 PCR反應中，各種 dNTP 濃度為 200umol/L 時， Mg2+濃度為 1.5 2.0mmol/L 為宜。 Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。引物是 PCR特異性反應的關鍵， 不好的引物嚴重影響實驗的質量， 好的引物可以事倍功半 ; 酶