基因工程第一章核酸制備

1、基因工程第一章核酸制備核酸：遺傳信息的儲存物質(zhì)脫氧核糖核酸：deoxyribonucleic acid, DNA核糖核酸：ribonucleic acid, RNA區(qū)別：第一節(jié) 天然DNA的制備（Preparation of DNA）一、DNA的組成與結(jié)構(gòu)（ Composition and Structure of DNA）:A phosphate group linked by a phosphodiester bond to a pentose (a five-carbon sugar molecule)that in turn is linked to a nitrogen- and c

2、arbon-containing ring structure commonly referred to as a “base”.BasePentosePhosphate GroupNucleotide主要堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：DNADNA解鏈溫度（Tm，melting point）DNA分子雜交(Hybridization of DNA strands from different sources)環(huán)狀DNA（Circular DNA）超螺旋DNA（supercoiled DNA ，SC-DNA）；共價閉合環(huán)狀DNA（Covalently closed circular DNA，cccDNA

3、）；開環(huán)DNA（open circle DNA，oc-DNA）；線形DNA（linear DNA，L-DNA）二、天然DNA的提?。≒urification of DNA）(一)生物材料的準(zhǔn)備（Preparation of Material）：1.DNA的保存：1.1.70%的乙醇（ Ethanol ）溶液（Tris-Cl 10 mmol/L pH 8.0， EDTA 1 mmol/L ）1.3.低溫2.大腸桿菌（E. coli）常見抗生素（Antibiotics）的使用：2.1 氨芐青霉素（ampicillin，Ap）：抑制細菌細胞壁肽聚糖的合成，50150 g/mL（水溶液）；2.2 鏈霉

4、素（streptomycin，Sm）：與細菌核糖體30S亞單位結(jié)合，抑制細菌蛋白質(zhì)(酶)的合成,使細菌不能正常生長或者代謝而死亡， 2550 g/mL（水溶液）；2.3 四環(huán)素（tetracycline，Tc）：與細菌核蛋白體的30S亞單位結(jié)合，干擾核糖體上密碼子與反密碼子的相互作用，從而阻止氨?；鵷RNA同核蛋白體結(jié)合， 5 mg/mL（乙醇溶液）；2.4 氯霉素（chloramphenicol，Cm）：與細菌核蛋白體50S亞基結(jié)合，抑制肽?；D(zhuǎn)移酶，從而抑制蛋白質(zhì)合成， 20 g/mL（乙醇溶液）；2.5 卡那霉素（knamycin，Km）：與細菌核蛋白體蛋白基結(jié)合，并與較小的RNA亞基編

5、譯區(qū)的特定堿基結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)合成， 2550 g/mL（水溶液）；(二)裂解細胞（Cell lysis）：1.化學(xué)方法：1.1 CTAB裂解法：CTAB（cetyltriethy ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨），陽離子去污劑，與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液（ 0.7 mol/L NaCl）中穩(wěn)定，在低鹽溶液（ 0.3 mol/L NaCl ）中沉淀。1.2 SDS裂解法：SDS（sodium dodecyl sulfate，十二烷基磺酸鈉），陰離子去垢劑，蛋白質(zhì)變性劑，有效沉淀多糖，與K離子形成絮狀沉淀，廣泛用于質(zhì)粒（plasmid）DNA的提取，蛋白質(zhì)的分離純化

6、。2.酶裂解方法：2.2 蛋白酶K（Proteinase K）裂解法：用于水解蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合緊密的組蛋白（Histone），廣泛用于動物組織基因組DNA的提取，通常與SDS，Tris-Cl及EDTA共同裂解細胞。2.3溶菌酶（lysozyme）裂解法：通常用于細菌裂解，提取質(zhì)粒DNA，其原理是破壞細菌細胞壁的肽聚糖支架，通過低滲透壓使細胞脹裂，引起細胞裂解。作用條件溫和，pH 6.07.0，室溫25 。（三）DNA的分離和抽提1.酚-氯仿抽提法：苯酚（ phenol ）-氯仿（ chloroform ）-異戊醇（isoamyl alcohol ）比例：25:24:1，苯酚：蛋白質(zhì)變

7、性劑；氯仿：蛋白質(zhì)變性劑；并使變性的蛋白質(zhì)從水相層分離；異戊醇：防止產(chǎn)生泡沫。2. 氯化銫密度梯度離心法(CsCl density gradient centrifugation)；3. 固相萃取法(solid phase extraction, SPE)；離心技術(shù)在基因工程中的應(yīng)用（Application of Centrifugation techniques ）（四）DNA的純化（purification）和濃縮（condense）1. DNA的純化：1.1 Rnase處理，去除RNA；1.2 離子交換層析法；1.3 氯化銫密度梯度離心法；1.4 瓊脂糖電泳洗脫法；瓊脂糖電泳（Agaro

8、se gel electrophoresis）1.安放好制膠模具（梳子和膠槽）2.瓊脂糖凝膠澆灌并冷凝3.移走梳子，暴露出上樣孔4.瓊脂糖膠放置在電泳緩沖液中5. 上樣，通電流，直至DNA遷移到適當(dāng)位置6. 在紫外光（UV）下觀察DNA電泳情況DNA電泳完畢后的瓊脂糖凝膠在紫外光（UV）下觀察DNA電泳情況不同凝膠的DNA電泳情況瓊脂糖凝膠（agarose）聚丙烯酰胺凝膠凝膠（PAGE）電泳儀（電源和電泳槽）離子交換柱層析純化DNA2. DNA的濃縮：2.1 乙醇（Ethanol）沉淀法；2.2 正丁醇（ butyl alcohol ）抽提法；2.3聚乙二醇（PEG6000）濃縮法；第三節(jié)第三

9、節(jié) 人工合成核酸片段人工合成核酸片段二、核酸的酶法合成二、核酸的酶法合成PCR反應(yīng)（反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction, 聚合酶鏈?zhǔn)椒淳酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)）：應(yīng)）： 模仿細胞內(nèi)發(fā)生的模仿細胞內(nèi)發(fā)生的DNA復(fù)制過程，在體外有酶催復(fù)制過程，在體外有酶催化合成特異性化合成特異性DNA片段。片段。PCR技術(shù)簡史技術(shù)簡史1971年，年，Khorana提出：經(jīng)過提出：經(jīng)過DNA變變性，與合適引物雜交，用性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因?；?。但由于測序和引物合成的困難，以及但由于測序和引物合成的困難，以

10、及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想的設(shè)想被人們遺忘了被人們遺忘了PCR技術(shù)簡史技術(shù)簡史1985年，美國年，美國PE-Cetus公司的公司的Mullis等人發(fā)明了等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細胞內(nèi)的基本原理是在試管中模擬細胞內(nèi)的DNA復(fù)制復(fù)制最初采用最初采用E-coli DNA聚合酶進行聚合酶進行PCR，由于該酶，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯耐熱耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進行能高效率

11、的進行，隨后，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺公司推出了第一臺PCR自動化熱自動化熱循環(huán)儀循環(huán)儀1993年，年，Mullis等因此項技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎等因此項技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎1. PCR的基本原理的基本原理(Mechanism of PCR )類似于類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。的體內(nèi)復(fù)制。其原理是通過高溫變性模板、引物與模板退火、其原理是通過高溫變性模板、引物與模板退火、引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個循環(huán)，通過多引物沿模板延伸三步反應(yīng)組成一個循環(huán)，通過多次循環(huán)反應(yīng)，使目的次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以幾何級數(shù)倍增。得以幾何級數(shù)倍增。5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycl

12、e 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的的含量可以擴大含量可以擴大100萬倍以上。萬倍以上。（3 3）PCR的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟變性變性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5CPCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件：反應(yīng)條件： 10X緩沖液（緩沖液（Buffer）10 L4種種dNTP混合物混合物 各各200umol/L引物（引物（Primer） 各各10100pmol模板模板DNA （Template） 0.12gTaq

13、 DNA聚合酶聚合酶 0.5 2.5UMg2+ 1.5mmol/LPCR反應(yīng)1 12 23 34 45 52222555572729494時間（時間（minmin）溫度溫度（）PCR反應(yīng)適溫延伸適溫延伸3 3高溫變性高溫變性1 1低溫退火低溫退火2 2重復(fù)重復(fù)1313步步25302530輪輪目的目的DNADNA片段片段擴增擴增100100萬倍以上萬倍以上DNADNA雙螺旋雙螺旋DNADNA單鏈單鏈與引物復(fù)性與引物復(fù)性DNADNA變性變性形成形成2 2條單鏈條單鏈子鏈延伸子鏈延伸DNADNA加倍加倍37-60 90-9570-75 PCR 擴增No. ofNo. Amplicon CyclesC

14、opies of Target12243841653266420220=1,048,57630230=1.07X1071 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 Amplicon PCR反應(yīng)特點反應(yīng)特點靈敏度高靈敏度高皮克皮克(pg=10-12)量級擴增到微克量級擴增到微克(ug=10-6)水平水平能從能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞萬個細胞中檢出一個靶細胞病毒檢測

15、的靈敏度可達病毒檢測的靈敏度可達3個個RFU（空斑形成單位）（空斑形成單位） 細菌檢測的最小檢出率為細菌檢測的最小檢出率為3個細菌個細菌簡便、快速簡便、快速一次性加好反應(yīng)液，一次性加好反應(yīng)液，24 小時完成擴增小時完成擴增擴增產(chǎn)物一般用電泳分析擴增產(chǎn)物一般用電泳分析對標(biāo)本的純度要求低對標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提DNA（1）Taq DNA聚合酶聚合酶（2） Pwo DNA 聚合酶聚合酶（3）Tth DNA 聚合酶聚合酶（4）C.therm 聚合酶聚合酶4.2.1 耐熱性耐熱性DNA聚合酶聚合酶（1）Ta

16、q DNA聚合酶聚合酶1986年從一種年從一種75熱泉中的細菌熱泉中的細菌 (Thermus aquaricus)中分離純化出中分離純化出來的。來的。 95kDa，單分子酶，單分子酶， 75 活性最強?；钚宰顝?。具有具有 5-3 合成活性和合成活性和 5-3 外切活性外切活性 , 無無 3-5 外切活性。外切活性。95 時半衰期為時半衰期為 40 分鐘。分鐘。啟動啟動 PCR 反應(yīng)的能力很強，聚合速度快，在反應(yīng)的能力很強，聚合速度快，在 72 的聚合速度為每的聚合速度為每秒秒 30-100 堿基。堿基。由于沒有由于沒有 3-5 外切活性，在擴增過程中有外切活性，在擴增過程中有 8.9-11x1

17、0 -5 的錯配率。的錯配率。（2） Pwo DNA 聚合酶聚合酶來自來自 古細菌古細菌Pyrococcus woesei，由德國寶靈曼公司開發(fā)由德國寶靈曼公司開發(fā)（BM），）， 90kDa ，100 的半衰期大于的半衰期大于 2 小時，小時，具有具有 3-5 外切活性，出錯率低，外切活性，出錯率低，使用較多的的且具有高保真度的使用較多的的且具有高保真度的 PCR 酶。酶。 （3）Tth DNA 聚合酶聚合酶來自嗜熱熱細菌（來自嗜熱熱細菌（Thermus thermophilus） ，由，由 Promega 公司開發(fā)成商品。公司開發(fā)成商品。 94kDa ， 95 的半衰期為的半衰期為 20 分

18、鐘。分鐘。 在在 Mg2+ 存在條件下以存在條件下以 DNA 為模板合成為模板合成 DNA ，而在，而在 Mn2+ 存在下可以存在下可以 RNA 為模板合成為模板合成 cDNA 。 因此可在高溫下做因此可在高溫下做 RT-PCR （反轉(zhuǎn)錄（反轉(zhuǎn)錄PCR）反應(yīng)，）反應(yīng)， 避避免免 RNA 反轉(zhuǎn)錄過程中形成的二級結(jié)構(gòu)。反轉(zhuǎn)錄過程中形成的二級結(jié)構(gòu)。 （4）C.therm 聚合酶聚合酶 來自來自Carboxydothermus hudrogenoformans，以以Mg2+為輔助因子的逆轉(zhuǎn)錄酶，為輔助因子的逆轉(zhuǎn)錄酶，最適溫度適最適溫度適60-70 ， 同時也具有同時也具有3-5外切酶校對活性，外切酶校

19、對活性，用于用于RT-PCR 反應(yīng)。反應(yīng)。4.2.2 靶靶DNA/模板模板其兩端其兩端20-30bp序列用以一對引物的設(shè)計。序列用以一對引物的設(shè)計。避免引物內(nèi)部或引物之間存在互補序列（避免引物內(nèi)部或引物之間存在互補序列（3個堿基個堿基），），減少引物二聚體的減少引物二聚體的形成以及引物內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的形成。形成以及引物內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)的形成。4.2.3 PCR引物引物引物用核酸序列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性，引物用核酸序列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計并具有特異性，4.2.4 PCR原材料原材料dNTP 脫氧核苷三磷酸脫氧核苷三磷酸4.2.5 PCR緩沖液緩沖液成分：成分：10 mmol/L Tris-HCl (pH

20、8.8室溫下室溫下)，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2。Mg2+：是是DNA聚合酶的激活劑，聚合酶的激活劑，0.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。反應(yīng)體系。Mg2+濃度過低會使?jié)舛冗^低會使Taq酶活性喪失、酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特異性過高影響反應(yīng)特異性4.2.6 PCR循環(huán)的溫度和時間循環(huán)的溫度和時間溫度溫度:90-95 模板變性，模板變性，復(fù)性（復(fù)性（37-60 ），），；70-75 引物在模板上延伸引物在模板上延伸反應(yīng)時間反應(yīng)時間變性變性30 s，如果模板，如果模板 G+C 含量高，變性時間可適當(dāng)延長。含量高，變性

21、時間可適當(dāng)延長。復(fù)性復(fù)性30 s。延伸延伸1kb 1 min充足，由擴增產(chǎn)物的大小決定。充足，由擴增產(chǎn)物的大小決定。 循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù) 2535 次。次。25 L PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系：模板模板DNA 1 L （10100ng）引物引物1 1 L （10 mol/L）引物引物2 1 L （10 mol/L）dNTP（ 10 mmol/L ） 1 L （20 mmol/L）10 PCR反應(yīng)的緩沖液反應(yīng)的緩沖液 2.5 L Taq酶酶 0.5 L （ 1U/l）ddH2O 補至補至25 L 4.3 PCR擴增擴增DNA片段的方法片段的方法常規(guī)程序常規(guī)程序PCR反應(yīng)的程序：反應(yīng)的程序： 溫度（溫

22、度（） 時間（分鐘）時間（分鐘）(1) 95 3-5 (2) 95 0.5(3) 60 0.5(4) 72 1(5) 72 102530個循環(huán)PCR反應(yīng)的操作注意事項：反應(yīng)的操作注意事項：1）加樣操作必須在冰上進行；）加樣操作必須在冰上進行；2）加樣的順序：）加樣的順序：（1）從大到?。唬拇蟮叫?；（2）先加藥品再酶：）先加藥品再酶：PCR反應(yīng)結(jié)果異常及解決辦法：反應(yīng)結(jié)果異常及解決辦法：1）無帶；）無帶；2）雜帶多；）雜帶多；3）DNA降解。降解。 PCR中應(yīng)注意的事項中應(yīng)注意的事項 防止污染防止污染試劑小量分裝試劑小量分裝吸頭及吸頭及EP管一次性使用管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作 設(shè)立對照：設(shè)立對照：陽性對照：陽性對照： 陽性模板陽性模板陰性對照：陰性對照： 陰性模板陰性模板試劑對照：試劑對照： 除模板外的所有組分除模板外