小鼠骨髓間充質干細胞的分離_培養(yǎng)_純化及鑒定

1、o f I n f l a m m a t i o n a n d T i s s u e D a m a g e i n A c u t e a n d C h r o n i c R e l a p -s i n g E A E J .M a g n e t i c R e s o n a n c e i n M e d i c i n e ,2003,50:309.10B B r o c h e t ,M S A.D e l o i r e ,T.T o u i l ,e t a l .E a r l y m a c r o p h a g e M R I o f i n f l a m

2、 m a t o r y l e s i o n s p r e d i c t s l e s i o n s e v e r i t y a n d d i s e a s e d e -v e l o p m e n t i n r e l a p s i n g E A E J .N e u r o I m a g e ,2006,32:266.11C h i n e t C L ,P a i M ,B o u s q u e t P F ,e t a l .D i s t i n c t s p a t i o t e m po r a l p a t t e r n o f C N

3、 S l e s i o n s r e v e a l e d b y U S P I O -e n h a n c e d M R I i n MO G -i n d u c e d E A E r a t s i m p l i c a t e s t h e i n v o l v e m e n t o f s pi n o -o l i v o c e r e b e l l a r p a t h w a y s J .J o u r n a l o f N e u r o i m m u n o l o g y ,2009,211:49.12于國平,朱克,梁顯胤,等.實驗性自身

4、免疫性腦脊髓炎的小膠質細胞和星形膠質細胞反應J .中華神經科雜志,1999,32(2:86.(收稿日期:2010-12-24基金項目:吉林省科技廳資助課題(200505193*通訊作者文章編號:1007-4287(201201-0011-03小鼠骨髓間充質干細胞的分離、培養(yǎng)、純化及鑒定趙繼學1a ,王廣義1b ,張海玉1a *,伏鑫2(吉林大學1.第一醫(yī)院a .兒外科;b .普外科,吉林長春130021;2.中日聯(lián)誼醫(yī)院摘要:目的探討分離、培養(yǎng)、純化和鑒定小鼠骨髓間充質干細胞(m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s ,M S C s 方法,觀察M S C

5、 s 體外生長特征。方法取小鼠脛骨和股骨,取出骨髓細胞,用1.073g /m l 的P e r c o l l 分離液梯度離心,培養(yǎng)皿培養(yǎng)、換液除去非貼壁細胞,獲得M S C s ,通過傳代對M S C s 進行純化和擴增培養(yǎng)。進行形態(tài)學觀察,測定生長曲線,用流式細胞儀檢測P 3代M S C s 細胞周期及表面抗原。結果新分離的M S C s 呈小圓形,形態(tài)規(guī)整。培養(yǎng)傳代后,細胞大小均勻,形態(tài)較一致,多為梭形。P 1、P 2、P 3代M S C s 生長曲線均呈S 型。P 3代M S C s 75.27%的細胞處于G 0-G 1期。P 3代M S C s C D 44表達陽性,表達率為88.7

6、1%,C D 34表達陰性。結論利用密度梯度離心法聯(lián)合貼壁培養(yǎng)法分離純化骨髓M S C s ,在含15%F B S 的D M E M -L G 培養(yǎng)基中培養(yǎng)M S C s ,可獲得穩(wěn)定生長的昆明小鼠M S C s 。培養(yǎng)的M S C s 細胞系性狀穩(wěn)定,表型穩(wěn)定均一,適于做進一步研究。關鍵詞:骨髓間充質干細胞;細胞培養(yǎng);鑒定;小鼠中圖分類號:Q 78文獻標識碼:AI s o l a t i o n ,c u l t i v a t i o n ,p u r i f i c a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f m i c e b o n

7、 e m a r r o w m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s i n v i t r o Z HA O J i -x u e ,WA N G G u a n g -y i ,Z HA N G H a i -y u ,e t a l .(T h e F i r s t H o s p i t a l o f J i l i n U n i v e r s i t y ,C h a n gc h u n 130021,C h i n a A b s t r a c t :O b j e c t i v e T o e x p l o r e a n

8、e w m e t h od f o r t he i s o l a t i o n ,c u l t i v a t o n ,p u r if i c a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f M S C s a n d o b s e r v e t h e b i o l og i c a l f e a t u r e s o f m i c e M S C s i n v i t r o .M e th o d s B o n e m a r r o w w a s e x t r a c t e d f r o m t h

9、e ti b i a a n d t h i g h b o n e o f m i c e .T h e m a r r o w l i q u i d w e r e i s o l a t e d w i t h 1.073g /m l o e r c o l l .M S C s w e r e o b t a i n e d b y r e m o v i n g t h e n o n -a d h e r e n t c e l l s .T h e n t h e M S C s w e r e p u r i f i e d a n d e x p a n d e d t h

10、 r o u g h p a s s a g e i n t i m e .T h e g r o w t h c u r v e w a s d r a w n a n d t h e m o r p h o l o g y w a s o b s e r v e d .C e l l c y c l e a n d t h e a n t i g e n e x p r e s s i o n o f P 3M S C s w e r e m e a s u r e d w i t h F A C S .R e s u l t s T h e M S C s e x h i b i t e

11、 d a s m a l l r o u n d s h a p e a f t e r f r e s h s e p a r a t i o n .A f t e r c u l t i v a t e d a n d p a s s a g e d ,t h e M S C s w e r e h o m o g e -n e n o u s l y f u s i f o r m s h a p e d .T h e g r o w t h c u r v e s o f P 1,P 2a n d P 3M S C s w e r e “S ”s h a p e .T h e c e

12、l l s o f G 0-G 1s t a g e a c c o u n t f o r 75.27%.T h e e x p r e s s i o n o f C D 44w a s p o s i t i v e ,w h i l e t h e e x p r e s s i o n o f C D 34w a s n e g a t i v e .C o n c l u s i o n T h e m e t h -o d o f d e n s i t y g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n c o m b i n e d w

13、 i t h a d h e r e n t c u l t u r e c o u l d i s o l a t e M S C s f r o m b o n e m a r r o w s i m p l e l y .D M E M -L G m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 15%f e t a l b o v i n e s e r u m i s s u i t a b l e f o r t h e c u l t u r e o f M S C s .T h e c u l t u r e d M S C s l i n

14、 e a ge i s s t a b l e a n d c a n b e u s e df o r f u r t h e r r e s e a r c h .K e yw o r d s :B o n e m a r r o w m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s ;C e l l c u l t u r e ;I d e n t i f i c a t i o n ;M i c e (C h i n J L a b D i a gn ,2012,16:0011骨髓間充質干細胞(M S C s 是骨髓中存在的除造血干細胞(H S C s 外

15、的另一類干細胞。由于其來源充足,取材相對方便,易于體外擴增,以及免疫原性低等優(yōu)勢,已經在組織工程和移植領域得到了廣11中國實驗診斷學2012年1月第16卷第1期泛的關注。本實驗旨在建立一種分離、培養(yǎng)、純化及鑒定M S C s的方法,并對其生物學特性進行研究,為后續(xù)利用骨髓M S C s治療肝臟疾病的研究提供穩(wěn)定的干細胞模型。1材料與方法1.1材料與試劑清潔級昆明小鼠,雌雄兼用,體重25±2g,購自吉林大學實驗動物中心合格證號:S C X K(吉2003 -0001;D M E M培養(yǎng)基(美國G i b c o B R L公司;胎牛血清(美國H y c l o n e公司;淋巴細胞分離

16、液(上海恒信公司,0.25%胰蛋白酶(華美公司,兔抗鼠C D34、C D44熒光抗體(美國P HA R M I N G E N公司。1.2方法2培養(yǎng)箱培養(yǎng),換液,將M S C s不斷純化。當細胞生長融合達80%-90%時,用11的0.25%胰蛋白酶和0.02%E D T A消化分散細胞,在顯微鏡下控制消化時間,計數(shù)細胞,以13密度擴增培養(yǎng)。此時標記為P1代,以后每3-4d換液1次;當細胞生長融合達80%-90%時,繼續(xù)以13的密度傳代擴增培養(yǎng),傳代培養(yǎng)并記為P2代,余類推。倒置相差顯微鏡逐日觀察細胞形態(tài)和生長情況。2結果2.1昆明小鼠骨髓M S C s的基本形態(tài)新分離的M S C s呈小圓形,

17、形態(tài)規(guī)整。M S C s 傳代培養(yǎng)的細胞大小均勻,形態(tài)較一致,多為梭形,此時細胞不再以成克隆的方式生長,而是散在分布生長。M S C s連續(xù)傳3代,細胞形態(tài)無明顯變化,無衰老征象,傳代周期6-7d。表明M S C s得到了進一步的純化及擴增。P3代后的M S C s能較好的用于后期實驗。2.2骨髓M S C s生長曲線測定由MT T法測定小鼠P1、P2、P3代各個時間點骨髓M S C s活率,繪制的生長曲線呈S型(見圖1,由圖可見,M S C s在接種后第1-2d為潛伏期,隨后便快速增殖,進入對數(shù)生長期,持續(xù)2-3d,此后細胞增長逐漸減緩,進入平臺期。P3代的M S C s能較好的用于后期實驗

18、。2.3骨髓M S C s細胞周期分析結果取生長良好的三代細胞,采用流式細胞儀直接熒光法,檢測細胞周期,記錄陽性細胞百分率,見圖2。由圖可見,75.27%的細胞處于G0-G1期,表明M S C s具有強大的分化增殖能力。2.4骨髓M S C s表面抗原的表達流式細胞儀檢測顯示P3代小鼠骨髓M S C s強表達C D44,表達率為88.71%,基本不表達造血細胞表面標志C D34。(見圖3。3討論骨髓M S C s是具有多向分化潛能和高度自我更新能力的組織干細胞。研究證實骨髓M S C s不僅可以分化為與其組織來源一致的細胞,而且具有跨系或跨胚層分化為不同組織來源細胞的潛能。但骨髓中M S C

19、s的數(shù)量極少,僅占0.001%-0.01%1,要利用M S C s就必須對其進行體外分離、擴增?，F(xiàn)體外分離得到均一的骨髓M S C s的方法逐漸21C h i nJL a bD i a g n,J a n u a r y,2012,V o l16,N o.1 圖1M S C s生長曲線圖2M S C s細胞周期圖3M S C s表面抗原的表達A:C D34,B:C D44成熟,而通過體外擴增獲得足夠數(shù)量的間充質干細胞己實現(xiàn)。分離骨髓M S C s的方法主要有四種:貼壁篩選法2、密度梯度離心法3、免疫磁珠分離法4、流式分選法5等。后兩種方法是目前獲得M S C s純度最高的方法,然而該方法操作復

20、雜、費用及設備要求較高。在分離中對細胞活性有一定影響。我們使用密度梯度離心和貼壁篩選相結合,利用P e r c o l l(1.073g/m l分離液將大部分造血細胞與單個核細胞分離開來,并經過體外貼壁培養(yǎng)一段時間,通過換液去除懸浮生長的造血細胞,獲得較理想的骨髓M S C s。我們用生長曲線來描述骨髓M S C s的生長繁殖能力,骨髓M S C s生長曲線分潛伏適應期、對數(shù)生長期和平臺期。發(fā)現(xiàn)昆明小鼠P1、P2、P3代骨髓M S C s的生長曲線均呈S型。骨髓M S C s的生長性狀穩(wěn)定,P1、P2、P3代細胞的形態(tài)、生長曲線無明顯差別,潛伏適應期1-2d,對數(shù)生長期2-3d,傳代周期約6-

21、7d。M S C s具有無限增殖的能力,但前提是必須具備M S C s體外生長的最佳環(huán)境。目前公認M S C s的培養(yǎng)必須用F B S做支持6,合適的血清濃度對細胞的生長具有關鍵性的作用。血清中含有多種營養(yǎng)成分,對細胞的生長起著重要作用,但培養(yǎng)基中血清的濃度并非越高越好。張怡等7實驗證實,血清濃度<10%不利于細胞生長;10%-15%時,細胞增殖旺盛,形態(tài)均一;當血清濃度>15%時,易引起骨髓M S C s分化而影響增殖。本實驗采用15%F B S的D M E M-L G培養(yǎng)基培養(yǎng)骨髓M S C s,細胞增值速度快,表形均一,得到了理想的傳代細胞。M S C s的表型不均一,分別具

22、有間充質細胞、上皮細胞和內皮細胞的特點。所以過去一直沒有發(fā)現(xiàn)M S C s特異性的表面標志物。一般認為,M S C s對S H2、S H3、C D29、C D44、C D77、C D90、C D106、C D120a、C D124等都呈陽性反應,對C D1a、C D31、C D34、C D14、C D45、C D56等成陰性反應8,9。大多數(shù)實驗室通過M S C s不表達C D14、C D34及C D45,而表達C D44、C D90、C D106等標志,對M S C s進行初步鑒定。目前尚未發(fā)現(xiàn)M S C s特異性標記分子,可聯(lián)合應用多種抗體幫助分離鑒定M S C s。本實驗中利用密度梯度離

23、心法結合M S C s貼壁生長的特性,從成年昆明小鼠骨髓中分離、擴增培養(yǎng)獲得形態(tài)均一的細胞集落。流式細胞儀檢測結果提示75.27%的細胞處于G0-G1期,表明M S C s具有強大的分化增殖能力。分離培養(yǎng)的骨髓M S C s強表達C D44,而造血譜系標記C D34基本不表達,說明所分離的細胞是有別于骨髓H S C s的M S C s,培養(yǎng)的P3代細胞均一性較好。參考文獻:1P h i n n e yD G,K o p e nG,I s a a c s o nR L,e ta l.P l a s t i ca d h e r e n ts t r o-m a lc e l l sf r o m

24、t h eb o n em a r r o wo fc o m m o n l yu s e ds t r a i n so fi n-b r e dm ic e:v a r i a t i o n si ny i e l d,g r o w t h,a n dd i f fe r e n t i o nJ.JC e l lB i o c h e m,1999,72(4:570.2F r i e d e n s t e i nA J,C h a i l a k h y a nR K,G e r a s i m o vU V.B o n em a r r o wo s t e o g e n i

25、 cs t e mc e l l s:i nV i t r oc u l t i v a t i o na n dt r a n s p l a n t a t i o ni nd i f f u s i o nc h a m be r sJ.C e l lT i s s u eK i n e t,1987,20(3:263.3張本斯,王凡,鄧力,等.大鼠骨髓間充質干細胞的分離純化與初步鑒定J.中國組織化學與細胞化學雜志,2003,12:161. 4E n c i n aN R,B i l l o t t eWG,H o f m a n nM C.I m m u n o m a g n e t i ci s o l a-t i o no fo s t e o p r o g e n i t o r sf r o mh u m a nb o n em a r r o ws t r o m aJ.L a bI n v e s t,1999,79(4:449