2015版藥典生物樣品定量分析方法驗證指導原則(草案)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上1 生物樣品定量分析方法驗證指導原則（草案） 1 1. 范圍 2 準確測定生物基質(zhì)（如全血、血清、血漿、尿）中的藥物濃度，對于藥物和3 制劑研發(fā)非常重要。這些數(shù)據(jù)可被用于支持藥品的安全性和有效性，或根據(jù)毒動4 學、藥動學和生物等效性試驗的結(jié)果做出關(guān)鍵性決定。因此，必須完整地驗證和5 記錄應用的生物分析方法，以獲得可靠的結(jié)果。 6 本指導原則提供生物分析方法驗證的要求，也涉及非臨床或臨床試驗樣品實7 際分析的基本要求，以及何時可以使用部分驗證或交叉驗證，來替代完整驗證。 8 生物樣品定量分析方法驗證和試驗樣品分析應符合本指導原則的技術(shù)要求。9 應該在相應的生物樣品分析中

2、遵守GLP原則或GCP原則。10 2. 生物分析方法驗證 11 2.1 分析方法的完整驗證 12 分析方法驗證的主要目的是，證明特定方法對于測定在某種生物基質(zhì)中分析13 物濃度的可靠性。此外，方法驗證應采用與試驗樣品相同的抗凝劑。一般應對每14 個物種和每種基質(zhì)進行完整驗證。當難于獲得相同的基質(zhì)時，可以采用適當基質(zhì)15 替代，但要說明理由。 16 一個生物分析方法的主要特征包括：選擇性、定量下限、響應函數(shù)和校正范17 圍（標準曲線性能）、準確度、精密度、基質(zhì)效應、分析物在生物基質(zhì)以及溶液18 中儲存和處理全過程中的穩(wěn)定性。 19 有時可能需要測定多個分析物。這可能涉及兩種不同的藥物，也可能涉及

3、一20 個母體藥物及其代謝物，或一個藥物的對映體或異構(gòu)體。在這些情況下，驗證和21 分析的原則適用于所有涉及的分析物。 22 對照標準物質(zhì) 23 在方法驗證中，含有分析物對照標準物質(zhì)的溶液將被加入到空白生物基質(zhì)24 中。此外，色譜方法通常使用適當?shù)膬?nèi)標。 25 應該從可追溯的來源獲得對照標準物質(zhì)。應該科學論證對照標準物質(zhì)的適用26 性。分析證書應該確認對照標準物質(zhì)的純度，并提供儲存條件、失效日期和批號。27 對于內(nèi)標，只要能證明其適用性即可，例如顯示該物質(zhì)本身或其相關(guān)的任何雜質(zhì)28 不產(chǎn)生干擾。 29 當在生物分析方法中使用質(zhì)譜檢測時，推薦盡可能使用穩(wěn)定同位素標記的內(nèi)30 標。它們必須具有足夠

4、高的同位素純度，并且不發(fā)生同位素交換反應，以避免結(jié)31 果的偏差。 322 2.1.1 選擇性 33 該分析方法應該能夠區(qū)分目標分析物和內(nèi)標與基質(zhì)的內(nèi)源性組分或樣品中34 其他組分。應該使用至少6個來源的適宜的空白基質(zhì)來證明選擇性，它們被分別35 分析并評價干擾。當干擾組分的響應低于分析物定量下限響應的20%，并低于內(nèi)36 標響應的5%時，通常即可以接受。37 應該考察藥物代謝物經(jīng)樣品預處理生成的分解產(chǎn)物以及可能的同服藥物引38 起干擾的程度。應該考慮通常用于受試者群體試驗的同服藥物。在適當情況下，39 也應該評價代謝物在分析過程中回復轉(zhuǎn)化為母體分析物的可能性。 40 2.1.2 殘留 41

5、應該在方法建立中考察殘留并使之最小。殘留可能不影響準確度和精密度。42 應通過在注射高濃度樣品或校正標樣后，注射空白樣品來估計殘留。高濃度樣品43 之后在空白樣品中的殘留應不超過定量下限的20%，并且不超過內(nèi)標的5%。應44 考慮特殊措施，在方法驗證時檢驗并在試驗樣品分析時應用這些措施，以確保不45 影響準確度和精密度。這可能包括在高濃度樣品后注射空白樣品，然后分析下一46 個試驗樣品。 47 2.1.3 定量下限 48 定量下限是能夠被可靠定量的樣品中分析物的最低濃度，具有可接受的準確49 度和精密度。定量下限是標準曲線的最低點，應適用于預期的濃度和試驗目的。 50 2.1.4 標準曲線 5

6、1 應該在指定的濃度范圍內(nèi)評價儀器對分析物的響應，獲得標準曲線。通過加52 入已知濃度的分析物（和內(nèi)標）到空白基質(zhì)中，制備各濃度的校正標樣，其基質(zhì)53 應該與目標試驗樣品基質(zhì)相同。方法驗證中研究的每種分析物和每一分析批，都54 應該有一條標準曲線。 55 在進行分析方法驗證之前，最好應該了解預期的濃度范圍。標準曲線范圍應56 該盡量覆蓋預期濃度范圍，由定量下限和定量上限（校正標樣的最高濃度）來決57 定。該范圍應該足夠描述分析物的藥動學。58 應該使用至少6個校正濃度水平，不包括空白樣品（不含分析物和內(nèi)標的處59 理過的基質(zhì)樣品）和零濃度樣品（含內(nèi)標的處理過的基質(zhì)）。每個校正標樣可以60 被重

7、復分析。 61 應該使用簡單且足夠描述儀器對分析物濃度響應的關(guān)系式?？瞻缀土銤舛葮?2 品結(jié)果不應參與計算標準曲線參數(shù)。 63 應該提交標準曲線參數(shù)，測定校正標樣后回算得出的濃度應一并提交。在方64 法驗證中，至少應該評價3條標準曲線。653 校正標樣回算的濃度一般應該在標示值的±15%以內(nèi)，定量下限處應該在66 ±20%內(nèi)。至少75%校正標樣，含最少6個有效濃度，應滿足上述標準。如果某67 個校正標樣結(jié)果不符合這些標準，應該拒絕這一標樣，不含這一標樣的標準曲線68 應被重新評價，包括回歸分析。 69 最好使用新鮮配制的樣品建立標準曲線，但如果有穩(wěn)定性數(shù)據(jù)支持，也可以70

8、使用預先配制并儲存的校正標樣。 71 2.1.5 準確度 72 分析方法的準確度描述該方法測得值與分析物標示濃度的接近程度，表示73 為：（測得值/真實值）× 100%。應采用加入已知量分析物的樣品來評估準確度，74 即質(zhì)控樣品。質(zhì)控樣品的配制應該與校正標樣分開進行，使用另行配制的儲備液。75 應該根據(jù)標準曲線分析質(zhì)控樣品，將獲得的濃度與標示濃度對比。準確度應76 報告為標示值的百分比。應通過單一分析批（批內(nèi)準確度）和不同分析批（批間77 準確度）獲得質(zhì)控樣品值來評價準確度。 78 為評價一個分析批中不同時間的任何趨勢，推薦以質(zhì)控樣品分析批來證明準79 確度，其樣品數(shù)不少于一個分析批

9、預期的樣品數(shù)。 80 批內(nèi)準確度 81 為了驗證批內(nèi)準確度，應取一個分析批的定量下限及低、中、高濃度質(zhì)控樣82 品，每個濃度至少用5個樣品。濃度水平覆蓋標準曲線范圍：定量下限，在不高83 于定量下限濃度3倍的低濃度質(zhì)控樣品，標準曲線范圍中部附近的中濃度質(zhì)控樣84 品，以及標準曲線范圍上限約75%處的高濃度質(zhì)控樣品。準確度均值一般應在質(zhì)85 控樣品標示值的±15%之內(nèi)，定量下限準確度應在標示值的±20%范圍內(nèi)。86 批間準確度 87 通過至少3個分析批，且至少兩天進行，每批用定量下限以及低、中、高濃88 度質(zhì)控樣品，每個濃度至少5個測定值來評價。準確度均值一般應在質(zhì)控樣品標8

10、9 示值的±15%范圍內(nèi)，對于定量下限，應在標示值的±20%范圍內(nèi)。90 報告的準確度和精密度的驗證數(shù)據(jù)應該包括所有獲得的測定結(jié)果，但是已經(jīng)91 記錄明顯失誤的情況除外。 92 2.1.6 精密度 93 分析方法的精密度描述分析物重復測定的接近程度，定義為測量值的相對標94 準差（變異系數(shù)）。應使用與證明準確度相同分析批樣品的結(jié)果，獲得在同一批95 內(nèi)和不同批間定量下限以及低、中、高濃度質(zhì)控樣品的精密度。96 批內(nèi)精密度 97 對于驗證批內(nèi)精密度，至少需要一個分析批的4個濃度，即定量下限以及低、98 中、高濃度，每個濃度至少5個樣品。對于質(zhì)控樣品，批內(nèi)變異系數(shù)一般不得超99

11、4 過15%，定量下限的變異系數(shù)不得超過20%。100 批間精密度 101 對于驗證批間精密度，至少需要3個分析批（至少2天）的定量下限以及低、102 中、高濃度，每個濃度至少5個樣品。對于質(zhì)控樣品，批間變異系數(shù)一般不得超103 過15%，定量下限的變異系數(shù)不得超過20%。104 2.1.7 稀釋可靠性 105 樣品稀釋不應影響準確度和精密度。應該通過向基質(zhì)中加入分析物至高于定106 量上限濃度，并用空白基質(zhì)稀釋該樣品（每個稀釋因子至少5個測定值），來證107 明稀釋的可靠性。準確度和精密度應在±15%之內(nèi)，稀釋的可靠性應該覆蓋試驗108 樣品所用的稀釋倍數(shù)。 109 可以通過部分方

12、法驗證來評價稀釋可靠性。如果能夠證明其他基質(zhì)不影響精110 密度和準確度，也可以接受其使用。 111 2.1.8 基質(zhì)效應 112 當采用質(zhì)譜方法時，應該考察基質(zhì)效應。使用至少6批來自不同供體的空白113 基質(zhì)，不應使用合并的基質(zhì)。如果基質(zhì)難以獲得，則使用少于6批基質(zhì)，但應該114 說明理由。 115 對于每批基質(zhì)，應該通過計算基質(zhì)存在下的峰面積（由空白基質(zhì)提取后加入116 分析物由空白基質(zhì)提取后加入分析物和內(nèi)標測得），與不含基質(zhì)的相應峰面積（分117 析物和內(nèi)標的純?nèi)芤海┍戎担嬎忝恳环治鑫锖蛢?nèi)標的基質(zhì)因子。進一步通過分118 析物的基質(zhì)因子除以內(nèi)標的基質(zhì)因子，計算經(jīng)內(nèi)標歸一化的基質(zhì)因子。從

13、6批基119 質(zhì)計算的內(nèi)標歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)不得大于15%。該測定應分別在低濃120 度和高濃度下進行。 121 如果不能適用上述方式，例如采用在線樣品預處理的情況，則應該通過分析122 至少6批基質(zhì)，分別加入高濃度和低濃度（定量下限濃度3倍以內(nèi)以及接近定量123 上限），來獲得批間響應的變異。其驗證報告應包括分析物和內(nèi)標的峰面積，以124 及每一樣品的計算濃度。這些濃度計算值的總體變異系數(shù)不得大于15%。125 除正?；|(zhì)外，還應關(guān)注其他樣品的基質(zhì)效應，例如溶血的或高血脂的血漿126 樣品等。 127 2.1.9 穩(wěn)定性 128 必須在分析方法的每一步驟確保穩(wěn)定性，用于檢查穩(wěn)定性的條

14、件，例如樣品129 基質(zhì)、抗凝劑、容器材料、儲存和分析條件，都應該與實際試驗樣品的條件相似。130 用文獻報道的數(shù)據(jù)證明穩(wěn)定性是不夠的。 131 采用低和高濃度質(zhì)控樣品（空白基質(zhì)加入分析物至定量下限濃度3倍以內(nèi)以1325 及接近定量上限），在預處理后以及在所評價的條件儲存后立即分析。由新鮮制133 備的校正標樣獲得標準曲線，根據(jù)標準曲線分析質(zhì)控樣品，將測得濃度與標示濃134 度相比較，每一濃度的均值與標示濃度的偏差應在±15%范圍內(nèi)。135 應通過適當稀釋，考慮到檢測器的線性和測定范圍，檢驗儲備液和工作溶液136 的穩(wěn)定性。 137 穩(wěn)定性檢查應考察不同儲存條件，時間尺度應不小于試驗

15、樣品儲存的時間。 138 通常應該進行下列穩(wěn)定性考察： 139 l 分析物和內(nèi)標的儲備液和工作溶液的穩(wěn)定性； 140 l 從冰箱儲存條件到室溫或樣品處理溫度，基質(zhì)中分析物的冷凍和融化穩(wěn)141 定性； 142 l 基質(zhì)中分析物在冰箱儲存的長期穩(wěn)定性； 143 此外，如果適用，也應該進行下列考察： 144 l 處理過的樣品在室溫下或在試驗過程儲存條件下的穩(wěn)定性； 145 l 處理過的樣品在自動進樣器溫度下的穩(wěn)定性。 146 在多個分析物試驗中，特別是對于生物等效性試驗，應該關(guān)注每個分析物在147 含所有分析物基質(zhì)中的穩(wěn)定性。 148 應特別關(guān)注受試者采血時，以及在儲存前預處理的基質(zhì)中分析物的穩(wěn)定性

16、，149 以確保由分析方法獲得的濃度反映受試者采樣時刻的分析物濃度?？赡苄枰鶕?jù)150 分析物的結(jié)構(gòu)，按具體情況證明其穩(wěn)定性。 151 2.2 部分驗證 152 在對已被驗證的分析方法進行小幅改變情況下，根據(jù)改變的實質(zhì)內(nèi)容，可能153 需要部分方法驗證。可能的改變包括：生物分析方法轉(zhuǎn)移到另一個實驗室，改變154 儀器、校正濃度范圍、樣品體積，其他基質(zhì)或物種，改變抗凝劑、樣品處理步驟、155 儲存條件等。應報告所有的改變，并對重新驗證或部分驗證的范圍說明理由。 156 2.3 交叉驗證 157 應用不同方法從一項或多項試驗獲得數(shù)據(jù)，或者應用同一方法從不同試驗地158 點獲得數(shù)據(jù)時，需要互相比較這

17、些數(shù)據(jù)時，需要進行分析方法的交叉驗證。如果159 可能，應在試驗樣品被分析之前進行交叉驗證，同一系列質(zhì)控樣品或試驗樣品應160 被兩種分析方法測定。對于質(zhì)控樣品，不同方法獲得的平均準確度應在±15%范161 圍內(nèi)，如果放寬，應該說明理由。對于試驗樣品，至少67%樣品測得的兩組數(shù)值162 差異應在兩者均值的±20%范圍內(nèi)。163 3. 試驗樣品分析 164 在分析方法驗證后，可以進行試驗樣品或受試者樣品分析。需要在試驗樣品1656 分析開始前證實生物分析方法的效能。 166 應根據(jù)已驗證的分析方法處理試驗樣品以及質(zhì)控樣品和校正標樣，以保證分167 析批被接受。 168 3.1

18、 分析批 169 一個分析批包括空白樣品和零濃度樣品，包括至少6個濃度水平的校正標170 樣，至少3個濃度水平質(zhì)控樣品（低、中、高濃度雙重樣品，或至少試驗樣品總171 數(shù)的5%，兩者中取數(shù)目更多者），以及被分析的試驗樣品。所有樣品（校正標樣、172 質(zhì)控和試驗樣品）應按照它們將被分析的順序，在同一樣品批中被處理和提取。173 一個分析批包括的樣品在同一時間處理，即沒有時間間隔，由同一分析者相繼處174 理，使用相同的試劑，保持一致的條件。質(zhì)控樣品應該分散到整個批中，以此保175 證整個分析批的準確度和精密度。 176 對于生物等效性試驗，建議一名受試者的全部樣品在同一分析批中分析，以177 減

19、少結(jié)果的變異。 178 3.2 分析批的接受標準 179 應在分析試驗計劃或標準操作規(guī)程中，規(guī)定接受或拒絕一個分析批的標準。180 在整個分析批包含多個部分批次的情況，應該針對整個分析批，也應該針對分析181 批中每一部分批次樣品定義接受標準。應該使用下列接受標準： 182 校正標樣測定回算濃度一般應在標示值的±15%范圍內(nèi)，定量下限應在±20%183 范圍內(nèi)。不少于6個校正標樣，至少75%標樣應符合這些標準。如果校正標樣中184 有一個不符合標準，則應該拒絕這個標樣，重新計算不含該標樣的標準曲線，并185 進行回歸分析。 186 質(zhì)控樣品的準確度值應該在標示值的±

20、;15%范圍內(nèi)。至少67%質(zhì)控樣品，且187 每一濃度水平至少50%樣品應符合這一標準。在不滿足這些標準的情況下，應該188 拒絕該分析批，相應的試驗樣品應該重新提取和分析。 189 在同時測定幾個分析物的情況下，對每個分析物都要有一條標準曲線。如果190 一個分析批對于一個分析物可以接受，而對于另一個分析物不能接受，則接受的191 分析物數(shù)據(jù)可以被使用，但應該重新提取和分析樣品，測定被拒絕的分析物。192 如果使用多重校正標樣，其中僅一個定量下限或定量上限標樣不合格，則校193 正范圍不變。 194 所有接受的分析批，每個濃度質(zhì)控樣品的平均準確度和精密度應該列表，并195 在分析報告中給出。

21、如果總平均準確度和精密度超過15%，則需要進行額外的考196 察，說明該偏差的理由。在生物等效性試驗情況下，這可能導致數(shù)據(jù)被拒絕。 197 3.3 校正范圍 1987 如果在試驗樣品分析開始前，已知或預期試驗樣品中的分析物濃度范圍窄，199 則推薦縮窄標準曲線范圍，調(diào)整質(zhì)控樣品濃度，或者適當加入質(zhì)控樣品新的濃度，200 以充分反映試驗樣品的濃度。 201 如果看起來很多試驗樣品的分析物濃度高于定量上限，在可能的情況下，應202 該延伸標準曲線的范圍，加入額外濃度的質(zhì)控樣品或改變其濃度。 203 至少2個質(zhì)控樣品濃度應該落在試驗樣品的濃度范圍內(nèi)。如果標準曲線范圍204 被改變，則生物分析方法應被

22、重新驗證（部分驗證），以確認響應函數(shù)并保證準205 確度和精密度。 206 3.4 試驗樣品的重新分析和報告值選擇 207 應該在試驗計劃或標準操作規(guī)程中預先確定重新分析試驗樣品的理由以及208 選擇報告值的標準。在試驗報告中應該提供重新分析的樣品數(shù)目以及占樣品總數(shù)209 的比例。 210 重新分析試驗樣品可能基于下列理由： 211 l 由于校正標樣或質(zhì)控樣品的準確度或精密度不符合接受標準，導致一個212 分析批被拒絕； 213 l 內(nèi)標的響應與校正標樣和質(zhì)控樣品的內(nèi)標響應差異顯著； 214 l 進樣不當或儀器功能異常； 215 l 測得的濃度高于定量上限，或低于該分析批的定量下限，且該批的最

23、低216 濃度標樣從標準曲線中被拒絕，導致比其他分析批的定量下限高； 217 l 在給藥前樣品或安慰劑樣品中測得可定量的分析物； 218 l 色譜不佳。 219 對于生物等效性試驗，通常不能接受由于藥動學理由重新分析試驗樣品。 220 在由于給藥前樣品陽性結(jié)果或者由于藥動學原因進行重新分析的情況下，應221 該提供重新分析樣品的身份、初始值、重新分析的理由、重新分析獲得值、最終222 接受值以及接受理由。 223 在儀器故障的情況下，如果已經(jīng)在方法驗證時證明了重新進樣的重現(xiàn)性和進224 樣器內(nèi)穩(wěn)定性，則可以將已經(jīng)處理的樣品重新進樣。但對于拒絕的分析批，則需225 要重新處理樣品。 226 3.

24、5 完整性 227 應在標準操作規(guī)程中描述色譜的完整性以及重新積分。任何對該標準操作規(guī)228 程的偏離都應在分析報告中討論。實驗室應該記錄色譜完整性參數(shù)，在重新積分229 的情況下，記錄原始和最終的積分數(shù)據(jù)，并在要求時提交。 230 3.6 用于評價方法重現(xiàn)性的試驗樣品再分析 2318 在方法驗證中使用校正標樣和質(zhì)控樣品可能無法模擬實際試驗樣品。例如，232 蛋白結(jié)合、已知和未知代謝物的回復轉(zhuǎn)化、樣品均一性或同服藥物引起的差異，233 可能影響這些樣品在處理和儲存過程中分析物的準確度和精密度。因此，推薦通234 過在不同天后，在另外一個分析批中重新分析試驗樣品，來評價實際樣品測定的235 準確

25、度。檢驗的范圍由分析物和試驗樣品決定，并應該基于對分析方法和分析物236 的深入理解。建議獲得Cmax附近和消除相樣品的結(jié)果，一般應該重新分析10%237 樣品，如果樣品總數(shù)超過1000，則超出部分重新分析5%樣品。238 對于至少67%的重復測試，原始分析測得的濃度和重新分析測得的濃度之間239 的差異應在兩者均值的±20%范圍內(nèi)。240 試驗樣品再分析顯示偏差結(jié)果的情況下，應該進行考察，采取足夠的步驟優(yōu)241 化分析方法。 242 至少在下列情形下，應該進行試驗樣品的再分析： 243 l 毒動學試驗，每個物種一次 244 l 所有關(guān)鍵性的生物等效性試驗 245 l 首次用于人體的

26、藥物試驗 246 l 首次用于患者的藥物試驗 247 l 首次用于肝或腎功能不全患者的藥物試驗 248 對于動物試驗，可能僅需要在早期關(guān)鍵性試驗中進行實際樣品的再分析，例249 如涉及給藥劑量和測得濃度關(guān)系的試驗。 250 4. 配體結(jié)合分析 251 配體結(jié)合分析主要用于大分子藥物。前述的驗證原則以及對試驗樣品分析的252 考慮一般也適用。但是由于大分子固有的特點和結(jié)構(gòu)復雜性，使其難以被提取，253 所以常常在無預先分離的情況下測定分析物。此外，方法的檢測終點并不直接來254 自分析物的響應，而來自與其他結(jié)合試劑產(chǎn)生的間接信號。配體結(jié)合分析中，每255 個校正標樣、質(zhì)控樣品以及待測樣品一般都采

27、用復孔分析。如無特殊說明，本節(jié)256 以雙孔分析為原則。 257 4.1 方法驗證前的考量 258 4.1.1 標準品選擇259 生物大分子具有不均一性，其中成分的效價與免疫反應可能存在差異。因此260 應對標準品進行充分表征。應盡量使用純度最高的標準品。用于配制校正標樣和261 質(zhì)控樣品的標準品應盡量與臨床和非臨床試驗使用的受試品批號相同。標準品批262 號變更時，應盡量對其進行表征和生物分析評價，以確保方法性能不變。 263 4.1.2 基質(zhì)選擇2649 一般不推薦使用經(jīng)碳吸附、免疫吸附等方法提取過的基質(zhì)，或透析血清、蛋265 白緩沖液等替代實際樣品基質(zhì)建立分析方法。但在某些情況下，復雜生

28、物基質(zhì)中266 可能存在高濃度與分析物結(jié)構(gòu)相關(guān)的內(nèi)源性物質(zhì)，其高度干擾導致根本無法測定267 分析物。在無其它可選定量策略的前提下，可允許使用替代基質(zhì)建立分析方法。268 但應對使用替代基質(zhì)建立方法的必要性加以證明。 269 可采用替代基質(zhì)建立標準曲線，但質(zhì)控樣品必須用實際樣品基質(zhì)配制，應通270 過計算準確度來證明基質(zhì)效應的消除。271 4.1.3 最低需求稀釋度的確定272 分析方法建立與驗證過程中，可能需要對基質(zhì)進行必要的稀釋，以降低其產(chǎn)273 生的高背景信號。在此情況下，應考察最低需求稀釋度。它是指分析方法中為提274 高信噪比、減少基質(zhì)干擾、優(yōu)化準確度與精密度而必須使用緩沖液對生物樣

29、品進275 行稀釋的最小倍數(shù)。應使用與試驗樣品相同的基質(zhì)來配制加藥樣品來確定最低需276 求稀釋度。 277 4.1.4 試劑278 方法的關(guān)鍵試劑，如結(jié)合蛋白、適配子、抗體或偶聯(lián)抗體、酶等，對分析結(jié)279 果會產(chǎn)生直接影響，因此須確保質(zhì)量。如果在方法驗證或樣品分析過程中，關(guān)鍵280 試劑批次發(fā)生改變，須確認方法性能不因此改變，從而確保不同批次結(jié)果的一致281 性。 282 無論是關(guān)鍵試劑，還是緩沖液、稀釋液、酸化劑等非關(guān)鍵試劑，都應對維持283 其穩(wěn)定性的保障條件進行記錄，以確保方法性能長期不變。 284 4.2 方法驗證285 4.2.1 完整驗證286 （1）標準曲線與定量范圍287 標

30、準曲線反映了分析物濃度與儀器響應值之間的關(guān)系。在配體結(jié)合分析方法288 中，標準曲線的響應函數(shù)是間接測得的，一般呈非線性，常為S型曲線。289 應使用至少6個有效校正標樣濃度建立標準曲線。校正標樣應在預期定量290 范圍對數(shù)坐標上近似等距離分布。除校正標樣外，可使用錨定點輔助曲線擬合。291 驗證過程中，須至少對6個獨立的分析批進行測定，結(jié)果以列表形式報告，292 以確定標準曲線回歸模型整體的穩(wěn)健性。擬合時，一條標曲允許排除由于明確或293 不明原因產(chǎn)生失誤的濃度點。排除后應至少有75%的校正標樣回算濃度在標示值294 的±20%（定量下限與定量上限在±25%）范圍內(nèi)。定量

31、下限與定量上限之間的濃29510 度范圍為標準曲線的定量范圍。錨定點校正樣品是處于定量范圍之外的標樣點，296 用于輔助擬合配體結(jié)合分析的非線性回歸標準曲線，因其在定量范圍之外，可不297 遵循上述接受標準。 298 （2）特異性299 特異性是指在樣品中存在相關(guān)干擾物質(zhì)的情況下，分析方法能夠準確、專一300 地測定分析物的能力。結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)或預期合用藥物應不影響方法對分析物的測301 定。如在方法建立與驗證階段無法獲取結(jié)構(gòu)相關(guān)物質(zhì)，特異性評價可在最初方法302 驗證完成后補充進行。應采用未曾暴露于分析物的基質(zhì)配制高濃度與低濃度質(zhì)控303 樣品，加入遞增濃度的相關(guān)干擾物質(zhì)或預期合用藥物進行特異

32、性考察。未加入分304 析物的基質(zhì)也應同時被測量。要求至少80%以上的質(zhì)控樣品準確度在±20%范圍305 內(nèi)（如果在定量下限水平，則在±25%范圍內(nèi)），且未加入分析物的基質(zhì)的測量值306 應低于定量下限。 307 （3）選擇性308 方法的選擇性是指基質(zhì)中存在非相關(guān)物質(zhì)的情況下，準確測定分析物的能309 力。由于生物大分子樣品一般不經(jīng)提取，基質(zhì)中存在的非相關(guān)物質(zhì)可能會干擾分310 析物的測定。應通過向至少10個不同來源的基質(zhì)加入定量下限和定量上限水平311 的分析物來考察選擇性，也應同時測量未加入分析物的基質(zhì)。選擇性考察要求至312 少80%以上的樣品準確度在±2

33、0%范圍內(nèi)（如果在定量下限水平，則在±25%范圍313 內(nèi)）， 且未加入分析物的基質(zhì)的測量值應低于定量下限。如果干擾具有濃度依賴314 性，則須測定發(fā)生干擾的最低濃度。在此情況下，可能需要在方法驗證之前調(diào)整315 定量下限。根據(jù)項目需要，可能需要針對病人群體基質(zhì)或特殊基質(zhì)（如溶血基質(zhì)316 或高血脂基質(zhì)）考察選擇性。 317 （4）精密度與準確度318 應選擇至少5個濃度的質(zhì)控樣品進行準確度、精密度以及方法總誤差考察。319 包括定量下限濃度、低濃度質(zhì)控（定量下限濃度的3倍以內(nèi)）、中濃度質(zhì)控（標320 準曲線中段）、高濃度質(zhì)控（定量上限濃度75%以上）以及定量上限濃度質(zhì)控。321 低

34、、中、高濃度質(zhì)控標示值不得與校正標樣濃度標示值相同。質(zhì)控樣品應經(jīng)過冷322 凍，并與試驗樣品采用相同的方法進行處理。不建議采用新鮮配制的質(zhì)控樣品進323 行精密度與準確度考察。批間考察應在數(shù)日內(nèi)進行至少6個獨立的分析批測定。324 每批內(nèi)應包含至少3套質(zhì)控樣品（每套含至少5個濃度的質(zhì)控樣品）。對于批內(nèi)325 和批間準確度，各濃度質(zhì)控樣品的平均濃度應在標示值的±20%（定量下限和定326 量上限為±25%）范圍內(nèi)。批內(nèi)和批間精密度均不應超過20%（定量下限和定量327 上限為25%）。此外，方法總誤差（即%相對偏差絕對值與%變異系數(shù)之和）不32811 應超過30%（定量下限和

35、定量上限為40%）。329 （5）稀釋線性330 在標準曲線定量范圍不能覆蓋預期樣品濃度的情況下，應使用質(zhì)控樣品進行331 方法的稀釋線性考察，即評價樣品濃度超過分析方法的定量上限時，用空白基質(zhì)332 將樣品濃度稀釋至定量范圍內(nèi)后，方法能否準確測定。進行稀釋實驗的另一目的333 是考察方法是否存在“前帶”或“鉤狀”效應，即高濃度分析物引起的信號抑制。334 稀釋線性考察中，稀釋至定量范圍內(nèi)的每個QC樣品經(jīng)稀釋度校正后的回算335 濃度應在標示值的±20%范圍內(nèi)，且所有QC樣品回算終濃度的精密度不超過336 20%。337 （6）平行性338 為發(fā)現(xiàn)可能存在的基質(zhì)效應，或代謝物的親和性

36、差異，在可獲得真實試驗樣339 品的情況下，應考慮對標準曲線和系列稀釋的試驗樣品之間進行平行性考察。應340 選取高濃度真實樣品（最好采用Cmax附近的樣品），用空白基質(zhì)將其稀釋到至少341 3個不同濃度后進行測定，系列稀釋樣品間的精密度不應超過30%。如果存在樣342 品稀釋非線性的情況（即非平行性），則應按事先的規(guī)定予以報告。如果在方法343 驗證期間無法獲取真實試驗樣品，則應在獲得真實試驗樣品后盡快進行平行性考344 察。 345 （7）樣品穩(wěn)定性346 應使用低、高濃度質(zhì)控樣品考察分析物的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性考察應包括室溫或347 樣品處理溫度下的短期穩(wěn)定性，以及凍-融穩(wěn)定性。此外，如果試驗

37、樣品需要長348 期凍存，則應在可能凍存樣品的每個溫度下進行長期穩(wěn)定性考察。每一濃度質(zhì)控349 樣品應有67%以上的樣品濃度在標示值的±20%范圍內(nèi)。350 （8）商品化試劑盒351 商品化試劑盒可以用來進行試驗樣品分析，但使用前必須按本指導原則的要352 求對其進行驗證。 353 4.2 部分驗證和交叉驗證 354 在2.2節(jié)和2.3節(jié)中敘述的關(guān)于驗證的各項內(nèi)容都適用于配體結(jié)合分析。355 4.3 試驗樣品分析 356 4.3.1 分析批357 配體結(jié)合分析中最常使用微孔板，一個微孔板通常為一個分析批。每個微孔35812 板應包含一套獨立的標準曲線和質(zhì)控樣品，以校準板間差異。在使用某些平臺時，359 單個樣品載體的通量可能有限，此時允許一個分析批包含多個載體。可在該分析360 批的首個與末個載體各設(shè)置一套標準曲線，同時在每一載體上設(shè)置質(zhì)控樣品。所361 有樣品均應復孔測定。 362 4.3.2 試驗樣品分析的接受標準363 對于每個分析批，除錨定點外，標準曲線須有75%以上的校正標樣（至少6364 個）回算濃度在標示值的±20%（定量下限和定量上限為±25%）范圍內(nèi)。365 每塊板應含有至少2套3水平（低、中、高濃度）的復設(shè)質(zhì)控樣品。在試驗366 樣品測試過程的驗證中，質(zhì)控樣品的復設(shè)數(shù)量應與試驗樣品分析一致。每塊板至367 少6