細(xì)胞學(xué)診斷組織印片、壓片的制備

1、細(xì)胞學(xué)診斷組織印片、壓片的制備（一）組織印片：1 .用鋒利刀片剖開剛切取的新鮮月中瘤組織或淋巴結(jié)等，然后用清潔載玻片輕壓于組織剖面處，將組織表面的細(xì)胞成分印在玻片上。用稍微加溫的載玻片制備印片時(shí)，可印得較多細(xì)胞。2 .制作淋巴結(jié)印片前，應(yīng)先用濾紙吸去淋巴結(jié)切面上的血液、組織液。（二）壓片：1 .選取微小薄片組織平鋪于一張載玻片上，再用另一張載玻片疊加其上并予輕壓。2 .腦組織質(zhì)軟，易于制作壓片；稍硬的組織需切成細(xì)碎薄片制作壓片。四、涂片的固定（一）用于HE染色和巴氏染色的涂片必須濕固定，即涂片后立即進(jìn)行固定。乳頭溢液涂片和液體標(biāo)本離心沉淀物涂片，應(yīng)待涂膜潮干（即周膜稍干而其中央?yún)^(qū)域未干）時(shí)進(jìn)行

2、固定。用于瑞氏染色、May-Grunwald姬姆薩染色和免疫細(xì)胞化學(xué)染色的涂片，必須干固定，即待涂片稍干后再進(jìn)行固定。（二）固定液1 .乙醇一冰醋酸液：95K醇：冰醋酸=99：1。常用。2 .乙醇乙醴液：95猿醇49.5ml,乙醴49.5ml,冰醋酸1ml。較常用。3 .甲醇：滴加在干燥涂片上，用于瑞氏染色、May-Grunwald姬姆薩染色和免疫細(xì)胞化學(xué)染色。4 .丙酮：適用于酶類染色。5 .Carnoy液：由無水乙醇、氯仿、冰醋酸按6:3:1比例混成，適用于顯示核酸、糖原、黏液染色。涂片在Carnoy液固定35min后，應(yīng)移入95猿醇中繼續(xù)固定。6 .對(duì)于液體標(biāo)本的離心沉淀物、食管拉網(wǎng)獲取

3、的小塊組織或吸出物中的細(xì)小組織塊等，固定于4刈性甲醛液中1h,然后制作常規(guī)石蠟包埋切片。（三）固定方法1 .浸入法：（1）將稍為干燥（不能完全干燥）的涂片直接浸泡于固定液內(nèi)至少1530min。(2)因細(xì)胞容易脫落，宜以一個(gè)盛有固定液的容器只固定一例標(biāo)本的涂片；一個(gè)容器固定多例涂片時(shí)，有可能造成的月中瘤細(xì)胞交叉污染。(3)必要時(shí)可將標(biāo)本涂在硅化載玻片上，以防脫落。(4)固定液重復(fù)使用時(shí)，應(yīng)先用濾紙過濾。(5)95%醇固定液多次重復(fù)使用時(shí)，需測(cè)定其濃度比重，乙醇濃度低于90%時(shí)應(yīng)予棄用。2.滴加法：將固定液滴加于平放的干燥涂片上，應(yīng)避免因固定液揮發(fā)造成沉淀。(四)固定后未染色涂片的保存或郵寄：涂片

4、固定15min后取出，立即滴加數(shù)滴甘油于涂膜上。對(duì)該涂片進(jìn)行染色前，應(yīng)先將其置于95%L醇中溶去甘油。五、涂片的染色最常用于細(xì)胞病理學(xué)涂片檢查的是蘇木素-伊紅(HE染色和巴氏染色。(一)蘇木素伊紅(HE染色。(二)染色程序1.石蠟切片HE染色(常規(guī)HE染色)(1) 二甲苯I510min(2) 二甲苯H510min(3) 無水乙醇I13min(4) 無水乙醇H13min(5) 95%L醇I13min(6) 95%L醇H13min(7) 80%L醇1min(8) 蒸儲(chǔ)水1min(9) 蘇木素液染色510min(10) 流水洗去蘇木素液1min(11) 1%fc酸-乙醇13s(12)稍水洗12s(1

5、3)返藍(lán)(用溫水或1%a水等)510s(14)流水沖洗12min(15)蒸儲(chǔ)水洗12min(16) 0.5%R紅液染色13min(17)蒸儲(chǔ)水稍洗12s(18) 80%醇12s(19) 95%>123min(20) 95%>H23min(21)無水乙醇I35min(22)無水乙醇H35min(23)石炭酸-二甲苯35min(24)二甲苯I35min(25)二甲苯H35min(26)二甲苯田35min(27)中性樹膠封固注：(12)和(13)項(xiàng)可省去，但(14)的沖水時(shí)間需延長(zhǎng)至1015min(細(xì)胞核顯示更清晰)。(23)項(xiàng)可用無水乙醇代替；北方地區(qū)可省略。2.冰凍切片HE染色(1)

6、冰凍切片固定1030s(2)稍水洗12s(3)蘇木素液染色(60C)3060s(4)流水洗去蘇木素液510s(5) 1%就酸-乙醇13s(6)稍水洗12min(7)返藍(lán)(用溫水或1%氨水等)510s(8)流水沖洗1530s(9) 0.5%(R紅液染色12min(10)蒸儲(chǔ)水稍洗12min(11) 80%醇12min(12) 95%醇12min(13)無水乙醇I12min(14)無水乙醇H12min(15)石炭酸-二甲苯23min(16)二甲苯I23min(17)二甲苯H23min(18)中性樹膠封固注：(7)和(8)項(xiàng)可省去，但(9)的沖水時(shí)間需延長(zhǎng)至1015min(細(xì)胞核顯示更清晰)。(15

7、)項(xiàng)可用無水乙醇代替；北方地區(qū)可省略。染色結(jié)果：細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿、肌纖維、膠原纖維和紅細(xì)胞呈不同程度的紅色。鈣鹽和細(xì)菌可呈藍(lán)色或紫藍(lán)色。染色注意事項(xiàng)1.切片染色前，應(yīng)徹底脫蠟。2,用含有升汞液體固定的組織，其切片染色前應(yīng)先脫去汞鹽：(1)石蠟切片脫蠟至水洗(2)Lugol液20min(3)流水沖洗5min(4)95%醇10min(5)水洗1min(6)5%：亞硫酸鈉水溶液5min(7)流水沖洗5min(8)顯微鏡觀察除汞滿意后，轉(zhuǎn)入HE染色3 .脫除福爾馬林色素(必要時(shí))：(1)石蠟切片脫蠟至水洗(2)1%NaOH(1m叨80%J亨(99ml)混合液10min(3)流水沖洗5min(4)轉(zhuǎn)

8、入HE染色4 .嚴(yán)格執(zhí)行HE染色流程，用顯微鏡控制細(xì)胞核的蘇木素染色質(zhì)量。HE染片應(yīng)著色鮮艷，紅、藍(lán)分明，對(duì)比清晰。5 .載玻片自二甲苯中取出后，應(yīng)立即用潔凈、光亮的蓋玻片和稠度適宜的中性樹膠濕封載玻片。封蓋處內(nèi)無氣泡，外無溢膠。封片時(shí)必須進(jìn)行操作人員和局部環(huán)境的二甲苯污染防護(hù)。不應(yīng)將組織切片烤干或風(fēng)干后再行封片。6 .必須在載玻片的一端牢貼標(biāo)簽。標(biāo)簽上應(yīng)印有病理科所在的醫(yī)院名稱。標(biāo)簽上應(yīng)清楚顯示有關(guān)的病理號(hào)及其亞號(hào)；標(biāo)簽上的病理號(hào)應(yīng)準(zhǔn)確無誤，無涂改。7 .制片完成后，技術(shù)人員應(yīng)對(duì)切片與其相應(yīng)的病理學(xué)檢查記錄單或取材工作記錄單認(rèn)真進(jìn)行核對(duì)；確認(rèn)無誤后，將制備好的切片連同相關(guān)的活檢申請(qǐng)單/活檢記

9、錄單以及取材工作單等一并移交給有關(guān)的病理醫(yī)師；交接雙方經(jīng)核對(duì)無誤后，辦理移交簽字手續(xù)。8 .石蠟切片-HE染色的優(yōu)良率(甲、乙級(jí)切片所占的比率)應(yīng)85%9 .制片工作一般應(yīng)在取材后2個(gè)工作日內(nèi)完成(不含進(jìn)行脫鈣、脫脂等需要特殊處理的標(biāo)本)。10 .制片過程出現(xiàn)意外情況時(shí)，技術(shù)室人員應(yīng)及時(shí)向病理醫(yī)師和科主任報(bào)告，設(shè)法予以補(bǔ)救。(二)巴氏(Papanicolaou)染色巴氏染色時(shí)，細(xì)胞透明度好，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，色彩豐富而鮮艷，主要用于婦科細(xì)胞學(xué)涂片、痰涂片和富含鱗狀上皮細(xì)胞的涂片檢查。1 .試劑配制(1) Harri蘇木素液(2) 鹽酸一乙醇液濃鹽酸1ml70%醇99ml(3) 橙黃G6液橙黃G60

10、.5g蒸儲(chǔ)水5ml無水乙醇95ml磷鴇酸0.015g先將橙黃G溶于蒸儲(chǔ)水中，再加入無水乙醇，然后加入磷鴇酸。(4) EA36染液EA36儲(chǔ)備液A液：亮綠0.5g,溶于5ml蒸儲(chǔ)水中，溶解后加入無水乙醇至100ml。B液：伊紅0.5g,溶于5ml蒸儲(chǔ)水中，溶解后加入無水乙醇至100ml。C液：俾士麥棕0.5g,溶于5ml蒸儲(chǔ)水中，溶解后加入無水乙醇至100mleEA36工作液EA36儲(chǔ)備液的A液45mlEA36儲(chǔ)備液的B液45mlEA36儲(chǔ)備液的C液10ml磷鴇酸0.2g碳酸鋰飽和水溶液1滴2 .染色程序(1) 將已經(jīng)固定的涂片置于80%醇中2min。(2) 蒸儲(chǔ)水洗2min。(3) 蘇木素液染

11、核1012min,自來水洗。(4) 鹽酸-乙醇液分化約2030s,至涂片呈淡橙紅色。(5) 流水沖洗1015min,蒸儲(chǔ)水洗。(6) 依次用80%95%醇脫水，各2min。(7) 橙黃G6液染色35min。(8) 95%L醇洗23次，洗去多余染液。(9) EA36工作液染色35min。(10) 95%L醇洗23次，洗去多余染液。(11) 無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。3 .染色結(jié)果：細(xì)胞核呈深藍(lán)色，核仁呈紅色；不同分化類型的鱗狀上皮細(xì)胞，其胞漿顏色各異：角化細(xì)胞呈粉紅色，不全角化細(xì)胞呈橙黃色，角化前細(xì)胞呈淡藍(lán)或淡綠色；紅細(xì)胞呈橙紅或鮮紅色，白細(xì)胞的胞漿呈淡藍(lán)綠色；粘液呈淡藍(lán)或粉紅色。

12、(三)瑞氏(Wright)染色瑞氏染色一般用于血液涂片，也可用于檢查月中瘤細(xì)胞。1 .試劑配制(1)瑞氏染液瑞氏染料1g甲醇600ml將瑞氏染料放入研缽內(nèi)，加入適量甲醇與之混合研磨，使染料逐漸溶解。將溶解的染液傾入另一玻璃瓶?jī)?nèi)，然后再加入適量甲醇繼續(xù)研磨；未溶解的染料如此反復(fù)多次，直至染料完全溶解、甲醇用完為止。染液避光保存?zhèn)溆谩?2)磷酸鹽緩沖液無水磷酸氫二鈉6.5g磷酸二氫鈉4g蒸儲(chǔ)水1000mlpH:6.57.02 .染色程序(1)涂片自然干燥。(2)滴加瑞氏液染色1min。(2)滴加等量的磷酸緩沖液，輕輕搖蕩玻片或用洗耳膠球在玻片上輕輕吹氣，使兩液體混合均勻，持續(xù)1015min。(4)

13、流水洗去染液。(5)涂片風(fēng)干后，二甲苯透明，中性樹膠封片。3 .染色結(jié)果：胞核呈紫紅色，胞漿呈紫藍(lán)色，粘液呈粉紅色或淡藍(lán)色。(四)May-Grunwald-姬姆薩(Giemsaj)染色May-Grunwald-姬姆薩染色適用于造血系統(tǒng)的細(xì)胞涂片和鑒別惡型淋巴瘤的類型。May-Grunwald原液和姬姆薩原液配制繁瑣，可直接購(gòu)買。1 .試劑配制(1)May-Grunwald工作液May-Grunwald原液1份蒸儲(chǔ)水610份使用前配制。(2)姬姆薩工作液姬姆薩原液1份蒸儲(chǔ)水610份使用前配制。2 .染色程序(1)涂片自然干燥，蒸儲(chǔ)水洗12min。(2)May-Grunwald工作液染1530mi

14、n。(3)自來水沖洗，洗去載玻片上的染液，蒸儲(chǔ)水稍洗。(4)姬姆薩工作液染1530min。(5)自來水沖洗，洗去載玻片上的染液。(6)涂片風(fēng)干后，二甲苯透明，中性樹膠封片。3 .染色結(jié)果：胞核呈紫紅色，胞漿和核仁呈藍(lán)紫色。(五)Rakoff染色Rakoff染色用于陰道細(xì)胞學(xué)涂片快速測(cè)定雌激素水平。1 .試劑配制(1) 5嗾綠水溶液83ml(2) 1%伊紅水溶液17ml將兩液混合后使用。2 .染色程序(1)用細(xì)胞刷沿陰道側(cè)壁刷取黏膜鱗狀上皮細(xì)胞，放入裝有12ml生理鹽水的試管內(nèi)。(2)在試管內(nèi)滴入3滴Rakoff染液，用細(xì)胞刷在染液中輕搖混合。(3)將12滴混合液滴于載玻片上，制成涂片。(4)待

15、涂片干燥后，用中性樹膠封片。染色結(jié)果：鱗狀上皮細(xì)胞的嗜酸性和嗜堿性胞漿區(qū)分明顯。角化前細(xì)胞的核呈網(wǎng)狀，角化細(xì)胞的周縮核呈基本不著色的空泡狀。(六)猩紅-固綠染色猩紅-固綠染色用于顯示性染色體。1.試劑配制(1)猩紅染液水溶性比布里西猩紅1.0g磷鴇酸0.3g冰醋酸5.0ml50%酉精100ml(2)固綠染液：固綠0.5g磷鋁酸0.3g磷鴇酸0.3g冰醋酸5.0ml50%L醇100ml2.染色步驟(1)涂片經(jīng)95K醇固定后，置于70%L醇中2min。(2)猩紅染液中5min。(3)50%L醇中漂泊多余染液。(4)固綠染液中分化25h。每小時(shí)在顯微鏡下觀察胞漿和網(wǎng)狀核膜是否呈現(xiàn)綠色；如果綠色滿意，

16、立即取出涂片(一般約需4h)0周縮核呈鮮紅色。(5)50%L醇中5min。(6)依次置于70%95%口無水乙醇中各2min。(7)置于二甲苯溶液I、H、田中透明，各2min。(8)中性樹膠封片。染色結(jié)果：胞核呈淡綠色；性染色質(zhì)呈粉紅色、V字形或貼著于細(xì)胞膜呈三角形。在性染色質(zhì)周圍可見空泡。(七)Fouchet染色Fouchet染色用于顯示膽色素。1 .染液配制Fouchet染液A液：25%E氯醋酸水溶液B液：10%E氯化鐵水溶液A、B液皆小量新鮮配制為宜。使用時(shí)，取AB液各30ml混勻(當(dāng)天使用)<2 .染色步驟(1)涂片經(jīng)95%酉精固定后，置于蒸鐳水中漂洗(2) Fouchet液中染5

17、min。(3)蒸鐳水I、n中各1min。(4)苦味品紅溶液中染5min。(5)95%醇I、II中漂洗。(6)無水乙醇I、II中脫水。(7)二甲苯I、II中透明，中性樹膠封片。3.染色結(jié)果：膽色素呈橄欖綠色，膠原纖維呈紅色，涂片背景呈黃色(八)硫酸亞鐵染色硫酸亞鐵染色用于顯示黑色素。1 .試劑配制(1) 2.5%S酸亞鐵水溶液(2) 鐵氟化鉀醋酸液鐵氟化鉀1g蒸儲(chǔ)水99ml冰醋酸1ml(3) 1%冰醋酸水溶液(4)核固紅液參見第4章第一節(jié)的八(三)項(xiàng)(愛先藍(lán)法)2 .染色程序(1)涂片經(jīng)95%酉精固定后，置于蒸鐳水中漂洗12min。(2) 2.5%硫酸亞鐵溶液中1h。(3)蒸鐳水I、H、田中漂洗

18、，各1min。(4)鐵氟化鉀醋酸液中30min。(5) 1%水醋酸液中1min。(6)蒸鐳水漂洗。(7)核固紅液中染12min(8)蒸鐳水漂洗。(9)依次95%L醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。3 .染色結(jié)果：黑色素呈深綠或深藍(lán)色，涂片背景呈紅色或粉紅色。(九)快速硝酸銀染色快速硝酸銀染色用于顯示卡氏肺囊蟲和真菌。1 .試劑配制(1)硝酸銀烏洛托品常備液：3%；洛托品溶液100ml與5%勺硝酸銀溶液5ml充分混合工作液：常備液25ml、蒸鐳水25ml與5%B酸鈉2ml充分混合。(2) 固綠常備液：固綠0.2g充分溶解于0.2%冰醋酸液100ml中。工作液：常備液10ml與蒸鐳水40ml混合(3) 5婚酸溶液1%IE硫酸氫鈉溶液0.2%氯化金溶液2%M弋硫酸鈉溶液2 .染色步驟(1)涂片經(jīng)95K醇固定后，置于蒸鐳水中漂洗1min。(2) 5%各酸溶液(43c水浴)中2min。(3) 5%&酸溶液(58c水浴)中15min。(4)自來水漂洗。(5) 1%亞硫酸氫鈉溶液中30so(6)自來水沖洗15s。(7)蒸鐳水I、H、田、IV漂洗各1mi