差異顯示法分析不同生長環(huán)境中

1、差異顯示法分析不同生長環(huán)境中造血干 / 祖細胞基因表達的研究中國生物工程雜志 China Biotechnology, 2006, 26(1):11 14李群良劉啟威蔡海波譚文松*（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室上海200237）摘要目的 : 對比分析不同生長環(huán)境中的臍血CD34+造血干 / 祖細胞基因表達變化。方法 : 采用靜態(tài)和動態(tài)培養(yǎng)系統培養(yǎng)臍血單個核細胞，1 周后收獲 CD34+造血干 / 祖細胞 , 提取總 RNA,用差異顯示法對比分析在不同生長環(huán)境中造血干/ 祖細胞基因表達的差異。結果 : 在所使用的差異顯示條件下，得到30 個差異表達基因片段，其中一個差異表達片段為RA

2、N基因，該基因屬于 RAS癌基因家族，可能與造血細胞增殖有關。結論: 不同生長環(huán)境影響 CD34+造血干/ 祖細胞的基因表達，這些差異表達的基因可為優(yōu)化體外培養(yǎng)環(huán)境，擴增造血細胞提供分子基礎。關鍵詞臍血CD34+造血干 / 祖細胞培養(yǎng)環(huán)境差異顯示中圖分類號Q786收稿日期： 20050801 修回日期： 20051031* 通訊作者，電子信箱：wstan臍血是造血干/ 祖細胞的一種重要來源，臍血干細胞移植已被用于重建造血功能以治療血液疾病 1。然而由于單份臍血所含造血干細胞數量少的缺陷， 限制了其臨床應用范圍，因此體外擴增可能是解決該局限性的一種有效手段。目前，靜態(tài)和動態(tài)培養(yǎng)系統已被廣泛用于造

3、血干 / 祖細胞的體外擴增。然而有報道指出體外培養(yǎng)雖然能在一定程度上增加造血干 / 祖細胞數量，但是擴增的造血細胞卻表現出受損的生物學功能， 如歸巢和植入能力下降等， 這表明體外培養(yǎng)環(huán)境對造血干細胞的生物學活性具有重要影響 2,3 。另外，在相同的培養(yǎng)條件下（包括培養(yǎng)基、 細胞接種密度以及換液頻率等），造血細胞在不同的培養(yǎng)系統及操作模式下具有不同的增殖特性，這很可能是由不同培養(yǎng)模式所形成的局部微環(huán)境不同所致4。本實驗對比分析了不同培養(yǎng)模式擴增的造血干/ 祖細胞基因表達的變化，旨在通過分析差異表達基因從分子水平了解體外培養(yǎng)環(huán)境對造血干/ 祖細胞基因表達的影響，進而為優(yōu)化體外培養(yǎng)策略，擴增具有生物

4、學活性的造血干/ 祖細胞提供理論基礎。1 材料與方法1.1 培養(yǎng)基與細胞因子基本培養(yǎng)基為IMDM（ GIBCO），配制時加入3g/L NaHCO3、 2mmol/ml 谷氨酰胺、 104mol/L巰基乙醇以及10-5mol/L 氫化可的松。 使用時添加胎牛血清（20）、 SCF（ 50ng/ml ）、 IL3（ 5ng/ml ）和 IL6 （ 10ng/ml ）等。1.2 細胞培養(yǎng)用淋巴細胞分離液（1.077mg/ml ）分離臍血單個核細胞（ MNC），制成密度為1 106 個 /ml的細胞懸浮液進行培養(yǎng)，培養(yǎng)維持在37、 5 CO2、濕度飽和的二氧化碳培養(yǎng)箱中。靜態(tài)培養(yǎng)采用 24 孔板（ N

5、unc），每孔加入 2ml 細胞液。動態(tài)培養(yǎng)用125ml 轉瓶（ Techne ），起始細胞懸浮液至少 30ml，攪拌轉速為 30r/min。3d 時進行半量回流換液培養(yǎng)， 1 周后計數總細胞、 CD34+造血干 / 祖細胞以及集落形成細胞（CFC）的擴增倍數。1.3 總細胞、 CD34+造血干 / 祖細胞以及集落形成細胞分析總細胞采用血球計數板計數。CD34+造血干 / 祖細胞含量用流式細胞儀Becton DickinsonFACSCalibur分 析 （ BectonDickinson ）， 所 得 數 據 用 CellQuest軟 件 分 析 （ BectonDickinson ）處理。

6、集落形成細胞在含基培養(yǎng)， 2 周后計數集落形成細胞。1.4CD34+造血干 / 祖細胞的分離純化1.1%甲基纖維素及相應細胞因子的IMDM半固體培養(yǎng)采用 MiniMACS 免疫磁性系統和細胞富集試劑盒（Milienyi Biotech）分離純化CD34+造血干/ 祖細胞。將收獲的CD34+造血干 / 祖細胞再用一根新的MiniMACS 免疫磁性吸附柱進行第二輪分離純化，這樣得到的CD34+造血干 / 祖細胞純度可高達95%以上。2006, 26(1)李群良等：差異顯示法分析不同生長環(huán)境中造血干/ 祖細胞基因表達的研究中國生物工程雜志China Biotechnology Vol.26 No.1

7、 20061.5 差異顯示分析表 1 為 3 條錨定引物和8 條隨機引物序列，所有引物的5端均引入了EcoRI 酶切位點。以從 CD34+細胞中提取的總RNA為模板， 用錨定引物反轉錄生成3 組 cDNA，每組加入對應的錨定引物和8 條隨機引物進行PCR擴增，反應條件：94 30s, 40 2min, 72 30s ，40 個循環(huán) ; 72 5min ，1 個循環(huán) ; 4 10min ， 1 個循環(huán)。表 1 用于差異顯示分析的錨定引物和隨機引物Table 1Anchored primers and arbitrary primersused in differential display引物編

8、號引物序列(53)錨定引物A1AAGCTTTTTTTTAA2AAGCTTTTTTTTCA3AAGCTTTTTTTTG隨機引物P1AAGCTTGATTGCCP2AAGCTTCGACTATP3AAGCTTTGCTCAGP4AAGCTTCTCAACGP5AAGCTTAGTAGGCP6AAGCTTGCACCATP7AAGCTTAACGAGGP8AAGCTTTTACCGC擴增產物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行垂直電泳分離，將未培養(yǎng)的CD34+細胞以及靜態(tài)和動態(tài)培養(yǎng)系統擴增的樣品進行“肩并肩”載樣電泳，以便直接對比基因表達水平。1.6 差異表達基因片段的再擴增及克隆回收差異表達基因片段，以其為模板利用相應

9、的引物配對在Taq 酶（ Promega）作用下再次擴增差異表達片段，瓊脂糖凝膠電泳分析，用膠回收試劑盒（Qiagen ）純化擴增片段。將其與 pGEMT 載體（ Promega）進行 TA克隆，轉化大腸桿菌DH5。1.7 測序與同源性分析篩選陽性轉化子進行純培養(yǎng)， 提取質粒， 由上海博亞生物技術有限公司測序分析，將所得克隆片段提交 NCBI 數據庫中的 BLAST軟件進行同源性對比分析。1.8RTPCR驗證采用 RTPCR驗證差異表達基因片段。 將在不同培養(yǎng)模式下生長的CD34+造血干 / 祖細胞中的 RNA用看家基因 GAPDH均一化， 使其含量相等。 吸取等量的 RNA在相同條件下擴增差

10、異表達基因片段，根據擴增片段的光密度值比較基因表達的變化。2 結果與分析2.1 細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)結果見表2，靜態(tài)和動態(tài)培養(yǎng)系統中總細胞數略有下降，這可能是由于臍血細胞為適應新的生長環(huán)境需要一個延滯期以及部分成熟細胞死亡所致。然而 CD34+細胞在靜態(tài)和動態(tài)培養(yǎng)中分別擴增3 倍和 6 倍； CFC 細胞在靜態(tài)和動態(tài)培養(yǎng)系統中分別擴增約5 倍和 9 倍，表明動態(tài)培養(yǎng)體系更有利于造血干/ 祖細胞增殖。表 2 造血細胞在靜態(tài)和動態(tài)培養(yǎng)系統中增殖的對比分析Table 2Proliferative profiles of total cells,CD34+ cells and CFCTotalcellsC

11、D34+cellsCFCStaticculture0.863 0.0063.005 2.0154.750 2.955Stirred culture0.900 0.0986.145 5.0718.715 6.7492.2 差異顯示分析圖 1 為未培養(yǎng)CD34+細胞、動態(tài)和靜態(tài)培養(yǎng)擴增的CD34+細胞基因表達圖譜的一部分。從圖可以看出，每組引物組合均能有效擴增得到相應產物，每條泳道有10 個以上基因片段，說明所設計引物的有效性和合理性?？偣卜蛛x到30 個差異表達基因片段，這些片段大小一般介于 100bp1kb 之間，有的高表達發(fā)生在未培養(yǎng)的造血干/ 祖細胞中，有的在動態(tài)培養(yǎng)中高表達，而有的卻在靜態(tài)

12、培養(yǎng)中高表達，說明不同的生長環(huán)境誘導了基因差異表達。圖 1 應用差異顯示技術比較在不同生長環(huán)境下的 CD34+造血干 / 祖細胞的基因表達M: 100bp marker； F:未培養(yǎng) CD34+細胞； W：靜態(tài)培養(yǎng)；S：動態(tài)培養(yǎng)；箭頭：指示部分差異條帶Fig.1Gene expression analysis of CD34+ HSPCsgrown in different culture environmentsM:100bp DNA marker; F:Noncultured CD34+ cells;W:Static culture; S:Stirred culture; Arrows:p

13、ointingdifferent expressed genes2.3 差異表達基因片段的再擴增及克隆圖 2 差異表達基因片段的再擴增及克隆1:100bp DNA marker; 2:差異表達基因片段D 的再擴增產物；37：陽性克隆的EcoRI 酶切鑒定Fig. 2Reamplification and cloning of differentiallyexpressed gene fragments1： 100bp DNA marker; 2:Reamplified product of a differentiallyexpressed gene D; 37:EcoRI digestion

14、 of positive clones圖 2a 示其中一個差異表達基因片段經聚丙烯酰胺凝膠回收后再次擴增的電泳圖譜，表明該片段得到有效擴增。圖 2b 示該基因片段與pGEMT 載體連接并轉化DH5后經 EcoRI 酶切的電泳圖，可見，該片段已被成功克隆。實驗共克隆了5 個差異表達基因片段。2.4 測序及同源性對比分析對這5個差異表達片段進行測序，其中一個差 異表達片段 的DNA 序列 為： 5 TTCTCAACGAAAAGGAATGGGAATGACAGTAACAAACAAGATTTCACCACTGAATATTGTGATGTGACTGCAGCAGTCTTATATATGAAACTCAAGGAATC

15、AACTGCGTTCCAAAACAGCTAAATATGCAGGTCCAAACAATGAAGTTATTTTTTAAACTGCCACATTCACTCCGAAGCCCACTCATCTCCTTCAGC3。該片段為1#克隆，長 197bp，與人類RAN基因的同源性高達99%，因此該基因確定為RAN基因，該基因屬于RAS癌基因家族。其余4 個均為未知功能基因或未知基因，這些差異表達片段所對應的基因或DNA片段如表 2 所示。表 2 差異表達片段的同源性分析Table 2Alignments of differentially expressed fragmentsClonesGene names1#Hom

16、o sapiens of RAN, member of RAS oncogene family, mRNA (cDNAclone)2#GallusmRNAforhypotheticalprotein3#Homosapiens BACRP11615P1 4#HumanDNA sequence from clone RP11433N2 onchromosome 15#Human DNA sequence from clone RP110C162.5RTPCR驗證根據RAN基因在不同培養(yǎng)模式下培養(yǎng)的CD34+造血干/ 祖細胞中表達水平的相對光密度值計算可知，靜態(tài)培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)分別是未培養(yǎng)細胞的 1.

17、52 倍和 3.98 倍，如圖 3 所示， RAN基因在不同培養(yǎng)模式下培養(yǎng)的 CD34+造血干 / 祖細胞中差異表達，與差異顯示結果相一致。圖 3RT PCR驗證 RAN基因表達水平Fig. 3Confirmation of RAN with RTPCR3 討論雖然動態(tài)攪拌培養(yǎng)在一定程度上干擾了造血干細胞與輔助細胞、胞外基質以及細胞因子之間的相互作用，但從細胞培養(yǎng)結果可以看出，低攪拌轉速（30r/min ）條件下，動態(tài)培養(yǎng)能夠較好地支持造血細胞生長，且增殖潛力優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)。這說明動態(tài)系統培養(yǎng)環(huán)境的均一性（如營養(yǎng)物和代謝副產物濃度、生化參數、細胞相對密度以及細胞分散性等）更有利于造血細胞的增殖。

18、自從 1992 年建立以來，差異顯示被廣泛地應用于基因表達分析。它具有儀器設備要求相對簡單、能同時分析多個實驗樣品、細胞數量需求相對較少以及還有可能發(fā)現新基因等特點5。通過差異顯示分析， 發(fā)現了 30 個基因在處于不同生長環(huán)境的造血干/ 祖細胞中差異表達，表明不同培養(yǎng)環(huán)境影響造血干細胞的基因表達。其中一個差異表達基因RAN, 屬于 RAS癌基因家族成員，涉及細胞微管形成、紡錘絲組裝、核膜生成以及DNA復制 6,7 。該基因在體外培養(yǎng)過程中誘導表達， 且動態(tài)培養(yǎng)的表達水平高于靜態(tài)培養(yǎng)，提示 RAN基因可能與造血細胞的增殖有關， 也說明很可能存在胞外生長環(huán)境刺激信號，該信號與 RAN基因相關的信號

19、傳導途徑相互作用調節(jié)造血干細胞的增殖和分化。至于是什么胞外刺激信號，通過何種途徑與 RAN基因相互作用需要進行進一步的實驗探索。體外干細胞培養(yǎng)是一個復雜的生物學過程，在這個培養(yǎng)過程中， 特定的生長環(huán)境起著至關重要的作用。 生長環(huán)境影響干細胞的基因表達，而特異的基因表達圖譜決定了細胞的生長行為及生物學特性。 因此系統地研究培養(yǎng)環(huán)境或參數對干細胞基因表達的影響，可為干細胞性質發(fā)生變化的原因提供重要的分子基礎。通過調節(jié)或干預差異表達的基因可以更好地調控干細胞的增殖、 分化和凋亡， 對優(yōu)化體外培養(yǎng)環(huán)境參數，擴增具有生物學功能的干細胞具有重要的理論指導意義。參考文獻1 Cairo M S, Wagner

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24、splayLI QunliangLIU QiweiCAI HaiboTAN Wen Song(The State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University ofScience and TechnologyShanghai200237, China)AbstractObjective:Toinvestigatethechangesofgene expressioninCD34+hematopoietic stem and progenitorcells(HSPCs) underdifferentgrowthenvironments.Methods:Umbilicalcordbloodmononuclearcells(UCB MNCs) were culturedinstaticand stirred