果糖及低聚果糖的分離純化

1、果糖及低聚果糖的分離、純化目錄一、除雜2二、脫色21 .活性炭脫色22 .新生態(tài)碳酸鈣法脫色23 .樹脂脫色23.1 LSA-8吸附樹脂23.2 D318樹脂24 .離子交換3三、提純31.1 .分子量不同的糖的分離31 納濾分離31 分級納濾分離31 柱層析凝膠分離42.1 .相同分子量的糖的分離42 葡萄糖和果糖的分離42.2 化學(xué)試劑法42.2 吸附分離52.2 GOD-CAT雙酶法氧化52.2 復(fù)鹽法62.2 連續(xù)色譜分離（CSEP）63.1 .手性拆分63 分子印跡聚合物分離手性分子63.2 功能單體的選擇73.2 MIPs的制備73 手性膜拆分法73 優(yōu)先結(jié)晶方法83 化學(xué)拆分法8

2、3.5 生成非對應(yīng)異構(gòu)體拆分法83.5 生物化學(xué)拆分法8參考文獻(xiàn)9一、除雜.通過低溫下冷凍和用乙醇-正己烷除去油脂和脂類物質(zhì)；.加入磷酸和氫氧化鈣，絮凝沉淀出果膠；.用鹽析法、等電點(diǎn)法、溶劑沉淀法(sevage法)除去蛋白質(zhì)；.加淀粉酶除去淀粉；.用陽離子聚丙烯吹胺吸附溶液中帶負(fù)電荷的部分如蛋白質(zhì)、多糖、蹂質(zhì)、樹膠、淀粉和單寧等，最佳條件52C,pH=6,CPAM添加量為0.08%,絮凝時間3h.二、脫色.活性炭脫色通過極差最優(yōu)化分析，確定出最佳影響因素pH脫色溫度,脫色時間活性炭用量，最優(yōu)化工藝條件為：活性炭用量1.4%,脫色溫度70C,pH值3.8,脫色時間50min.111經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證的透

3、光率為99.7%,同時在實(shí)驗(yàn)過程中用高效液相色譜方法檢測活性炭脫色后的低聚果糖溶液中低聚果糖含量，結(jié)果顯示低聚果糖在脫色前后并無損失.新生態(tài)碳酸鈣法脫色在低聚果糖液中加入Ca(OH)2混合均勻后，再緩慢通入CO2來反應(yīng)生成碳酸鈣，這時新生態(tài)碳酸鈣便與低聚果糖液中的色素發(fā)生吸附作用，從而達(dá)到脫色的效果.在原樣7港I度：190Bx透光率:92.31%,pH值:6.4電導(dǎo)率:26mV的條件下，測試結(jié)果不如活性炭.【1】.樹脂脫色LSA-8吸附樹脂在溫度為70C,pH為6的條件下用脫色2h,實(shí)驗(yàn)結(jié)果色素的吸附率高達(dá)92.35%;1141D318樹脂樹脂用量為低聚果糖樣品溶液的3.7%,pH=5.2，脫

4、色時間3h，脫色溫度為52C.離子交換鐘振聲等選擇了D392大孔陰離子交換樹脂對大豆低聚糖進(jìn)行脫色，在與低聚糖比為1:11的條件下，常溫脫色3-4小時，色素的吸附率達(dá)86%.1141三、提純低聚果糖溶液中非有效成分葡萄糖、果糖、蔗糖，其相對分子質(zhì)量分別為180,180,342;有效成分蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖的相對分子量分別為504,666,828.分子量不同的糖的分離納濾分離最佳條件：跨膜壓差為1.1MPa,料液濃度為10g/100g,溫度40C,循環(huán)流量6L/min,pH=6.【13】物料初始濃度30g/L、操作壓力0.2Mpa、純化15倍.【12】分級納濾分離先將樣品通過0.3微米的

5、微濾膜，將其透過液作為分級納濾的母液J1】采用全回流方式，對樣品共進(jìn)行兩級納濾膜分離處理和一次反滲透膜回收處理.第一級納濾膜分離，在0.3MPa,25C,初始料液濃度為10倍稀釋下，選用JN1812-34納濾膜，對原始料液進(jìn)行分離，之后三倍洗脫，截留蔗果五糖；第二級納濾膜分離，在0.4MPa,25c下，選用DK1812c-47D納濾膜，對一級納濾的透過液進(jìn)行分離，截留蔗果三糖與蔗果四糖；經(jīng)過兩級納濾和反滲透分離，二貨佚渡透過注一二尉就瓢S?C0珈好，切叫泵珈吩工，蝴囊總一敏觸二購濃分級納濾分離工藝?yán)ig4-1classificationNFprocesschart可以將低聚果糖溶液按其所含溶

6、質(zhì)的不同分為三部分，分別800部分為蔗果五糖、200A800部分為低聚果糖和200部分為葡萄糖、果糖及部分蔗糖混合物.最后對二級透過液進(jìn)行反滲透膜過濾，回收其中的葡萄糖、果糖等成分和大量的水.工藝流程圖如下：為了避免因膜污染而造成的實(shí)驗(yàn)誤差，每處理完一次樣品后，均用蒸儲水對納濾裝置和納濾膜進(jìn)行3次清洗，每次清洗時間約為8min.如果長時間（大于一周）應(yīng)該先用濃度為2%的表面活性劑進(jìn)行清洗，最后用蒸儲水沖洗至無泡沫為止將清洗干凈的膜管保存在0.5%的甲醛溶液或1%的亞硫酸氫鈉溶液中，以防止長霉長菌，損壞膜表面層.實(shí)驗(yàn)證明，沖洗時間和浸泡時間分別為60min和90min時二者都可使膜的純水透過通量

7、恢復(fù)系數(shù)達(dá)到100%左右.1131柱層析凝膠分離吸取一定量低聚果糖（過0.45微米的膜）均勻滴加在層析柱聚丙烯吹胺凝膠表面，打開底部閥門，待低聚果糖剛好滲入凝膠時關(guān)閉閥門，用少量的脫氣超純水洗下殘留在柱壁上的糖液，打開閥門讓洗脫液剛好滲入凝膠表面后關(guān)閉.接上泵開始洗脫，同時將柱下端接在蒸發(fā)光散射檢測器（N2流速為2.5L/min,溫度為100C）上直接進(jìn)行檢測分析.【1】在1.6cm*100cm的玻璃柱上最佳的層析條件：洗脫速度02mL/min上樣量0.5mI_（樣液質(zhì)量濃度0.4g/ml）、柱溫40C,以Megazaae公司的標(biāo)準(zhǔn)品為對照，經(jīng)HPLC和MS分析，證明層析分離所得組分峰4峰、3

8、和峰2分別是蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖。而且經(jīng)HPLC面積歸一化法定量分析，證明分離產(chǎn)品蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖蔗和果六糖的含量分別為99.9%、99.94%、99.33%和97.89%。1171.相同分子量的糖的分離葡萄糖和果糖的分離化學(xué)試劑法取混合物少許于潔凈的試管中，然后滴入澄清的石灰水，振蕩，不久有沉淀出現(xiàn).化學(xué)反應(yīng)式如下：C6H1206（葡萄糖）+Ca（OH）2-C6H12O6?Ca（OH）2（葡萄糖化鈣）C6H1206（果糖）+Ca（OH）2+H20-C6H12O6?Ca（OH）2?H20/果糖化鈣）把上述濁液進(jìn)行過濾，取沉淀于盛有少量水的試管中，然后通入CO2,又有沉淀出現(xiàn)

9、.CO2+C6Hi2O6?Ca(OH)2?H20-CaC03>C6H12O6+2H20過濾后將濾液蒸發(fā)、結(jié)晶，即得果糖晶體.在上面濾出的葡萄糖化鈣溶液中通入CO2,同樣有沉淀出現(xiàn).CO2+C6Hi2O6?Ca(OH)2-CaC03*C6H12O6+2H20過濾后將濾液蒸發(fā)、結(jié)晶，即得葡萄糖晶體.吸附分離聚苯乙烯型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂吸附分離柱為一根直徑為8mm,長為400mm帶有恒溫夾套的玻璃柱.柱內(nèi)填充經(jīng)Ca2+離子交換后的聚苯乙烯型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，先吸取一定量的糖液，從吸附柱上方以一定的速度滴入，待糖液加完后，繼續(xù)用同樣的速度加蒸儲水將糖份洗脫，整個加入液體的速度控制在與吸附柱

10、流出液的速度近乎相等為宜，以保持液面位置及柱內(nèi)液體流速恒定.在加完糖樣同時開始在吸附柱下端收集流出液.【15】溫度控制為(34.8-35.2),洗脫液為去離子水最佳分離條件為：進(jìn)樣質(zhì)量分?jǐn)?shù)10.5%、進(jìn)樣體積5m1,洗脫速率0.282mL/min,在分離時間達(dá)到100min左右時，流出液中果糖含量可達(dá)90%(干基).【5】2.1.2.2模擬移動床(SMB)技術(shù)SMB是一種利用色譜吸附分離原理進(jìn)行液體操作的設(shè)備.它以逆流連續(xù)操作方式，通過變換固定床吸附設(shè)備的物料進(jìn)出口位置，產(chǎn)生相當(dāng)于吸附劑連續(xù)向下移動，而物料連續(xù)向上移動的效果.吸附塔內(nèi)的吸附劑對果糖的滯留作用遠(yuǎn)大于葡萄糖.當(dāng)精制后的糖液進(jìn)入裝有

11、吸附劑的吸附塔后，果糖被吸附，而葡萄糖不被吸附，在解吸劑的作用下.葡萄糖與解吸劑先從吸附塔一端流出，而果糖與解吸劑最后流出，除去解吸劑，得到果糖和葡萄糖，達(dá)到分離的目的.為了連續(xù)高效地分離，若干吸附塔串聯(lián)，各部分進(jìn)、出料口接上管線通過分配系統(tǒng)，經(jīng)多通旋轉(zhuǎn)分配閥定時同時向前逐一切換，以實(shí)現(xiàn)連續(xù)分離.經(jīng)過SMB的分離操作后所得產(chǎn)物的果糖含量高達(dá)90%.GOD-CAT雙酶法氧化在葡萄糖氧化酶的催化作用下把葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和過氧化氫，形成的過氧化氫被過氧化氫酶作用放出1/2O2,供反應(yīng)體系的需要.反應(yīng)過程中，加入氫氧化鈣調(diào)整反應(yīng)pH值，使產(chǎn)生的葡萄糖酸與鈣離子結(jié)合生成葡萄糖酸鈣，再結(jié)晶，經(jīng)過分離

12、純化即可制得葡萄糖酸鈣.這樣就可將水解液中的葡萄糖和果糖分離.反應(yīng)方程式如下：GODC出曲+O：+H?O_曲WzCATHQ-*H20+1/2（hCM。一Q（0HhXOhOt）：HO最佳工藝條件：反應(yīng)溫度35C,pH5.5,酶用量GOD85u/g葡萄糖，CAT1235u/g葡萄糖，底物濃度20%（w/v）,反應(yīng)20h.【9】復(fù)鹽法混合糖液與氯化鈣作用，生成果糖一CaCl2的復(fù)鹽，或與NaCl作用生成葡萄糖-NaCl的復(fù)鹽，然后使其自母液中分離.連續(xù)色譜分離（CSEP）用泵向樹脂柱進(jìn)料，進(jìn)料液濃度為50.54g/100g,pH值4.0,體積68m1,吸附齊稀:向再循環(huán)慢流出產(chǎn)品進(jìn)料快流出產(chǎn)品洗脫劑

13、進(jìn)料結(jié)束立即泵入去離子水，操作溫度60C,進(jìn)料、洗脫流速為7m1/min.收集流出液.駐留時間為20min,在20min內(nèi)進(jìn)料340m1,洗脫水量735m1,洗脫回填量535m1,再吸附區(qū)回填量495m1.由檢測結(jié)果知，洗脫液（果糖產(chǎn)品）的純度為98.64%,果糖濃度39.29%,葡萄糖產(chǎn)品中的葡萄糖純度為98.58%,果糖提取收率98.35%.圖中慢流出產(chǎn)品為果糖產(chǎn)品，快流出產(chǎn)品為葡萄糖產(chǎn)品，洗脫劑為去離子水，吸附劑為樹脂.【7】.手性拆分分子印跡聚合物分離手性分子分子印跡技術(shù)主要在聚合過程中引入模板分子（包括原子、離子、分子、復(fù)合物或分子、離子、大分子的聚集體），通過模板分子與功能單體結(jié)合

14、形成結(jié)合位點(diǎn)，交聯(lián)后將模板分子固定在聚合物中，隨后除去部分或者全部模板分子，形成孔穴，通過識別位點(diǎn)與分子印跡孔穴的共同作用來識別模板分子.采用該技術(shù)制備的聚合物通常稱為分子印跡聚合物（MIPs）.【8】.1功能單體的選擇果糖中含有醇羥基，為弱酸性基團(tuán)，易于與堿性功能單體形成氫鍵作用.因此選擇弱堿性白丙烯吹胺（AM）和2一乙烯毗嚨（2-VP）兩種功能單體來制備MIPs.利用1HNMR研究功能單體與模板分子通過氫鍵作用后醇羥基質(zhì)子化學(xué)位移的變化，確定分子上的醇羥基能夠與功能單體發(fā)生氫鍵作用.2MIPs的制備在50mL的兩口燒瓶中加入一定量的模板分子，再加入適量乙月青作為致孔劑.加入一定比例的功能單

15、體，超聲通氮排氧，于冰水浴中預(yù)聚合8h.再加入EDMA交聯(lián)劑和引發(fā)劑.之后超聲1-2min,通氮?dú)?0min除氧，置于60c水浴中聚合12h.聚合反應(yīng)后得到的白色固體經(jīng)粉碎、研磨、過篩，取粒徑為2060微米之間的顆粒，用丙酮沉降三次，除去過小的顆粒，于60c下真空干燥后備用.將真空干燥后的MIPs以干法添加到HPLC色譜柱中.裝入MIPs的總量約為0.8g.以MIPs作為高效液相色譜固定相，拆分果糖的外消旋體.3.2手性膜拆分法用于手性拆分的支撐液膜是將膜液（溶劑和手性選擇劑）通過毛細(xì)管力吸附在多孔固體膜（液體的支撐膜）的孔道中，這種液膜也可稱為浸漬式液膜。在支撐液膜（SLM）中，具有手性選擇

16、能力的載體溶解于一定的液體溶劑之中，通過與某個對映異構(gòu)體特異性的結(jié)合，將其從上相運(yùn)輸?shù)较孪?，從而?shí)現(xiàn)手性分離.分離果糖的D,L構(gòu)型，可嘗試灑石酸等手性選擇劑。Hadik等用基于多孔聚丙烯中空纖維膜的支撐液膜研究了D,L乳酸的拆分.作為手性選擇劑的N-3,5一二硝基苯甲酰基-L-丙氨酸-辛酯溶解在疏水的液膜（甲苯）中，整個溶液固定在多孔聚丙烯中空纖維膜的孔中，最終將D,L-乳酸分開.【11】優(yōu)先結(jié)晶方法也叫接種結(jié)晶拆分法，在飽和或過飽和的外消旋體溶液中加入一個對映異構(gòu)體的品種，使該對映異構(gòu)體稍稍過量因而造成不對稱環(huán)境，這樣旋光性與該品種相同的異構(gòu)體就會從溶液中結(jié)晶出來.【10】對于不生成外消旋混

17、合物的化合物，將其轉(zhuǎn)化成鹽，接種結(jié)晶拆分法工藝簡單，成本較低目，效果較好；但通常只能間歇生產(chǎn)，一次收率較低。1181化學(xué)拆分法生成非對應(yīng)異構(gòu)體拆分法該法利用手性試劑與外消旋體反應(yīng)，生成兩個非對映異構(gòu)體，再利用它們物理性質(zhì)（如溶解度、蒸汽壓、吸收系統(tǒng)等）的不同，將其拆分，最后再把這兩個非對映異構(gòu)體分別復(fù)原為原來的對映體。通常拆分堿性物質(zhì)用酸性拆分劑，拆分酸性物質(zhì)用堿性拆分劑。1181常用的拆分劑有嗅化樟腦磺酸、a-苯基乙胺、酒石酸等。YamadaS.等用嗅化樟腦磺酸作為拆分劑，對DLPHPG進(jìn)行拆分，多次循環(huán)DHPG的最終收率可達(dá)92%。此法反應(yīng)步驟長、收率低，通常拆分劑價格昂貴，關(guān)鍵是選擇好拆

18、分劑，使其達(dá)到使用周期長、回收容易的目的。生物化學(xué)拆分法某些微生物和霉菌在外消旋體的稀溶液中生長時，破壞其中一種對映體的速度比另一種快。例如酵母在DL-氨基酸中，易與L一對映體反應(yīng)而剩下D一對映體，從而達(dá)到拆分的目的。生物化學(xué)拆分法可用完整的微生物細(xì)胞或從微生物中提取酶作為生物催化劑。生物催化劑的區(qū)域立體選擇性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、操作簡便、成本較低、公害少，且能夠完成一些化學(xué)方法難以完成的反應(yīng)。但是生物拆分法也有菌種篩選困難、酶制劑不易保存、產(chǎn)物后處理工作量大以及通常只能得到一種對映體等缺點(diǎn)。Yokozeki等以醛為原料，經(jīng)Bucherer:反應(yīng)合成DL5一對羥基苯乙內(nèi)獻(xiàn)月尿，然后用惡臭假單胞菌的二氫喀噬酶催化選擇性水解為N一氨甲吹一D一HPG,再經(jīng)化學(xué)或酶法脫氨甲?；肈-HPC,收率達(dá)92%01181參考文獻(xiàn)11武金良.高純低聚果糖分離純化技術(shù)的研究D,廣西大學(xué),2008.【2】張濤,江波.發(fā)酵法生成高純度低聚糖J.無錫輕工大學(xué)學(xué)報,2002,21(3).【3】孫洪登.分離葡萄糖和果糖混合物的實(shí)驗(yàn)J.化學(xué)教學(xué)，1995(4).4李秀琴楊星惠，安素欣.低聚果糖的純化方