酵母菌菌種保藏技術(shù)規(guī)程

1、酵母菌菌種保藏技術(shù)規(guī)程1范圍本規(guī)程規(guī)定了酵母菌菌種保藏的技術(shù)和程序。本規(guī)程適用于酵母菌菌種的保藏。2術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本規(guī)程2.1 定期移植法 subculturing |亦稱傳代培養(yǎng)保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)，待得到健壯的菌體后，于46C進行保存并間隔一定時間進行移植培養(yǎng)的一種短期菌種保藏方法。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途2.2 蒸餾水法 preservation in distilled water |指將欲保藏的菌種細胞懸浮于無菌蒸餾水中，密封后置于46C保存的一種菌種保藏方法。2.3 液體石蠟法 preservation in liquid pa

2、raffin亦稱礦物油保藏法，定期移植保藏法的輔助方法。指將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，最適條件下培養(yǎng)至待得到 健壯的菌體后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個斜面，再直立放置于低溫（46C）干燥處進行保存的一種菌種保藏方法。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途2.4 80 C冰箱凍結(jié)法 preservation at 80 C指將菌種懸浮于保護劑中，在-80 C冰箱中凍結(jié)保存的一種長期菌種保藏方法。2.5 液氮超低溫凍結(jié)法 preservation in liquid nitrogen-1指懸浮于保護劑中的菌種經(jīng)程控降溫后，移置于-196 C的液氮或-150 C左右的液氮氣相中保存的一種長期菌種保 藏方

3、法。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途2.6 真空冷凍干燥法freeze-drying |指將欲保藏的菌種細胞或孢子懸浮于保護劑中，經(jīng)預(yù)凍后在真空條件下使水分升華，再經(jīng)真空封存后保存的一種長 期菌種保存方法。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途3保藏準備工作3.1菌種待保藏的酵母菌菌種必須進行分離純化，得到純培養(yǎng)后再進行保藏。3.2 工具、材料接種針或接種環(huán)、吸管、鑷子、75%酒精棉球、酒精燈、試管架、量筒、燒杯、平皿、標簽、波美計等。3.3 器皿3.3.1 試管選用平口試管，規(guī)格一般為15X150mm。3.3.2 安瓿管制安瓿管的材料應(yīng)為中性玻璃，質(zhì)地軟硬度要適當。管的內(nèi)徑為8mm，長度不小于100mm。3.

4、3.3 冷凍管帶螺旋口的塑料冷凍管，其螺旋口分為外螺旋和內(nèi)螺旋兩種，規(guī)格為 1.8mL。3.4器皿的清洗菌種保藏工作所用的器皿要求清潔、透明、無破損、無裂痕。3.4.1 新玻璃器皿的清洗新玻璃器皿表面常含有游離的堿性物質(zhì)，可先用去污粉或洗衣粉洗刷，再用自來水洗凈。然后浸泡于1%2%的鹽酸溶液中數(shù)小時，再用自來水沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗23次，干燥后備用。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途3.4.2 使用過的玻璃器皿的清洗用過的玻璃器皿應(yīng)盡快洗滌。先用自來水洗至無污物，再用去污粉或洗衣粉刷洗干凈，用自來水沖干凈后再用蒸餾 水洗23次。洗凈的玻璃器皿，不應(yīng)在器壁上帶有水珠，否則表示尚未洗干凈，應(yīng)再按上述

5、方法重新洗滌。版權(quán)文檔， 請勿用做商業(yè)用途沾染微生物的試管，經(jīng)滅菌后倒出內(nèi)容物，將器皿放在熱水中，加適量洗衣粉洗滌，用自來水沖洗干凈，干燥后備 用。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途附著有油脂、石蠟等有機物質(zhì)的器皿，采用去污粉擦除、有機溶劑溶解或洗液浸泡等方法處理后，再按2）項洗滌。 版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途343 冷凍管的清洗檢查冷凍管是否滲漏。用0.05%的亞甲基藍水溶液在4C浸泡3045分鐘，沖洗干凈，棄去含有藍色染料的冷凍 管，其余的冷凍管備用。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途用蒸餾水將冷凍管漂洗干凈即可。3.5碘液的配制稱取碘（12）11g，碘化鉀（KI） 22g，用少量蒸餾水使碘溶解，然后定容

6、至 500mL，儲存于棕色瓶中，配制成原碘 液。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途吸取原碘液2.00mL，加碘化鉀20g用蒸餾水溶解并定容至500mL，儲存于棕色瓶中。3.6其它高壓滅菌鍋、烘箱、恒溫培養(yǎng)箱、水分測定儀、普通冰箱、-80 C冰箱、液氮罐、冷凍干燥設(shè)備、程控降溫儀、超凈工作臺或無菌室等。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途4保藏方法以下保藏方法除4.2不適合于分解石蠟的酵母菌菌種外，其它方法均適用于所有酵母菌菌種。4.1定期移植法參見附錄Ao4.2蒸餾水法參見附錄Bo4.3液體石蠟法參見附錄Co4.4 80 C冰箱凍結(jié)法參見附錄Do4.5液氮超低溫凍結(jié)法參見附錄E。4.6真空冷凍干燥法參見附錄Fo

7、附錄1定期移植法1斜面的制備酵母菌保藏一般用5oBe麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基或YEPD培養(yǎng)基，其它特殊培養(yǎng)基可另行配制。1.1 5oBe麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基稱取一定量的大麥芽粉，加入 4倍量溫度為60 C的清水，在55 C水浴鍋中保溫糖化46小時，并間歇性 攪拌。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途用玻璃棒蘸一滴糖化液于白色比色盤內(nèi)與碘液反應(yīng)，碘呈色反應(yīng)為無色時糖化完畢。用紗布過濾，將濾液煮沸，再用紗布或脫脂棉過濾，得到澄清的麥芽汁?；蛴谔腔褐屑尤脒m量蛋清（每500g大麥芽粉的糖化液加入一個雞蛋的蛋清），煮沸，過濾，也可得到清澈透明的麥芽汁。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途1.1.4 用波美計測量麥芽汁濃度（一般為 8

8、10oBe，加水稀釋成5oB e的麥芽汁，pH值自然。按1.5%2%比例加入瓊脂，煮沸使瓊脂溶解，補足所蒸發(fā)水分。1.1.6 將培養(yǎng)基趁熱分裝，每管分裝量約為試管高度的四分之一（45mL ）o分裝過程中，應(yīng)注意勿使培養(yǎng)基沾污管口，以免造成污染。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途分裝好的試管加棉塞或橡膠塞，外面包扎一層牛皮紙并注明培養(yǎng)基名稱及配制日期。1.1.8 121 C蒸汽滅菌1520分鐘。滅菌后及時擺放斜面，斜面長度不超過試管管長的二分之一為宜。版權(quán)文檔,請勿用做商業(yè)用途1.1.9 將斜面放入培養(yǎng)箱中，30 C培養(yǎng)13天。1.1.10 無菌落長出后將斜面保存于4C。空白斜面應(yīng)盡快使用。1.2 YE

9、PD培養(yǎng)基1.2.1 培養(yǎng)基組成酵母提取物10g蛋白胨10g葡萄糖20g自來水1000mL瓊脂1520gPH值自然1.2.2 配制過程1.2.3 在燒杯中放入約500mL水，按要求稱量各種藥品，依次放入燒杯中溶解，最后補足1000mL。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途1.2.4 按A1.1中5）10）所述制備空白斜面。2接種2.1打開超凈臺或無菌間的紫外燈滅菌 2030分鐘。2.2 關(guān)閉紫外燈，用75%酒精擦拭操作臺面進行消毒。2.3點燃酒精燈，用75%酒精擦手進行消毒。2.4 一只手夾住原菌種平板或試管及待轉(zhuǎn)接斜面試管 （斜面朝上），另一只手將棉塞從試管口拔出，操作應(yīng)在火焰無 菌區(qū)域進行。版權(quán)文檔

10、，請勿用做商業(yè)用途2.5在火焰上將接種針的金屬絲部分燒紅滅菌，然后將要伸入試管部分的針柄也反復通過火焰滅菌。2.6 將接種針水平通過火焰并插入原菌試管或平皿內(nèi)，先在管壁上或未長菌體的培養(yǎng)基表面冷卻，然后再用接種 針輕輕沾取少量菌體，將接種針自原菌種試管或平皿內(nèi)抽出，抽出時勿碰管壁，也勿通過火焰。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途2.7在火焰旁將沾有菌體的接種針迅速伸入待接空白斜面試管內(nèi)，自斜面底部向上劃一直線，使菌體沾附在斜面 培養(yǎng)基上。劃線時盡量不要劃破培養(yǎng)基表面。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途2.8接完種后將接種針由試管內(nèi)抽出，同時將試管口在火焰上灼燒一下，塞上棉塞。注意不要用試管口去迎棉塞， 以免試

11、管口在移動時造成污染。 版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途2.9接種針在放回原處前應(yīng)在火焰上徹底滅菌。放下接種針后，再用右手將棉塞進一步塞牢，避免脫落。最后將 已接種好的斜面試管放在試管架上。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途2.10 接種完畢后及時在試管上標明菌株編號和日期，也可在接種之前標明。3培養(yǎng)將接完種的斜面放入培養(yǎng)箱中，2830 C條件下進行培養(yǎng)3天。特殊菌種可在其最適條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定期。4保藏4.1培養(yǎng)好的斜面于46C保存，根據(jù)不同要求每36個月移植一次。對于某些菌種，如芽裂酵母，阿舒假囊 酵母，棉病囊霉等，必須13個月移植一次。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途4.2 保藏濕度用相對濕度表示，通常為 5

12、0%70%。4.3 微生物菌種保藏期間，要定期檢查菌種存放設(shè)施的溫度和濕度、菌株有無污染、棉塞有無霉變，如發(fā)現(xiàn)異常 應(yīng)重新移植培養(yǎng)后更換。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途4.4 每株菌種應(yīng)保藏相繼的三代培養(yǎng)物，以便對照，也可減少因意外和污染造成的損失。5 菌種的移植5.1將斜面培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到另一空白斜面上，在適宜條件下進行培養(yǎng)。5.2 微生物菌種移植過程，要對菌株編號及培養(yǎng)基分別進行核對，避免發(fā)生錯誤。5.3 微生物菌種移植培養(yǎng)后，應(yīng)與原保藏菌株的培養(yǎng)特征和菌株登記信息對照，檢查無誤后再存放。 附錄2蒸餾水法1蒸餾水試管的制備每支試管分裝5mL蒸餾水，加棉塞，121 C蒸汽滅菌30分鐘。也可選用帶螺旋

13、蓋的試管，滅菌時不要將蓋旋緊。 版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途2制備菌懸液2.1參照附錄A制備斜面培養(yǎng)物。2.2無菌條件下用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基上或純化后的平板培養(yǎng)基上取一環(huán)酵母細胞移入蒸餾水中，將細胞打散使 其均勻分散在蒸餾水中。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途2.3用無菌的橡膠塞代替棉塞塞緊，如用帶螺旋蓋的試管則將螺旋蓋旋緊。3保藏直立放置于46 C條件下貯藏。一般可保藏12年。4恢復培養(yǎng)移接或再培養(yǎng)時，無菌條件下用接種環(huán)蘸取保藏菌液移接在新鮮培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)。附錄3液體石蠟保法1液體石蠟預(yù)處理1.1選用優(yōu)質(zhì)化學純液體石蠟，將液體石蠟分裝到試管中加塞，用牛皮紙包好，采用以下兩種方式進行滅菌：121 C

14、濕熱滅菌30分鐘，置40 C恒溫箱中干燥或170 C烘箱中蒸發(fā)水分。160 C干熱滅菌2小時。1.2 將滅菌的液體石蠟冷卻至室溫備用。|2斜面培養(yǎng)物的制備參照附錄Ao3灌注石蠟將無菌的液體石蠟在無菌條件下注入培養(yǎng)好的新鮮斜面培養(yǎng)物上，液面高出斜面頂部1cm左右，使菌體與空氣隔絕。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途為避免加石蠟油時各菌株間的交叉污染，最好每株菌種用一管液體石蠟油。4保藏4.1注入液體石蠟的菌種斜面以直立狀態(tài)置低溫（46C）干燥處保藏，保藏時間12年。4.2保藏期間應(yīng)定期檢查，如培養(yǎng)基露出液面，應(yīng)及時補充無菌的液體石蠟。4.3保藏場所應(yīng)保持干燥，避免棉塞生霉。5 恢復培養(yǎng)在移接或再培養(yǎng)時，

15、挑取少量菌體移接在新鮮麥芽汁瓊脂或其它適宜培養(yǎng)基上，生長繁殖后，再重新轉(zhuǎn)接一次。附錄4 - 80 C冰箱凍結(jié)法1安瓿管或冷凍管的準備1.1將安瓿管或冷凍管按3.4步驟清洗干凈，晾干。1.2 激光打印標簽，標簽上標明菌株編號和保藏日期，大小約為10 X20mm，標簽在管內(nèi)的位置應(yīng)距離管底約10mm 左右，標簽上有字的一面面向管壁。也可直接將菌株編號和保藏日期直接噴碼在安瓿管或冷凍管表面，安瓿管表面的噴 碼要經(jīng)160 C固定20分鐘才能進行滅菌。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途1.3塞好棉塞或旋上蓋子，121 C蒸汽滅菌1520分鐘，60 C烘干備用。2保護劑的準備選用分析純甘油制備保護劑。用蒸餾水配制

16、10%的甘油溶液作為保護劑，每支試管分裝5mL,121C蒸汽滅菌15 20分鐘。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途3保藏培養(yǎng)物的準備3.1斜面培養(yǎng)物的制備參照附錄 A,要求培養(yǎng)至靜止期或成熟期。3.2 無菌條件下將滅過菌的10%甘油5mL用無菌吸管注入到培養(yǎng)好的斜面中， 用吸管刮取斜面上的菌體，注意不 要將培養(yǎng)基刮破。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途3.3 將菌體與保護劑混勻后用吸管注入到安瓿管或冷凍管內(nèi)，每支分裝約0.51mL，菌懸液中細胞濃度應(yīng)不低于106個/mL。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途4保藏將安瓿管或冷凍管直接置-80C冰箱中保藏，可保藏25年。5 恢復培養(yǎng)5.1從冰箱中取出安瓿管或冷凍管，立即置

17、于3840C水浴中復蘇并適當快速搖動，直到內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止。 安瓿管復蘇所用時間為4060秒，冷凍管復蘇所用時間為60120秒。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途5.2用70%酒精棉球?qū)碴彻芑蚶鋬龉懿潦酶蓛?，無菌條件下打開，將菌懸液轉(zhuǎn)移至麥芽汁或其它適宜培養(yǎng)基上， 2830 C或在其適宜溫度下培養(yǎng)。 版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途附錄5液氮超低溫凍結(jié)法1安瓿管或冷凍管的準備1.1 將1.8mL冷凍管洗凈，晾干。1.2 激光打印標簽，標簽上標明菌株編號和保藏日期，大小約為10 X20mm，標簽在管內(nèi)的位置應(yīng)距離管底約10mm左右，標簽上有字的一面面向管壁。也可直接將菌株編號和保藏日期直接噴碼在冷凍管表

18、面。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途1.3塞好棉塞或旋上蓋子，121 C蒸汽滅菌1520分鐘，60C烘干備用。2保護劑的準備選用分析純甘油制備保護劑。用蒸餾水配制10%的甘油溶液作為保護劑， 每支試管分裝5mL,121C蒸汽滅菌15 20分鐘。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途3保藏培養(yǎng)物的準備3.1斜面培養(yǎng)物的制備參照附錄 A,要求培養(yǎng)至靜止期或成熟期。3.2 無菌條件下將滅過菌的10%甘油5mL用無菌吸管注入到培養(yǎng)好的斜面中， 用吸管刮取斜面上的菌體，注意不 要將培養(yǎng)基刮破。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途3.3 將菌體與保護劑混勻后用吸管注入到冷凍管內(nèi)，每支分裝約1mL，菌懸液中細胞濃度應(yīng)不低于106 個/

19、mL。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途3.4將冷凍管蓋子旋緊后放入凍結(jié)器內(nèi)。4 預(yù)凍可采用以下兩種方式進行預(yù)凍：將控溫系統(tǒng)先預(yù)冷到4 C,再將盛有保藏物的冷凍管放入其中，以每分鐘1C的降溫速率使溫度降至-35 C。將冷凍管置20 C至40C冰箱中冷凍，12小時取出放入液氮罐中快速冷凍， 這樣冷凍速率大約每分鐘下降11.5 C。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途5保藏5.1立即將預(yù)凍后的冷凍管轉(zhuǎn)移至處于液氮中的儲存器中，置于液態(tài)氮的氣相或液相保藏。一般氣相中溫度為- 150C,液相中溫度為196C。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途5.2用此法可保藏酵母菌58年。6恢復培養(yǎng)6.1將冷凍管立即放置3840 C水浴中復蘇

20、并適當快速搖動，直到內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止，整個復蘇過程約需 50100秒。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途6.2用75%酒精棉擦拭冷凍管。6.3將冷凍管蓋子旋開，無菌條件下將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至麥芽汁或其它適宜培養(yǎng)基上，2830 C或適溫下培養(yǎng)。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途7 注意事項7.1操作時要注意安全，帶防護面罩和手套，防止凍傷。7.2冷凍管于液相中存放時一定要擰緊螺帽。7.3 運送液氮時要用專用特制的容器，絕不可用密閉容器存放或運輸液氮，切勿使用保溫瓶存放液氮。7.4注意存放液氮容器的室內(nèi)通風，防止過量氮氣使人窒息。7.5防止冷凍管破裂爆炸，如液氮滲入管內(nèi)，當從液氮容器取出時，液態(tài)氮體積膨脹約680倍

21、，爆炸力很大，要特別小心。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途7.6注意觀察液氮容器中液氮的殘存量，定期補充液氮。附錄6真空冷凍干燥法1安瓿管的準備1.1清洗選用中性玻璃材質(zhì)的安瓿管。先用 2%鹽酸浸泡810小時，自來水沖洗至pH值為中性，再用蒸餾水洗23次, 置烘箱中烘干備用。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途1.2 標簽激光打印機打印標簽，標簽上標明菌株編號和保藏日期，大小約為10X20mm，標簽可插入管內(nèi)或貼于管外，也可直接噴碼在安瓿管表面，位置應(yīng)距離管底約5mm左右，噴碼要經(jīng)160C固定20分鐘才能進行滅菌。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途1.3 滅菌塞好棉塞，將同一菌號的安瓿管包在一起，121 C滅菌30分

22、鐘，備用。2保護劑的準備2.1蒸餾水配制12%脫脂牛奶作為保護劑，每支試管分裝 25mL,加塞，再包一層牛皮紙捆好。2.2 滅菌鍋加熱至水沸騰，再將包好的試管放入滅菌鍋內(nèi)，113 C蒸汽滅菌20分鐘。2.3打開放氣閥緩慢排出蒸汽，氣壓降到 0時打開滅菌鍋，取出滅完菌的脫脂牛奶試管，迅速放入涼水中冷卻。 版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途2.4冷卻后的脫脂牛奶試管于30 C培養(yǎng)2天，經(jīng)無菌檢查合格后備用。3凍干樣品的制備3.1斜面培養(yǎng)物的制備參照附錄 A,要求培養(yǎng)至成熟期或穩(wěn)定期。3.2 無菌條件下將12%的脫脂牛奶用無菌吸管注入到培養(yǎng)好的斜面中，用吸管刮取斜面上的菌體，使菌體均勻地懸浮在保護劑內(nèi)，注意

23、勿將培養(yǎng)基刮破，也不可使菌懸液產(chǎn)生較多的氣泡，菌懸液中細胞濃度應(yīng)不低于106個/mL。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途3.3用長的無菌毛細滴管將菌懸液分裝到無菌的安瓿管內(nèi)，每支分裝0.10.2mL。操作時要把帶有菌懸液的長毛細滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途4 預(yù)凍從制備菌懸液開始，經(jīng)分裝到進行預(yù)凍之間的時間不宜超過1小時。可采用以下幾種方式預(yù)凍：分裝完成后將安瓿管立刻放入-35-40 C冰箱預(yù)凍1小時，使菌液完全凍結(jié)?？刹捎梅侄问筋A(yù)凍，先將分裝好的安瓿管置- 20C凍30分鐘，再放入-80C冰箱凍30分鐘。采用離心式凍干裝置時勿需預(yù)凍。5真空干燥5.1預(yù)凍后

24、將安瓿管放入真空箱中，開動真空泵進行干燥。采用無制冷設(shè)備的凍干裝置，在開動真空泵后應(yīng)使真空度在15分鐘內(nèi)達到66.5Pa，隨后逐漸達到26.613.3Pa，在此條件下，樣品將保持凍結(jié)狀態(tài)，其中水分則不斷升華，干燥才能順利地進行。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途采用離心式凍干裝置，在安瓿管放于離心架上后，先開動離心機，再開動真空泵。當樣品基本干燥后，真空度將達到 2.674Pa,此時如凍干裝置具有后干燥設(shè)備，則打開油擴泵，使樣品進一步干 燥12小時。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途使用具有溫度控制設(shè)備的凍干裝置，在凍干過程中當真空度達到26.6Pa時，樣品中水分大量升華，這時可以開始加溫，以便加速樣品中水分升華。版權(quán)文檔，請勿用做商業(yè)用途5.2終止干燥時間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷：安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀真空度接近空載時的最高值樣品溫度與管外溫度接近選用12支對照管，其水份與菌懸液同量，當其水分完全蒸發(fā)時視為干燥完結(jié)選用一個安瓿管，裝1%2%氯化鉆，如變深蘭色，可視