病理學方法學2013年研究生

1、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)激光共聚焦顯微鏡技術(shù)(Confocal laser scanning microscope, CLSM)激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理 激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過擴束透鏡和光束整形激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過擴束透鏡和光束整形鏡，變成一束直徑較大的平行光束，長通分色反鏡，變成一束直徑較大的平行光束，長通分色反射鏡使光束偏轉(zhuǎn)射鏡使光束偏轉(zhuǎn)9090度，經(jīng)過物鏡會聚在物鏡的焦度，經(jīng)過物鏡會聚在物鏡的焦點上，樣品中的熒光物質(zhì)在激光的激發(fā)下發(fā)射沿點上，樣品中的熒光物質(zhì)在激光的激發(fā)下發(fā)射沿各個方向的熒光，一部分熒光經(jīng)過物鏡、長通分各個方向的熒光，一部分熒光經(jīng)過物鏡、長通

2、分色反射鏡、聚焦透鏡、會聚在聚焦物鏡的焦點處，色反射鏡、聚焦透鏡、會聚在聚焦物鏡的焦點處，再通過焦點處的針孔，由檢測器接收。再通過焦點處的針孔，由檢測器接收。標準蓋玻片厚度為標準蓋玻片厚度為0.17mm載玻片厚度是載玻片厚度是1.1mm載物臺與物鏡之間的工作距離有限載物臺與物鏡之間的工作距離有限清晰度高清晰度高物鏡最大放大倍數(shù)物鏡最大放大倍數(shù)150X主要用于切片的觀察主要用于切片的觀察正置激光共聚焦顯微鏡正置激光共聚焦顯微鏡物鏡、聚光鏡、光源的位置顛倒物鏡、聚光鏡、光源的位置顛倒長工作距離物鏡和聚光鏡長工作距離物鏡和聚光鏡透射光源和載物臺之間空間更寬敞透射光源和載物臺之間空間更寬敞清晰度略低于

3、正置清晰度略低于正置物鏡最大放大率為物鏡最大放大率為60X多用于無色透明的活體觀察，如組多用于無色透明的活體觀察，如組織培養(yǎng)、細胞離體培養(yǎng)、浮游生物、織培養(yǎng)、細胞離體培養(yǎng)、浮游生物、環(huán)境保護、食品檢驗環(huán)境保護、食品檢驗倒置激光共聚焦顯微鏡倒置激光共聚焦顯微鏡工作原理工作原理計算機系統(tǒng)計算機系統(tǒng)激光照射系統(tǒng)激光照射系統(tǒng)顯微鏡系統(tǒng)顯微鏡系統(tǒng)檢測系統(tǒng)檢測系統(tǒng)X-Y平臺系統(tǒng)平臺系統(tǒng)Z-軸步進馬達軸步進馬達激光共聚焦顯微鏡發(fā)展史激光共聚焦顯微鏡發(fā)展史早在早在1957年就已提出，年就已提出，二十年后由二十年后由Brandengoff在高數(shù)值孔徑透鏡裝置上改裝成功具有高清晰度在高數(shù)值孔徑透鏡裝置上改裝成功具

4、有高清晰度的共聚焦顯微鏡，的共聚焦顯微鏡，1985年年Wijnaendts Van Resandt發(fā)表了第一篇有關激光掃描共聚焦顯微發(fā)表了第一篇有關激光掃描共聚焦顯微鏡在生物學中應用的文章，鏡在生物學中應用的文章，1. 1987年，發(fā)展成現(xiàn)在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微鏡。年，發(fā)展成現(xiàn)在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微鏡。由于由于pinhole的存在，使得部分雜散光（虛線部分）沒有被的存在，使得部分雜散光（虛線部分）沒有被PMT探測器探測到，從探測器探測到，從而提高了成像效果。而提高了成像效果。通過對樣品在通過對樣品在X-Y方向上的逐點掃描，可以形成二維圖像。如果調(diào)節(jié)焦平面在方向上

5、的逐點掃描，可以形成二維圖像。如果調(diào)節(jié)焦平面在Z線的線的位置，連續(xù)掃描多個不同位置，連續(xù)掃描多個不同Z位置的二維圖像，則可以形成一個位置的二維圖像，則可以形成一個3D圖像，圖像，3D的重建需的重建需要軟件的支持。要軟件的支持。普通熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡的區(qū)別普通熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡的區(qū)別 傳統(tǒng)的光學顯微鏡使用的是場光源，標本上每一點的圖傳統(tǒng)的光學顯微鏡使用的是場光源，標本上每一點的圖像都會受到鄰近點的衍射或散射光的干擾；激光掃描共焦顯像都會受到鄰近點的衍射或散射光的干擾；激光掃描共焦顯微鏡采用點光源照射樣本，在焦平面上形成一個輪廓分明的微鏡采用點光源照射樣本，在焦平面上形成一個輪

6、廓分明的小的光點，該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡搜集，并沿原照小的光點，該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡搜集，并沿原照射光路回送到由雙色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送射光路回送到由雙色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面明針孔和探測針孔。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點被擋在探測針孔之外不能成像，這樣得到的焦平面以外的點被擋在

7、探測針孔之外不能成像，這樣得到的共聚焦圖像是標本的光學切面，避免了非焦平面上雜散光線共聚焦圖像是標本的光學切面，避免了非焦平面上雜散光線的干擾，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點，因此能得到整的干擾，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點，因此能得到整個焦平面上清晰的共聚焦圖像。個焦平面上清晰的共聚焦圖像。 激光共聚焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別激光共聚焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別激光共聚焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別激光共聚焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像2.具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學切片3.增加側(cè)向分辨率4.由于點對點掃描去除了雜散光的影響普通熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡

8、的區(qū)別普通熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡的區(qū)別普通的熒光顯微鏡普通的熒光顯微鏡激光共聚焦顯微鏡激光共聚焦顯微鏡*激光共聚焦顯微鏡的性能特點激光共聚焦顯微鏡的性能特點1.分辨率高分辨率高 最小觀察厚度是最小觀察厚度是0.5m， 分辨率是普通光學顯微鏡的分辨率是普通光學顯微鏡的1.4倍倍2. 靈敏度高靈敏度高 利用利用PMT檢測熒光檢測熒光3. 掃描速度快掃描速度快 毫秒級和微妙級毫秒級和微妙級4. 掃描范圍大掃描范圍大 最大可達最大可達2cmX2cm5. 圖像存取方便圖像存取方便6. 可進行光切片的觀察可進行光切片的觀察 三維圖像分析三維圖像分析7. 可進行熒光定量分析可進行熒光定量分析激光共聚焦

9、顯微鏡的應用激光共聚焦顯微鏡的應用 定量熒光測量定量熒光測量 進行重復性極佳的低光探測及活細胞熒光定量分析。進行重復性極佳的低光探測及活細胞熒光定量分析。 單個細胞或細胞群的溶酶體，線粒體、單個細胞或細胞群的溶酶體，線粒體、DNA、RNA和受體分子含量、和受體分子含量、成份及分布進行定性及定量測定，還可測定諸如膜電位和配體結(jié)合等生化反成份及分布進行定性及定量測定，還可測定諸如膜電位和配體結(jié)合等生化反應程度。此外，還適用于高靈敏度快速的免疫熒光測定，這種定量可以準確應程度。此外，還適用于高靈敏度快速的免疫熒光測定，這種定量可以準確監(jiān)測抗原表達，細胞結(jié)合和殺傷及定量的形態(tài)學特性，以揭示諸如腫瘤相關

10、監(jiān)測抗原表達，細胞結(jié)合和殺傷及定量的形態(tài)學特性，以揭示諸如腫瘤相關抗原表達的準確定位及定量信息?？乖磉_的準確定位及定量信息。1. 定量共聚焦圖像分析定量共聚焦圖像分析借助于激光共焦系統(tǒng)，可以獲得生物樣品高反差、高分辨率、高靈敏度借助于激光共焦系統(tǒng)，可以獲得生物樣品高反差、高分辨率、高靈敏度的二維圖像?？傻玫酵暾畹幕蚬潭ǖ募毎敖M織的系列及光切片，從而得的二維圖像?？傻玫酵暾畹幕蚬潭ǖ募毎敖M織的系列及光切片，從而得到各層面的信息，三維重建后可以揭示亞細胞結(jié)構(gòu)的空間關系。能測定細胞到各層面的信息，三維重建后可以揭示亞細胞結(jié)構(gòu)的空間關系。能測定細胞光學切片的物理、生物化學特性的變化，如光學切

11、片的物理、生物化學特性的變化，如DNA含量、含量、RNA含量、分子擴散、含量、分子擴散、胞內(nèi)離子等，亦可以對這些動態(tài)變化進行準確的定性、定量、定時及定位分胞內(nèi)離子等，亦可以對這些動態(tài)變化進行準確的定性、定量、定時及定位分析。析。3. 三維重組分析生物結(jié)構(gòu)三維重組分析生物結(jié)構(gòu)組合成一個真實的三維圖像，并可從任意角度觀察，也可以借組合成一個真實的三維圖像，并可從任意角度觀察，也可以借助改變照明角度來突出其特征，產(chǎn)生更生動逼真的三維效果。助改變照明角度來突出其特征，產(chǎn)生更生動逼真的三維效果。4. 動態(tài)熒光測定動態(tài)熒光測定Ca2+ 、pH 及其它細胞內(nèi)離子測定，能迅速對樣品的點，線及其它細胞內(nèi)離子測定

12、，能迅速對樣品的點，線或二維圖像掃描，測量單次、多次單色、雙發(fā)射和三發(fā)射光比率，或二維圖像掃描，測量單次、多次單色、雙發(fā)射和三發(fā)射光比率，使用諸如使用諸如Indo-1、BCECF 、Fluo-3等多種熒光探針對各種離子作等多種熒光探針對各種離子作定量分析?？梢灾苯拥玫酱蠓肿拥臄U散速率，能定量測定細胞溶液定量分析?？梢灾苯拥玫酱蠓肿拥臄U散速率，能定量測定細胞溶液中中Ca2+對腫瘤啟動因子、生長因子及各種激素等刺激的反應，以對腫瘤啟動因子、生長因子及各種激素等刺激的反應，以及使用雙熒光探針及使用雙熒光探針Fluo-3和和CNARF進行進行Ca2+和和pH的同時測定。的同時測定。5. 熒光光漂白恢復

13、（熒光光漂白恢復（FRAP）-活細胞的動力學參數(shù)活細胞的動力學參數(shù)熒光光漂白恢復技術(shù)借助高強度脈沖式激光照射細胞某一區(qū)域，熒光光漂白恢復技術(shù)借助高強度脈沖式激光照射細胞某一區(qū)域，從而造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅，該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子將從而造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅，該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子將以一定速率向受照區(qū)域擴散，可通過低強度激光掃描探測此擴散速率。以一定速率向受照區(qū)域擴散，可通過低強度激光掃描探測此擴散速率。通過激光共聚焦顯微鏡可直接測量分子擴散率、恢復速度，并由此而通過激光共聚焦顯微鏡可直接測量分子擴散率、恢復速度，并由此而揭示細胞結(jié)構(gòu)及相關的機制。揭示細胞結(jié)構(gòu)及相關的機制。6.

14、胞間通訊研究胞間通訊研究動物細胞中由縫隙連接介導的胞間通訊被認為在細胞增殖和分化動物細胞中由縫隙連接介導的胞間通訊被認為在細胞增殖和分化中起非常重要的作用。中起非常重要的作用。ACAS可用于測定相鄰植物和動物細胞之間細可用于測定相鄰植物和動物細胞之間細胞間通訊，測量由細胞縫隙連接介導的分子轉(zhuǎn)移，研究腫瘤啟動因子胞間通訊，測量由細胞縫隙連接介導的分子轉(zhuǎn)移，研究腫瘤啟動因子和生長因子對縫隙連接介導的胞間通訊的抑制作用，以及胞內(nèi)和生長因子對縫隙連接介導的胞間通訊的抑制作用，以及胞內(nèi)Ca2+ ,PH和和cAMP水平對縫隙連接的調(diào)節(jié)作用。水平對縫隙連接的調(diào)節(jié)作用。7. 細胞膜流動性測定細胞膜流動性測定A

15、CAS設計了專用的軟件用于對細胞膜流動性進行定量和定性分析。熒光膜探針設計了專用的軟件用于對細胞膜流動性進行定量和定性分析。熒光膜探針受到極化光線激發(fā)后，其發(fā)射光極性依賴于熒光分子的旋轉(zhuǎn)，而這種有序的運動自由受到極化光線激發(fā)后，其發(fā)射光極性依賴于熒光分子的旋轉(zhuǎn)，而這種有序的運動自由度依賴于熒光分子周圍的膜流動性，因此極性測量間接反映細胞膜流動性。這種膜流度依賴于熒光分子周圍的膜流動性，因此極性測量間接反映細胞膜流動性。這種膜流動性測定在膜的磷脂酸組成分析、藥物效應和作用位點，溫度反應測定和物種比較等動性測定在膜的磷脂酸組成分析、藥物效應和作用位點，溫度反應測定和物種比較等方面有重要作用。方面有

16、重要作用。8. 籠鎖籠鎖解籠鎖測定解籠鎖測定許多重要的生活物質(zhì)都有其籠鎖化合物，在處于籠鎖狀態(tài)時，其功能被封閉，而許多重要的生活物質(zhì)都有其籠鎖化合物，在處于籠鎖狀態(tài)時，其功能被封閉，而一旦被特異波長的瞬間光照射后，光活化解籠鎖，使其恢復原有活性和功能，在細胞一旦被特異波長的瞬間光照射后，光活化解籠鎖，使其恢復原有活性和功能，在細胞的增值、分化等生物代謝過程中發(fā)揮功能。利用的增值、分化等生物代謝過程中發(fā)揮功能。利用ACAS可以人為控制這種瞬間光的照可以人為控制這種瞬間光的照射波長和時間，從而達到人為控制多種生物活性產(chǎn)物和其它化合物在生物代謝中發(fā)揮射波長和時間，從而達到人為控制多種生物活性產(chǎn)物和其

17、它化合物在生物代謝中發(fā)揮功能的時間和空間作用。功能的時間和空間作用。9. 粘附細胞分選粘附細胞分選ACAS是目前唯一能對粘附細胞進行分離篩選的分析細胞學是目前唯一能對粘附細胞進行分離篩選的分析細胞學儀器，它對培養(yǎng)皿底的粘附細胞有兩種分選方法：儀器，它對培養(yǎng)皿底的粘附細胞有兩種分選方法：（1）Coolie-CutterTM法，它是法，它是Meidian公司專利技術(shù)，首先將公司專利技術(shù)，首先將細胞貼壁培養(yǎng)在特制培養(yǎng)皿上，然后用高能量激光的欲選細胞四細胞貼壁培養(yǎng)在特制培養(yǎng)皿上，然后用高能量激光的欲選細胞四周切割成八角形幾何形狀，而非選擇細胞則因在八角形之外而被周切割成八角形幾何形狀，而非選擇細胞則因

18、在八角形之外而被去除，該分選方式特別適用于選擇數(shù)量較少諸如突變細胞、轉(zhuǎn)移去除，該分選方式特別適用于選擇數(shù)量較少諸如突變細胞、轉(zhuǎn)移細胞和雜交瘤細胞，即使百萬分之一機率的也非常理想。細胞和雜交瘤細胞，即使百萬分之一機率的也非常理想。（2）激光消除法，該方法亦基于細胞形態(tài)及熒光特性，用高能量）激光消除法，該方法亦基于細胞形態(tài)及熒光特性，用高能量激光自動殺滅不需要的細胞，留下完整活細胞亞群繼續(xù)培養(yǎng)，此激光自動殺滅不需要的細胞，留下完整活細胞亞群繼續(xù)培養(yǎng)，此方法特別適于對數(shù)量較多細胞的選擇。方法特別適于對數(shù)量較多細胞的選擇。VWFCD31CD31 VWFVWF expressed in big vess

19、el.CD31 expressed in endothelial cell of capillary and big vessel.VWFCD34VWF CD34WKY 40X2SHR-SP 40X2GFAP and lectin double stainingGFAP lectinGFAP lectinGFAP lectinpAs we know, astrocytes composed the BBB.pAfter stroke, number of it becomes more and processes of it connected with BBB more closely th

20、an before.GFAPAstrocyte lectinVessleNG2 and lectin in double staining 3D3D3DNG2 lectin TOTO3A Mouse ModelRed, CD45; Green, Desmin and Blue, DAPI 流式細胞儀流式細胞儀 （Flow Cytometry,FCM)原理及應用原理及應用1 1、流式細胞儀流式細胞儀(Flow Cytometer):是集光電子物理，光電測量，計算機，是集光電子物理，光電測量，計算機，細胞熒光化學，單抗技術(shù)為一體的高科技細胞分析儀。細胞熒光化學，單抗技術(shù)為一體的高科技細胞分析儀。2

21、、流式細胞術(shù)、流式細胞術(shù)(Flow Cytometry):利用流式細胞儀對處于快速流動的細利用流式細胞儀對處于快速流動的細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速（每秒可達胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速（每秒可達1000-10000個）的定量分個）的定量分析和分選（純度可達析和分選（純度可達99%以上）的技術(shù)。以上）的技術(shù)。3.流式細胞術(shù)（流式細胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）是一種可以對細胞或亞細胞結(jié)構(gòu)）是一種可以對細胞或亞細胞結(jié)構(gòu)進行快速測量的新型分析技術(shù)和分選技術(shù)。其特點是：進行快速測量的新型分析技術(shù)和分選技術(shù)。其特點是：測量速度快，測量速度快，最快可在最快可在1秒種內(nèi)計測數(shù)萬個細胞；秒

22、種內(nèi)計測數(shù)萬個細胞；可進行多參數(shù)測量，可以對同可進行多參數(shù)測量，可以對同一個細胞做有關物理、化學特性的多參數(shù)測量，并具有明顯的統(tǒng)計學一個細胞做有關物理、化學特性的多參數(shù)測量，并具有明顯的統(tǒng)計學意義；意義；是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術(shù)、計算機技是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術(shù)、計算機技術(shù)、流體力學、細胞化學、圖像技術(shù)等從多領域的知識和成果；術(shù)、流體力學、細胞化學、圖像技術(shù)等從多領域的知識和成果；既既是細胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)。是細胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)?；靖拍罨靖拍盍魇郊毎g(shù)發(fā)展簡史流式細胞術(shù)發(fā)展簡史 1.1934年，年，Moldavan首次提出了使懸

23、浮的單個血紅細胞等流過玻璃毛細管，首次提出了使懸浮的單個血紅細胞等流過玻璃毛細管，在亮視野下用顯微鏡進行計數(shù)。在亮視野下用顯微鏡進行計數(shù)。2.1953年年Crosland Taylor根據(jù)雷諾對牛頓流體在圓形管中流動規(guī)律的研究認根據(jù)雷諾對牛頓流體在圓形管中流動規(guī)律的研究認識到：管中軸線流過的鞘液流速越快，載物通過的能力越強，并具有較強的流體識到：管中軸線流過的鞘液流速越快，載物通過的能力越強，并具有較強的流體動力聚集作用。于是設計了一個流動室，使待分析的細胞懸浮液都集聚在圓管軸動力聚集作用。于是設計了一個流動室，使待分析的細胞懸浮液都集聚在圓管軸線附近流過，外層包圍著鞘液；細胞懸浮液和鞘液都在

24、作層液。這就奠定了現(xiàn)代線附近流過，外層包圍著鞘液；細胞懸浮液和鞘液都在作層液。這就奠定了現(xiàn)代流式細胞術(shù)中的液流技術(shù)基礎。流式細胞術(shù)中的液流技術(shù)基礎。 3.1956年，年，Coulter在多年研究的基礎上利用在多年研究的基礎上利用Coulter效應生產(chǎn)了效應生產(chǎn)了Coulter 計數(shù)計數(shù)器。其基本原理是：使細胞通過一個小孔，只在細胞與懸浮的介質(zhì)之間存在著導器。其基本原理是：使細胞通過一個小孔，只在細胞與懸浮的介質(zhì)之間存在著導電性上的差異，便會影響小孔道的電阻特性，從而形成電脈沖信號，測量電脈沖電性上的差異，便會影響小孔道的電阻特性，從而形成電脈沖信號，測量電脈沖的強度和個數(shù)則可獲得有關細胞大小和

25、數(shù)目方面的信息。的強度和個數(shù)則可獲得有關細胞大小和數(shù)目方面的信息。4.1967年年Holm等設計了通過汞弧光燈激發(fā)熒光染色的細胞，再由光電檢測設備等設計了通過汞弧光燈激發(fā)熒光染色的細胞，再由光電檢測設備計數(shù)的裝置。計數(shù)的裝置。5.1973年年Steinkamp設計了一種利用激光激發(fā)雙色熒光色素標記的細胞，既能設計了一種利用激光激發(fā)雙色熒光色素標記的細胞，既能分析計數(shù)，又能進行細胞分選的裝置。這樣就基本完成了現(xiàn)代分析計數(shù)，又能進行細胞分選的裝置。這樣就基本完成了現(xiàn)代FCM計數(shù)技術(shù)的主計數(shù)技術(shù)的主要歷程。要歷程。流式細胞儀結(jié)構(gòu)流式細胞儀結(jié)構(gòu) 激光光源及光束形成系統(tǒng)激光光源及光束形成系統(tǒng) 流動室及液

26、流驅(qū)動系統(tǒng)流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng) 光學系統(tǒng)：透鏡、濾光片、小孔，聚焦光源，光學系統(tǒng)：透鏡、濾光片、小孔，聚焦光源， 收集不同波長的熒光信號。收集不同波長的熒光信號。 信號檢測與分析：光電倍增管（信號檢測與分析：光電倍增管（PMT）、補償）、補償 電路。熒光信號轉(zhuǎn)換為電信號，并將信號放電路。熒光信號轉(zhuǎn)換為電信號，并將信號放 大。大。 存儲、顯示、分析系統(tǒng)：計算機。存儲、顯示、分析系統(tǒng)：計算機。 細胞分選系統(tǒng)細胞分選系統(tǒng)EPICS XL 流式細胞分析儀流式細胞分析儀* * *工作原理工作原理 在一定的壓力下，鞘液帶著細胞或是微粒通過噴嘴中心在一定的壓力下，鞘液帶著細胞或是微粒通過噴嘴中心進入到流式照

27、射室，在流式照射室的分析點，激光照射到進入到流式照射室，在流式照射室的分析點，激光照射到細胞發(fā)生散射和折射，發(fā)射出散射光；同時，細胞所攜帶細胞發(fā)生散射和折射，發(fā)射出散射光；同時，細胞所攜帶的熒光素被激光激發(fā)并發(fā)射出熒光。前向散射光（的熒光素被激光激發(fā)并發(fā)射出熒光。前向散射光（FSC)FSC)和和側(cè)向散射光（側(cè)向散射光（SSC)SSC)檢測器把散射光轉(zhuǎn)換成電信號，熒光則檢測器把散射光轉(zhuǎn)換成電信號，熒光則被激光器收集，不同顏色的熒光被雙色反光鏡轉(zhuǎn)向不同的被激光器收集，不同顏色的熒光被雙色反光鏡轉(zhuǎn)向不同的光電倍增器，把熒光轉(zhuǎn)換成電信號。散射光信號和熒光信光電倍增器，把熒光轉(zhuǎn)換成電信號。散射光信號和熒

28、光信號經(jīng)過放大后，再經(jīng)數(shù)據(jù)化處理輸入電腦并儲存，根據(jù)細號經(jīng)過放大后，再經(jīng)數(shù)據(jù)化處理輸入電腦并儲存，根據(jù)細胞的散射光和熒光進行分析或分選。胞的散射光和熒光進行分析或分選。Flow CellInjector TipSheath fluid 液體在高壓下形成一個圓柱形的液流，樣品從液流的中心流入，液體就像一個鞘液體在高壓下形成一個圓柱形的液流，樣品從液流的中心流入，液體就像一個鞘一樣包在樣品的外面。流動的鞘液和流動的細胞在噴嘴處匯合，并且在噴嘴處被加一樣包在樣品的外面。流動的鞘液和流動的細胞在噴嘴處匯合，并且在噴嘴處被加速，使細胞精確列隊依次通過激光束。在噴嘴處細胞進入鞘液并且一直保持在中心速，使細

29、胞精確列隊依次通過激光束。在噴嘴處細胞進入鞘液并且一直保持在中心位置，這個技術(shù)被稱為流體動力聚焦。流體動力聚焦使細胞限制并保持在液流的中位置，這個技術(shù)被稱為流體動力聚焦。流體動力聚焦使細胞限制并保持在液流的中心。樣品在液流中心的流動稱之為軸流。心。樣品在液流中心的流動稱之為軸流。Forward Angle Light Scatter前向散射光（前向散射光（FSC)FALS SensorLaser透鏡安裝在分析點周圍，用于收集細胞被照射時出現(xiàn)的光信號，信號傳透鏡安裝在分析點周圍，用于收集細胞被照射時出現(xiàn)的光信號，信號傳想光電二極管或光電倍增器，光電管再把接收的信號轉(zhuǎn)換成電脈沖，電想光電二極管或光

30、電倍增器，光電管再把接收的信號轉(zhuǎn)換成電脈沖，電脈沖的強度與光強度成正比。脈沖的強度與光強度成正比。FSC反映細胞的大小與體積反映細胞的大小與體積。前向散射角傳感器 90 Degree Light Scatter（side scatter,SSC)直角光散射（側(cè)向散射光）直角光散射（側(cè)向散射光）FALS Sensor90LS SensorLaser 在照射點的側(cè)向（在照射點的側(cè)向（90度）有一個光電二極管接收細胞散射的光信號，細胞表面度）有一個光電二極管接收細胞散射的光信號，細胞表面越粗糙、越不規(guī)則或內(nèi)部的顆粒越多，散射到側(cè)向的光信號越大。越粗糙、越不規(guī)則或內(nèi)部的顆粒越多，散射到側(cè)向的光信號越大

31、。SSC的強度與細的強度與細胞的表面結(jié)構(gòu)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其大小和形狀有關，也成為粒度信號或直角光散射信號。胞的表面結(jié)構(gòu)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其大小和形狀有關，也成為粒度信號或直角光散射信號。側(cè)向散射角傳感器側(cè)向散射角傳感器LaserFluorescence Detectors（熒光檢測器）（熒光檢測器）FreqFluorescenceFALS SensorFluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.) 光電倍增管（光電倍增管（PMT)可以用來檢測從細胞發(fā)出的不同顏色的熒光信號?？梢杂脕頇z測從細胞發(fā)出的不同顏色的熒光信號。細胞熒光包括自身的熒光和熒光素發(fā)出的不同顏色的熒光信號。細

32、胞熒光包括自身的熒光和熒光素發(fā)出的不同顏色的熒光信號。PMT只接只接收一定波長的熒光，為了收一定波長的熒光，為了PMT只檢測一個波長的光，一般在只檢測一個波長的光，一般在PMT之前安裝之前安裝雙色反光鏡和不同顏色的濾光片。雙色反光鏡和不同顏色的濾光片。Standard Band Pass Filter（帶通濾波器）（帶通濾波器）Transmitted LightWhite Light Source630 nm BandPass Filter620 -640 nm LightDichroic Filter/Mirror at 45 deg（雙色反光鏡）直角形信號檢測系統(tǒng)（雙色反光鏡）直角形信號檢

33、測系統(tǒng)Reflected lightTransmitted LightLight Source雙色反光鏡是通過反射一定波長范圍的光，透過其余光來實現(xiàn)分離作用的。雙色反光鏡是通過反射一定波長范圍的光，透過其余光來實現(xiàn)分離作用的。短通反光鏡短通反光鏡-605nm短通反光鏡（短通反光鏡（605DSP)允許短于允許短于605nm的光透過，長于的被反射。的光透過，長于的被反射。長通反光鏡長通反光鏡- 605nm長通反光鏡（長通反光鏡（605DLP)允許長于允許長于605nm的光透過，短于的被反射的光透過，短于的被反射 流式細胞術(shù)常用熒光素流式細胞術(shù)常用熒光素 流式細胞儀測定常用的熒光染料有多種流式細胞儀

34、測定常用的熒光染料有多種,他們分子結(jié)構(gòu)不同，激發(fā)他們分子結(jié)構(gòu)不同，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜也各異，選擇熒光染料時必須依據(jù)流式細胞儀所配備光譜和發(fā)射光譜也各異，選擇熒光染料時必須依據(jù)流式細胞儀所配備的激光光源的發(fā)射光波長（如氬離子氣體激光管的激光光源的發(fā)射光波長（如氬離子氣體激光管,它的發(fā)射光波它的發(fā)射光波488nm,氦氖離子氣體激光管發(fā)射光波長氦氖離子氣體激光管發(fā)射光波長633nm）。）。488nm激光光源常用的熒激光光源常用的熒光染料有光染料有FITC（異硫氰酸熒光素）、（異硫氰酸熒光素）、PE（藻紅蛋白）、（藻紅蛋白）、PI（碘化丙（碘化丙啶）、啶）、CY5（化青素）、（化青素）、preCP(葉

35、綠素蛋白葉綠素蛋白)、ECD(藻紅蛋白藻紅蛋白-得克薩得克薩斯紅斯紅)等。他們的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別是：等。他們的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別是： 激發(fā)光波長（激發(fā)光波長（ nm） 發(fā)射光峰值（發(fā)射光峰值（ nm） FITC 488 525（綠）（綠） PE 488 575（橙紅）（橙紅） PI 488 630（橙紅）（橙紅） ECD 488 610（紅）（紅） CY5 488 675（深紅）（深紅） PreCP 488 675（深紅）（深紅）FL3(PE-TX Red)FL5(PE-Cy7)FL2(PE)FL1(FITC)SSCFL4(PE-Cy5)630/30488/10670/30740LP

36、530/40580/30通道通道1熒光和熒光和SSC650DSP718DSP605DSP555DLP505DSP直角形信號檢測系統(tǒng)直角形信號檢測系統(tǒng)示意圖示意圖510550nm帶通濾光片帶通濾光片565595nm長通濾光片長通濾光片740nm665685nm605650nm 525 575FCM的主要測定指標的主要測定指標 FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4)其中：其中：FSC：反映細胞的大?。悍从臣毎拇笮SC：反映細胞內(nèi)顆粒性：反映細胞內(nèi)顆粒性外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖FCM標記方法標記方法單標：單標：一種單抗一種單抗/tube: FL

37、1, FSC, SSC（三參數(shù)）（三參數(shù)）雙標：雙標：（兩種單抗（兩種單抗/tube）：）：FL1, FL2, FSC, SSC（四（四參數(shù)）參數(shù)）三三/四標：四標：（三種單抗（三種單抗/tube）（四種單抗）（四種單抗/tube）：）：FL1-FL3/4, FSC, SSCq PE最強，適用于弱表達抗原最強，適用于弱表達抗原q FITC最便宜，適用于強表達抗原，適用范圍廣最便宜，適用于強表達抗原，適用范圍廣q biotin-avidin不適合弱抗原的檢測不適合弱抗原的檢測抗體的選擇抗體的選擇 散點圖 密度圖二維等高圖直方圖圖圖 報告中常見的幾種流式細胞圖報告中常見的幾種流式細胞圖Dot pl

38、ot細胞分選細胞分選1. 1. 液滴形成液滴形成液滴沿著一個軸振動，液流會斷開形成液滴液滴沿著一個軸振動，液流會斷開形成液滴2. 2. 延遲時間延遲時間 當細胞從振動的噴嘴流出到分析點時被激光照射，同時被檢當細胞從振動的噴嘴流出到分析點時被激光照射，同時被檢測器檢測。在分析點下方，液流流出一定的距離才開始斷開形成單個的液滴，測器檢測。在分析點下方，液流流出一定的距離才開始斷開形成單個的液滴，細胞包含在某些液滴的內(nèi)部。流式細胞儀在液滴的斷點對含有目標細胞的液滴細胞包含在某些液滴的內(nèi)部。流式細胞儀在液滴的斷點對含有目標細胞的液滴充電。分析點和充電點不在同一時間，存在時間差，這就是延遲時間。充電。分

39、析點和充電點不在同一時間，存在時間差，這就是延遲時間。流式分選的重要技巧是只給含有目標細胞的液滴進行充電。流式分選的重要技巧是只給含有目標細胞的液滴進行充電。3. 3. 液滴充電和偏轉(zhuǎn)液滴充電和偏轉(zhuǎn)在液滴的斷點處，對含有目標細胞的液滴進行充電，使其帶上正或負電荷，在在液滴的斷點處，對含有目標細胞的液滴進行充電，使其帶上正或負電荷，在液流的兩側(cè)放置偏轉(zhuǎn)電極板，不同正負電荷的液滴分別偏向兩側(cè)，最后落到收液流的兩側(cè)放置偏轉(zhuǎn)電極板，不同正負電荷的液滴分別偏向兩側(cè)，最后落到收集容器中。現(xiàn)在可以四路的分選。集容器中。現(xiàn)在可以四路的分選。4.4.液滴的收集液滴的收集488 nm laser+-Fluores

40、cence Activated Cell Sorting(細胞分選）細胞分選）Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector+85v+190v- 85v- 190v廢廢 液液流式細胞術(shù)的科研應用流式細胞術(shù)的科研應用 分析群體細胞分析群體細胞 所需時間短所需時間短 多參數(shù)分析多參數(shù)分析 定性或定量定性或定量流式應用常見范圍流式應用常見范圍 細胞大小細胞大小 細胞的顆粒度細胞的顆粒度 細胞表面分子：細胞表面分子：CD 系列系列 細胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細胞因子細胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細胞因子 細胞

41、核內(nèi)分子：細胞核內(nèi)分子：P53 細胞功能檢測：細胞周期、凋亡細胞功能檢測：細胞周期、凋亡流式細胞儀標本的制備流式細胞儀標本的制備一、新鮮實體瘤單細胞懸液的制備一、新鮮實體瘤單細胞懸液的制備（一）酶消化法（一）酶消化法（二）機械法：（二）機械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法（三）化學法：（三）化學法：作用原理除去細胞之間起到粘連的鎂離子和作用原理除去細胞之間起到粘連的鎂離子和鈣離子，而使細胞分散開來一般用鈣離子，而使細胞分散開來一般用EDTA胰酶消化液。胰酶消化液。（四）低滲法（四）低滲法利用低滲的原理使細胞膜破裂，細胞核逸出稱為分散的單細利用低滲的原理使細胞膜破裂，細胞核逸出稱

42、為分散的單細胞核的懸液。該法適用于由新鮮的實體瘤組織直接脫核做核胞核的懸液。該法適用于由新鮮的實體瘤組織直接脫核做核酸染色、酸染色、DNA倍體和細胞周期分析。避免脫核時間過長而并倍體和細胞周期分析。避免脫核時間過長而并沒有用乙醇固定，則易造成核膨脹或破裂。沒有用乙醇固定，則易造成核膨脹或破裂。（一）酶消化法（一）酶消化法 0.5% pH 1.5胃蛋白酶、胃蛋白酶、0.25% 胰蛋白酶、胰蛋白酶、0.05%膠原酶膠原酶 主要是水解組織間的膠原纖維和多糖物質(zhì)、分開細胞間主要是水解組織間的膠原纖維和多糖物質(zhì)、分開細胞間的緊密連接。的緊密連接。1. 切除的組織應馬上放入預冷的組織培養(yǎng)液或生理鹽水中，切

43、除的組織應馬上放入預冷的組織培養(yǎng)液或生理鹽水中，清洗血跡及其他污染物清洗血跡及其他污染物2. 除去的組織塊上的壞死成分、纖維、脂肪以及血管等組織除去的組織塊上的壞死成分、纖維、脂肪以及血管等組織3. 將組織塊剪成約將組織塊剪成約1cm大小的小塊，用冷的生理鹽水洗去剪大小的小塊，用冷的生理鹽水洗去剪碎的細胞碎片碎的細胞碎片4. 一般來說取一般來說取1.0g組織加入適當?shù)拿赶航M織加入適當?shù)拿赶?0ml5. 37的恒溫水箱消化的恒溫水箱消化20-30min，消化期間要振蕩或吹打，消化期間要振蕩或吹打 用冷的培養(yǎng)液終止消化，收集單細胞懸液用冷的培養(yǎng)液終止消化，收集單細胞懸液 先后用先后用200

44、目和目和350目的尼龍網(wǎng)過濾除去凝聚的細胞團塊，目的尼龍網(wǎng)過濾除去凝聚的細胞團塊，收集細胞并計數(shù)、收集細胞一般不小于收集細胞并計數(shù)、收集細胞一般不小于106細胞用乙醇固定，留用。細胞用乙醇固定，留用。（二）機械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法（二）機械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法 使細胞由緊密聯(lián)結(jié)的組織中釋放出來，這種使細胞由緊密聯(lián)結(jié)的組織中釋放出來，這種方法的缺點是對細胞的損傷比較大，導致細胞碎方法的缺點是對細胞的損傷比較大，導致細胞碎片多和細胞團塊多，影響流式細胞儀的測試的準片多和細胞團塊多，影響流式細胞儀的測試的準確性和精密度，當樣本中的細胞碎片超過確性和精密度，當樣本中的細胞碎片超過20%時時

45、測試的誤差就很大。測試的誤差就很大。（三）化學法（三）化學法 作用原理除去細胞之間起到粘連的鎂離子和鈣離作用原理除去細胞之間起到粘連的鎂離子和鈣離子，而使細胞分散開來一般用子，而使細胞分散開來一般用EDTA胰酶消化液。胰酶消化液。1.將組織剪成小塊放入試管將組織剪成小塊放入試管2.先加入先加入EDTA液液5ml，室溫下半個小時棄去。，室溫下半個小時棄去。3.加入加入EDTA胰酶消化液胰酶消化液510ml，37水浴中水浴中 30min，間斷振蕩，間斷振蕩3-5次次4.加入加入350目尼龍網(wǎng)進行過濾，離心沉淀目尼龍網(wǎng)進行過濾，離心沉淀1000rpm，5min，生理鹽水沖洗，生理鹽水沖洗2-3次，離

46、心次，離心800rpm5-8min。5.收集細胞懸液再離心棄上清，管底細胞打勻吸入吸收集細胞懸液再離心棄上清，管底細胞打勻吸入吸 管內(nèi)，總體積管內(nèi)，總體積0.1-0.2ml，用，用70%乙醇進行固定，乙醇進行固定， 放置放置4冰箱待檢。冰箱待檢。二、新鮮實體瘤單細胞核懸液的制備二、新鮮實體瘤單細胞核懸液的制備：用用于細胞核內(nèi)的成分分析，特別是做于細胞核內(nèi)的成分分析，特別是做DNA定量核定量核細胞周期檢測時測定方便實用。細胞周期檢測時測定方便實用。三、石蠟包埋組織單細胞懸液的制備三、石蠟包埋組織單細胞懸液的制備可用于既往實驗材料的回顧性研究可用于既往實驗材料的回顧性研究原理：將石蠟包埋組織經(jīng)二甲

47、苯脫蠟，采用梯度原理：將石蠟包埋組織經(jīng)二甲苯脫蠟，采用梯度酒精到水，使組織逐漸分級水化，使組織恢復到酒精到水，使組織逐漸分級水化，使組織恢復到甲醛固定前的狀態(tài)，應用相應的酶消化液、解聚甲醛固定前的狀態(tài)，應用相應的酶消化液、解聚組織細胞間的聯(lián)結(jié)物并使細胞從組織片中釋放而組織細胞間的聯(lián)結(jié)物并使細胞從組織片中釋放而制成單細胞懸液。制成單細胞懸液。四、其他單細胞懸液的制備四、其他單細胞懸液的制備（一）血單細胞懸液的制備（一）血單細胞懸液的制備用淋巴細胞分離液分離血中的單個核細胞。用淋巴細胞分離液分離血中的單個核細胞。（二）細胞培養(yǎng)液中的單細胞懸液的制備（二）細胞培養(yǎng)液中的單細胞懸液的制備 EDTA胰酶

48、進行消化胰酶進行消化（三）胸腹水標本單細胞懸液的制備（三）胸腹水標本單細胞懸液的制備離心洗滌，如果胸腹水中蛋白濃度過高的話，加入肝素抗凝。離心洗滌，如果胸腹水中蛋白濃度過高的話，加入肝素抗凝。（四）膀胱灌洗液單細胞懸液的制備（四）膀胱灌洗液單細胞懸液的制備膀胱癌細胞，不從尿液中收集，尿液中細胞容易死亡和變性。膀胱癌細胞，不從尿液中收集，尿液中細胞容易死亡和變性。（五）細針穿刺物單細胞懸液的制備（五）細針穿刺物單細胞懸液的制備 與新鮮實體瘤組織細胞制備相同與新鮮實體瘤組織細胞制備相同（六）脫落細胞樣品中單細胞懸液的制備（六）脫落細胞樣品中單細胞懸液的制備 食道拉網(wǎng)法，胃鏡。支氣管鏡食道拉網(wǎng)法，胃

49、鏡。支氣管鏡流式細胞儀的應用（一）流式細胞儀的應用（一）細胞生物學：細胞生物學：細胞凋亡研究細胞凋亡研究；定量定量分析細胞周期并分選分析細胞周期并分選不同不同細胞周期細胞周期時相的細胞；分析生物大分子如時相的細胞；分析生物大分子如DNADNA、RNARNA、抗原、癌基因表達產(chǎn)物等物質(zhì)與細胞增殖周期的關系，進抗原、癌基因表達產(chǎn)物等物質(zhì)與細胞增殖周期的關系，進行染色體核型分析，并可純化行染色體核型分析，并可純化X X或或Y Y染色體。染色體。腫瘤學：腫瘤學：DNADNA倍體含量測定是鑒別良、惡性腫瘤的特異倍體含量測定是鑒別良、惡性腫瘤的特異指標。近年來已應用指標。近年來已應用DNADNA倍體測定技

50、術(shù)，對白血病、淋巴倍體測定技術(shù)，對白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多種實體瘤細胞進行探測。瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多種實體瘤細胞進行探測。用單克降抗體技術(shù)清除血液中的腫瘤細胞。用單克降抗體技術(shù)清除血液中的腫瘤細胞。免疫學：免疫學：研究細胞周期或研究細胞周期或DNADNA倍體與細胞表面受體及抗倍體與細胞表面受體及抗原表達的關系；進行免疫活性細胞的分型與純化；分析淋原表達的關系；進行免疫活性細胞的分型與純化；分析淋巴細胞亞群與疾病的關系；免疫缺陷病如艾滋病的診斷；巴細胞亞群與疾病的關系；免疫缺陷病如艾滋病的診斷；器官移植后的免疫學監(jiān)測等。器官移植后的免疫學監(jiān)測等。流式細胞儀的應用（二）

51、流式細胞儀的應用（二）血液學：血液學：血液細胞的分類、分型，造血細胞分化的研究，血液細胞的分類、分型，造血細胞分化的研究，血細胞中各種酶的定量分析，如過氧化物酶、非特異性酯酶血細胞中各種酶的定量分析，如過氧化物酶、非特異性酯酶等；用等；用NBT及及DNA雙染色法可研究白血病細胞分化成熟與細雙染色法可研究白血病細胞分化成熟與細胞增殖周期變化的關系，檢測母體血液中胞增殖周期變化的關系，檢測母體血液中Rh(+)或抗或抗D抗原陽抗原陽性細胞，以了解胎兒是否可能因性細胞，以了解胎兒是否可能因Rh血型不合而發(fā)生嚴重溶血；血型不合而發(fā)生嚴重溶血；檢測血液中循環(huán)免疫復合物可以診斷自身免疫性疾病，如紅檢測血液中

52、循環(huán)免疫復合物可以診斷自身免疫性疾病，如紅斑狼瘡等。斑狼瘡等。藥物學：藥物學：檢測藥物在細胞中的分布，研究藥的作用機制，檢測藥物在細胞中的分布，研究藥的作用機制，亦可用于篩選新藥，如化療藥物對腫瘤的凋亡機制，可通過亦可用于篩選新藥，如化療藥物對腫瘤的凋亡機制，可通過測測DNA凋亡峰，凋亡峰，Bcl-2凋亡調(diào)節(jié)蛋白等凋亡調(diào)節(jié)蛋白等 細胞熒光染色定量技術(shù)細胞熒光染色定量技術(shù)一、細胞內(nèi)抗原定量技術(shù)一、細胞內(nèi)抗原定量技術(shù)（一）（一）原理原理 二抗上帶有熒光標記。用標記已知數(shù)量的熒光素分子的標準微球作參照，二抗上帶有熒光標記。用標記已知數(shù)量的熒光素分子的標準微球作參照，可以計算出每個細胞抗原決定簇的數(shù)量

53、可以計算出每個細胞抗原決定簇的數(shù)量（二）（二）方法方法1.首先設立標準化的熒光素標記抗體首先設立標準化的熒光素標記抗體2.設定好流式的各種參數(shù)，保持不變設定好流式的各種參數(shù)，保持不變3.測定標準化的熒光素的強度，做出熒光分子數(shù)與熒光強度之間的標準曲線測定標準化的熒光素的強度，做出熒光分子數(shù)與熒光強度之間的標準曲線4.測定待測細胞上的熒光強度測定待測細胞上的熒光強度5.根據(jù)熒光強度計算出每個細胞的熒光素的分子數(shù)。根據(jù)熒光強度計算出每個細胞的熒光素的分子數(shù)。流式細胞流式細胞儀應用舉儀應用舉例例1（三）（三）測定的意義測定的意義1.PCNA及及Ki67核抗原的測定核抗原的測定2.C-erb-2抗凋亡

54、基因測定抗凋亡基因測定3.Myc基因家族基因家族4.P535.檢測特征性的標記物檢測特征性的標記物6.測定細胞內(nèi)巨細胞病毒測定細胞內(nèi)巨細胞病毒二二. DNA定量技術(shù)定量技術(shù)（一）（一）DNA定量方法定量方法1.DNA熒光染料定量法熒光染料定量法根據(jù)熒光染料如根據(jù)熒光染料如PI、EB等對細胞核等對細胞核DNA的親和能力，使其染色，用流式細胞儀分析的親和能力，使其染色，用流式細胞儀分析細胞中細胞中DNA的含量。與的含量。與DNA結(jié)合的熒光染料越多，熒光強度愈強。結(jié)合的熒光染料越多，熒光強度愈強。DNA含量增多證含量增多證實有腫瘤細胞出現(xiàn)。如果發(fā)現(xiàn)異倍體細胞即為惡性腫瘤實有腫瘤細胞出現(xiàn)。如果發(fā)現(xiàn)異倍

55、體細胞即為惡性腫瘤2.溴化乙啶嘧啶核苷定量法溴化乙啶嘧啶核苷定量法3.吖啶橙定量法吖啶橙定量法（二）對臨床腫瘤的指導意義（二）對臨床腫瘤的指導意義 軟組織腫瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、腎細胞癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌和軟組織腫瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、腎細胞癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌和宮頸癌。宮頸癌。（三）對癌前病變（三）對癌前病變DNA倍體分析倍體分析 細胞不典型增生的程度愈明顯，則細胞不典型增生的程度愈明顯，則DNA異倍體出現(xiàn)率也增高。異倍體出現(xiàn)率也增高。（四）在腫瘤治療中的作用（四）在腫瘤治療中的作用 腫瘤存在異質(zhì)性，同一種腫瘤細胞對同一化療藥物也可能存在不同程度的反應。腫瘤存在異質(zhì)性

56、，同一種腫瘤細胞對同一化療藥物也可能存在不同程度的反應。通過對通過對DNA含量、含量、S期比率分析，有助于對化療藥物的選擇或放射線有效照射量及期比率分析，有助于對化療藥物的選擇或放射線有效照射量及時間的決定。時間的決定。*細胞凋亡檢測技術(shù)細胞凋亡檢測技術(shù)檢測凋亡的方法檢測凋亡的方法（一）形態(tài)學檢測（一）形態(tài)學檢測 FS,SS,反映了細胞體積縮小，胞核和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)反映了細胞體積縮小，胞核和細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，但是不可以對凋亡細胞進行定量。變化，但是不可以對凋亡細胞進行定量。流式細胞流式細胞儀應用舉儀應用舉例例2（二）根據(jù)細胞膜通透性的染色法（二）根據(jù)細胞膜通透性的染色法 凋亡細胞膜透性有一定程度的增

57、加，染料凋亡細胞膜透性有一定程度的增加，染料Hoechst 33342透性增加，透性增加，PI透性不增加可以用來區(qū)分活細胞、凋透性不增加可以用來區(qū)分活細胞、凋亡細胞和死細胞。亡細胞和死細胞。Hoechst 33342/PI 雙染色法：低藍色雙染色法：低藍色/低紅光低紅光 正常細胞正常細胞 高藍光高藍光/低紅光低紅光 凋亡細胞凋亡細胞 低藍光低藍光/高紅光高紅光 死亡細胞死亡細胞（三）凋亡細胞的（三）凋亡細胞的TUNEL和和ISNT法法1.直接標記法直接標記法DNA斷點測定：斷點測定：3羥基末端，羥基末端，DNA聚合酶聚合酶-1催催化的原位缺口轉(zhuǎn)移法，缺口標記的是生物素化化的原位缺口轉(zhuǎn)移法，缺口

58、標記的是生物素化的脫氧三磷酸尿苷或地高辛配體脫氧三磷酸尿的脫氧三磷酸尿苷或地高辛配體脫氧三磷酸尿苷；后者標記的為苷；后者標記的為FITC-dUTP.2.間接標記法、用鏈霉素親和素間接標記法、用鏈霉素親和素-FITC或抗地或抗地高辛高辛-FITC，使其靈敏度高。，使其靈敏度高。 無法區(qū)分死細胞。無法區(qū)分死細胞。流式流式“TUNEL”脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化FITC-dUTP和和3OH末端末端結(jié)合，結(jié)合，DNA破裂的斷端被破裂的斷端被FITC-dUTP結(jié)合。結(jié)合。（四）用熒光染料對降解的（四）用熒光染料對降解的DNA進行測定進行測定 細胞凋亡后，細胞凋亡后，DNA斷裂，斷裂，DNA

59、斷裂生成的小片段斷裂生成的小片段易于釋放到細胞外，導致細胞內(nèi)的易于釋放到細胞外，導致細胞內(nèi)的DNA含量減少。用含量減少。用親親DNA的染料的染料PI對固定后的細胞進行染色，經(jīng)流式細對固定后的細胞進行染色，經(jīng)流式細胞儀分析凋亡細胞位于正常細胞的胞儀分析凋亡細胞位于正常細胞的G0/G1期峰之前出期峰之前出現(xiàn)凋亡細胞峰。不能檢測早期凋亡細胞。現(xiàn)凋亡細胞峰。不能檢測早期凋亡細胞。細胞周期不能區(qū)分凋亡與死亡細胞細胞周期不能區(qū)分凋亡與死亡細胞 Sub-G0/G1 peaks - PI staining（五）（五）FITC-AnnexinV / PI雙染色法雙染色法 細胞凋亡早期是膜表面的磷脂酰絲氨酸（細胞

60、凋亡早期是膜表面的磷脂酰絲氨酸（PS)從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到膜外，因此細從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到膜外，因此細胞膜上磷脂分布的不對稱性被破壞而使胞膜上磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在膜外。暴露在膜外。AnnexinV是一種鈣離子是一種鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，易與依賴的磷脂結(jié)合蛋白，易與PS結(jié)合，由此充當了檢測結(jié)合，由此充當了檢測PS的探針。的探針。 R1File: 4Acquisition Date: 06-Mar-03QuadEvents% Gated X MeanY MeanUL2542.4037.47461.36UR106710.08816.86468.89LL529149.9819.574.4