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1、PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系:10X擴(kuò)增緩沖液4種dNTP混合物引物模板DNATaqDNA聚合酶Mg2+加雙或三蒸水至10ul各200umol/L各10100Pmol0.12ug2.5u1.5mmol/L100ulPCR反應(yīng)五要素:參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物:引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核甘酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則:引物長(zhǎng)度:15-30bp,常用為20bp左右。引物擴(kuò)增跨

2、度:以200-500bp為宜,特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴(kuò)增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布,避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu),避免兩條引物間互補(bǔ),特別是3'端的互補(bǔ),否則會(huì)形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。引物3'端的堿基,特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì),以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn),被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn),這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無明

3、顯同源性。引物量:每條引物的濃度0.1lumol或10100Pmol,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好,引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增,且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng),一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2。5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)),濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性,使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后,以1MNaOH或1MTri

4、s。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到7.07.5,小量分裝,-20C冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中,dNTP應(yīng)為50200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低),就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度降低。模板便已基因)核酸模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一,傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本。SDS的主要功能是:溶解細(xì)胞膜上的脂類與蛋白質(zhì),因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜,并解離細(xì)胞中的核蛋白,SDS還能與蛋白

5、質(zhì)結(jié)合而沉淀;蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì),特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,再用有機(jī)溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測(cè)標(biāo)本,可采用快速簡(jiǎn)便的方法溶解細(xì)胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離,直接用于PCR擴(kuò)增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。Mg2+濃度Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響,在一般的PCR反應(yīng)中,各種dNTP濃度為200umol/L時(shí),Mg2+濃度為1.52.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高,反應(yīng)特異性降低,出現(xiàn)非特異擴(kuò)增,濃度過低會(huì)降低T

6、aqDNA聚合酶的活性,使反應(yīng)產(chǎn)物減少。PCR反應(yīng)條件的選擇PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時(shí)間的設(shè)置:基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法,雙鏈DNA在9095c變性,再迅速冷卻至4060C,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至7075C,在TaqDNA聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。對(duì)于較短靶基因(長(zhǎng)度為100300bp時(shí))可采用二溫度點(diǎn)法,除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94變性,65左右退火與延伸(此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性)。變性溫度與時(shí)間:變性溫度低,解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。

7、一般情況下,93C94Clmin足以使模板DNA變性,若低于93c則需延長(zhǎng)時(shí)間,但溫度不能過高,因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性,就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間:退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40c60C,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多,引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。退火溫度與時(shí)間,取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長(zhǎng)度。對(duì)于20個(gè)核甘酸,G+C含量約50%的引物,55為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度

8、:Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T)復(fù)性溫度=Tm值-(510C)在Tm值允許范圍內(nèi),選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為3060sec,足以使引物與模板之間完全結(jié)合。延伸溫度與時(shí)間:TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性:7080c150核甘酸/S順分子70c60核甘酸/S順分子55C24核甘酸/S順分子高于90時(shí),DNA合成幾乎不能進(jìn)行。PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在7075c之間,常用溫度為72C,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定,一般1Kb以內(nèi)的DNA片段,延伸時(shí)間1min是足夠的。34kb的靶序歹需34min;擴(kuò)增10K

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